CN108949589A - 一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法，具体涉及微生物肥料中有效菌的检测方法。本发明具体步骤如下：将液体微生物菌肥样品制成基础稀释液，稀释后加至无菌培养皿内，在无菌条件下倒入50~60℃的培养基进行培养，倒置继续培养后进行菌落识别。本发明提供的检测方法适用于液体微生物肥料产品中有效菌的质量检测使用，还可以进一步了解到产品中有效菌与营养体的比例，使其在产品出厂时的检测结果更加符合产品在有效期内的实际有效菌数，有利于指导生产，保证产品质量，与现有的方法相比，本发明提供的检测方法简便，准确易行，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，尤其涉及一种液体微生物菌肥中有效菌的化学检测方法。
背景技术
现有技术中，对微生物肥料中活菌数的检测一直沿用农业部的检测标准。检测方法为：将菌剂制品通过稀释，将稀释到一定浓度的菌液接入预先制备好的平板检测培养基中，培养后，对培养基中的菌落数进行肉眼观察计数，从而计算得出产品的含菌数。为了保证检测的准确性，需根据肥料中所含菌种类，分别选择对应的培养基进行培养。在猪粪水为基础培养基的微生物液体菌肥中，各种微生物长期处于活跃状态，多种菌种互相竞争生存空间和营养物质，一些菌种的生长会受到抑制，这就使得其有效菌的含量检测结果常出现较大偏差。
目前常规的微生物肥料活菌数的检测主要针对粉末状态的微生物肥料或淀粉类微生物肥料，针对以猪粪水为培养基的液体微生物有效菌的检测方法，现有技术在检测方面存在一定的局限性。本发明提供的一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法，是在现有通用检测方法的基础上，根据液体微生物肥的生物学特点，而设计、应用的可以直接检测出样品中有效菌数目和其它营养细胞所形成菌落数量的检测方法。该方法通过在液体微生物肥中倒入10~20倍，50~60℃的培养基进行处理，可以迅速的激发菌肥中的菌种，形成菌落，对其中未能形成的菌体，使之提前死亡，避免了因为液体微生物菌肥中，活性高，以营养体形成菌落而计入活菌总数，干扰检测结果，使检测结果能够更加符合产品在有效使用期内的实际活菌数量。
鉴于上述分析，一种简单易行、检测准确率高、能有效针对以猪粪水为培养基的液体微生物菌肥检测方法是目前行业内急需的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法，以解决现有方法在液体微生物菌肥检测不准的问题。本发明目的是通过以下技术方案来实现的。
一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）制备母液菌悬液：按照微生物肥料行业标准NY 227-94的规定，无菌操作下取液体微生物菌肥5mL，加入到带玻璃珠的95mL的无菌水中，于微型漩涡混合仪上混匀2min，静置20min后在旋转式摇床上充分振荡，静置10min后再次在旋转式摇床上充分振荡，得母液菌悬液备用；
（2）菌肥稀释：使用无菌吸管吸取5mL母液菌悬液加入45mL无菌水中混匀，制成1:10稀释的菌悬液，随后依次稀释成1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106、1:1×107、1:1×108稀释度的菌悬液，分别取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀；菌悬液有效菌数0.01亿/mL~1亿/mL，选取1:1×106、1:1×107、1:1×108三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；菌悬液有效菌数0.0001亿/mL~0.01亿/mL，选取1:1×104、1:1×105、1:1×106三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；
（3）首次培养：将菌肥稀释液置于无菌培养皿中，在培养皿中加入培养基，随后置入恒温箱培养，待稀释液凝固后，将无菌培养皿倒置，继续培养；
（4）二次培养：首次培养结束后，取出培养皿，加入等体积菌肥稀释液的蒸馏水，再次倒入培养基，置入恒温箱中进行培养，待稀释液凝固后，倒置无菌培养皿，继续培养；
（5）菌落计算：取出培养皿观察可见菌落，并对菌落计数和计算，获得该样品中有效活菌数量。
进一步的，所述摇床振荡频率为300 r/min，震荡时间为15 min。
