CN104140952B - 透明质酸酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸酶及其制备方法，该透明质酸酶包含对卵子进行处理的组合物、杀菌剂及指示剂。本发明的透明质酸酶各项指标达到体外培养液的标准使用安全且易于判断培养液是否变质，为辅助生殖技术提供有力保证。
Description
技术领域
本发明涉及人工辅助生殖技术，尤其涉及一种透明质酸酶及其制备方法。
背景技术
透明质酸酶对分离卵丘已广泛应用于试管婴儿技术中。透明质酸酶的目的是分离卵子周围的卵丘。透明质酸酶的用途：用于卵子显微注射之前的卵丘细胞与卵子的分离。
目前，我国辅助生殖技术中的透明质酸酶依赖进口成品，成本高且溶液的有效性的好坏不能很好的表现，如果在培养液变质后仍继续使用将对实验或临床操作造成不可逆转的结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种各项指标达到体外培养液的标准使用安全且易于判断培养液是否变质的透明质酸酶，为辅助生殖技术提供有力保证。
本发明的透明质酸酶，包含对卵子进行处理培养的组合物、杀菌剂及指示剂。
所述杀菌剂为庆大霉素，浓度9.5-10.5mg/L。
所述指示剂为酚红，浓度9.5-10.5mg/L。
所述组合物中包含氯化钠92.815-102.585mmol/L,氯化钾4.465-4.935mmol/L，硫酸镁0.19-0.21mmol/L，氯化钙1.9-2.1 mmol/L，碳酸氢钠3.8-4.2mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 19.95-22.05mmol/L，葡萄糖2.66-2.94mmol/L，丙酮酸钠0.314-0.347mmol/L、乳酸钠2.274-2.514g/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95-1.05mmol/L、牛磺酸0.095-0.105mmol/L，非必需氨基酸0.95%-1.05%（v/v）磷酸二氢钾0.352-0.389mmol/L,庆大霉素9.5-10.5 mg/L,酚红9.5-10.5mg/L,人血清白蛋白11.4%-12.6%（v/v），透明质酸酶247.57-273.63mg/L。
所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、 L-天冬酰胺、 L-天冬氨酸 、 L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、 L-丝氨酸中的一种或者几种。
透明质酸酶的溶剂采用超纯水。
本发明的透明质酸酶的pH=7.20-7.40，渗透压272-288mOsm/Kg。
本发明透明质酸酶的制备方法，包括下面步骤：
（1）透明质酸酶基础液的配制
a、先按照比例称量各组分，并分开放置；
b、先将称量好的组分（除杀菌剂、指示剂、碳酸氢钠）溶于超纯水中，溶解过程中遵循先固体后液体，NaHCO3最后加入的原则；
c、向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、指示剂和NaHCO3；
d、检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值，并记录最终渗透压和pH值；
（2）透明质酸酶原液的配制
a、在基础液中加入透明质酸酶，在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌，得到滤液A；
b、在滤液A中加入人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得到透明质酸酶的原液。
（3）透明质酸酶原液的处理
在无菌环境下对过滤后的溶液进行分装封口，得到市售的透明质酸酶，将其放置冰箱或冷库内保存。
（4）透明质酸酶进行检测
检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断透明质酸酶是否合格。
本发明的有益效果是，1、透明质酸酶中含有指示剂酚红，酚红在pH变化时颜色变化明显，pH在7.20-7.40范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值小于6.8时为黄色，当pH值大于8.4时为红色，变色比较明显,透明质酸酶的pH 7.20-7.40在此范围内溶液为粉红色到橙红色，当透明质酸酶颜色与此不符时，说明该透明质酸酶变质，不能用于实验或临床，从而避免了使用变质透明质酸酶而产生的风险。2、使用抗生素来抑制细菌的生长，如庆大霉素是一种广谱、热稳定性好的抗生素，在透明质酸酶中添加庆大霉素可以有效抑制细菌的生长。3、本发明透明质酸酶的原料均是已经证明其安全性的物质，在制备过程中其溶剂采用超纯水，超纯水的总有机碳（TOC）超低，避免了因杂质过多影响测定的结果。4、国内还没有成型的用于试管婴儿技术的培养液，此配方和制备方法为国内的试管婴儿技术提供了有力的保证，避免了国外产品因长途运输带来的不明因素，同时配制工艺操作简单合理，检测严密，能够提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的说明。
一、透明质酸酶配方及制备方法
表1透明质酸酶配方
本发明透明质酸酶的制备方法，包括下面步骤：
（1）透明质酸酶基础液的配制
a、先按照比例称量各组分，并分开放置；
b、先将称量好的组分（除杀菌剂、指示剂、碳酸氢钠）溶于超纯水中，溶解过程中遵循先固体后液体，NaHCO3最后加入的原则；
c、向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、指示剂和NaHCO3；
d、检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值，并记录最终渗透压和pH值；
（2）透明质酸酶原液的配制
a、在基础液中加入透明质酸酶，在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌，得到滤液A；
b、在滤液A中加入人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得到透明质酸酶的原液。
（3）透明质酸酶原液的处理
在无菌环境下对过滤后的溶液进行分装封口，得到市售的透明质酸酶，将其放置冰箱或冷库内保存。
（4）透明质酸酶进行检测
检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断透明质酸酶是否合格。
二、透明质酸酶检测方法及结果
（一）pH值检测
取一定量成品用pH计进行检测记录三次的值并取平均值为最终液体的pH值，在范围内为合格。
（二）渗透压
取10μL液体滴入渗透压仪（露点渗透压仪）探头的滤纸片上把探头推入仪器等待检测值稳定，读出数值，同样方法检测三遍取平均值即为该液体的渗透压，在范围内为合格。
（三）细胞毒性
按GB/T 16886.5的规定进行，细胞毒性计分应不超过1分。
（四）皮内刺激
按GB/T 16886.10的规定进行，无皮内刺激反应。
（五）致敏
按GB/T 16886.10的规定进行，应无致敏反应。
（六）无菌检测
采用中国药典的无菌检测的薄膜过滤法进行，过滤后的滤膜在细菌和真菌的培养基内培养应无菌生长为无菌合格。
（七）热原
按照中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅺ D规定方法，体外受精液应无热原。
（八）细菌内毒素检测
采用中国药典细菌内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行，判为定小于1.0EU/mL合格；
（九）体外鼠胚试验
1.超数排卵
选择6~8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10 IU/只；48 h后经腹腔注射hCG 10 IU/只，注射hCG当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。
2.准备培养皿
培养胚胎前在细胞培养皿中制备一定数量30～50 μL大小的液体微滴，表面覆盖培养用油，在CO2培养箱内预平衡4~18小时。
3 鼠胚采集
合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。
1-细胞胚胎收集：注射hCG后18至22小时后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎。将收集到的絮状卵子团放置到37 ℃提前预热好的供试品透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移、清洗后，挑选出正常形态的受精胚胎，转移到培养微滴M16中，用于1-细胞鼠胚检测试验。
4 体外培养
采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，置于已平衡的培养液中，于37 ℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。每组鼠胚数不少于50个。
5 试验结果
1-细胞胚胎体外分别培养96 小时后记录囊胚数量。
观察指标：囊胚形态观察。
可接受准则：
1）阳性对照组的囊胚形成率经统计学分析显著低于阴性对照组；
2）阴性对照组的囊胚形成率≥80 %。
（十四）检测结果
| 项目 | 配方1 | 配方2 | 配方3 |
| pH值 | 7.33 | 7.35 | 7.35 |
| 渗透压mOsm/Kg | 275 | 273 | 280 |
| 细胞毒性 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 皮内刺激 | 无皮内刺激 | 无皮内刺激 | 无皮内刺激 |
| 致敏 | 无致敏反应 | 无致敏反应 | 无致敏反应 |
| 热原 | 无热原 | 无热原 | 无热原 |
| 无菌检测 | 无菌 | 无菌 | 无菌 |
| 细菌内毒素检测 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 体外鼠胚试验 | 囊胚合格率81% | 囊胚合格率85% | 囊胚合格率82% |
Claims (2)
1.一种透明质酸酶组合物，其特征在于，所述组合物包含氯化钠92.815-102.585mmol/L，氯化钾4.465-4.935mmol/L，硫酸镁0.19-0.21mmol/L，氯化钙1.9-2.1mmol/L，碳酸氢钠3.8-4.2mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES19.95-22.05mmol/L，葡萄糖2.66-2.94mmol/L，丙酮酸钠0.314-0.347mmol/L、乳酸钠2.274-2.514g/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95-1.05mmol/L、牛磺酸0.095-0.105mmol/L，非必需氨基酸体积百分比0.95％-1.05％，磷酸二氢钾0.352-0.389mmol/L，庆大霉素9.5-10.5mg/L，酚红9.5-10.5mg/L，人血清白蛋白体积百分比11.4％-12.6％，透明质酸酶247.57-273.63mg/L，溶剂为超纯水。
2.根据权利要求1所述的透明质酸酶组合物，其特征在于，所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。
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