进一步的，所述液体微生物菌肥由如下方法制得：按重量份配比计，取100kg猪粪水、3kg蔗糖、2kg玉米粉混合均匀，分装于食用菌袋中进行灭菌，接种5kg液体菌种，置于26.5℃恒温培养发酵19天，即得液体微生物菌肥。
进一步的，所述培养基由如下方法制成：按重量份配比计，取10份蛋白胨、5份氯化钠、3份牛肉膏、1000份蒸馏水混合溶解后，调节pH至7.0~7.2，加入20份琼脂，加热溶化后分装，121℃灭菌30min。
进一步的，所述首次培养倒入的培养基为菌肥稀释液的10~20倍量，温度50~60℃。
进一步的，所述首次培养中恒温箱温度为20~30℃，培养时间40~50h；
进一步的，所述二次培养中恒温箱温度为20~30℃，培养时间40~50h。
进一步的，所述液体菌种由如下方法制得：以FJAT-90为菌种，接种于马铃薯葡萄糖为液体培养基上制成。
本发明具有的有益效果：
（1）本发明提供的检测方法适用于液体微生物肥料产品中有效菌的质量检测使用，还可以进一步了解到产品中有效菌与营养体的比例，使其在产品出厂时的检测结果更加符合产品在有效期内的实际有效菌数，有利于指导生产。
（2）本发明所提供的检测方法，能为企业液体菌肥产品提供更精确的检测数据，更加符合真实情况，更加有利于保证产品的质量。
（3）与现有的方法相比，本发明提供的检测方法简便，准确易行，适用于液体微生物肥料产品的商品检测，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法
（1）制备液体菌种：以FJAT-90为菌种，接种于马铃薯葡萄糖为液体培养基上，制成液体菌种；
（2）制备液体微生物菌肥：取100kg猪粪水、3kg蔗糖、2kg玉米粉混合均匀，分装于食用菌袋中进行灭菌，接种5kg液体菌种，置于26.5℃恒温培养发酵19天，即得液体微生物菌肥；
（3）制备培养基：取10kg蛋白胨、5kg氯化钠、3kg牛肉膏、1000kg蒸馏水混合溶解后，调节pH至7.1，加入20kg琼脂，加热溶化后分装，121℃灭菌30min；
（4）制备母液菌悬液：按照微生物肥料行业标准NY 227-94的规定，无菌操作下取液体微生物菌肥5mL，加入到带玻璃珠的95mL的无菌水中，于微型漩涡混合仪上混匀2min，静置20min后在旋转式摇床上充分振荡，静置10min后再次在旋转式摇床上充分振荡，振荡频率为300 r/min，震荡时间为15 min，得母液菌悬液备用；
（5）菌肥稀释：使用无菌吸管吸取5mL母液菌悬液加入45mL无菌水中混匀，制成1:10稀释的菌悬液，随后依次稀释成1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106、1:1×107、1:1×108稀释度的菌悬液，分别取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀；菌悬液有效菌数0.01亿/mL~1亿/mL，选取1:1×106、1:1×107、1:1×108三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；菌悬液有效菌数0.0001亿/mL~0.01亿/mL，选取1:1×104、1:1×105、1:1×106三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；
（6）首次培养：将菌肥稀释液置于无菌培养皿中，在培养皿中加入温度55℃、15倍量菌肥稀释液的培养基，随后置入恒温箱培养，恒温箱温度为25℃，培养时间45h，待稀释液凝固后，将无菌培养皿倒置，继续培养；
（7）二次培养：首次培养结束后，取出培养皿，加入等体积菌肥稀释液的蒸馏水，再次倒入培养基，置入恒温箱中进行培养，恒温箱温度为25℃，培养时间45h，待稀释液凝固后，倒置无菌培养皿，继续培养；
（8）菌落计算：取出培养皿观察可见菌落，并对菌落计数和计算，获得该样品中有效活菌数量。
实施例2
一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法
（1）制备液体菌种：以FJAT-90为菌种，接种于马铃薯葡萄糖为液体培养基上，制成液体菌种；
（2）制备液体微生物菌肥：取100kg猪粪水、3kg蔗糖、2kg玉米粉混合均匀，分装于食用菌袋中进行灭菌，接种5kg液体菌种，置于25℃恒温培养发酵20天，即得液体微生物菌肥；
（3）制备培养基：取10kg蛋白胨、5kg氯化钠、3kg牛肉膏、1000kg蒸馏水混合溶解后，调节pH至7.0，加入20kg琼脂，加热溶化后分装，121℃灭菌30min；
（4）制备母液菌悬液：按照微生物肥料行业标准NY 227-94的规定，无菌操作下取液体微生物菌肥5mL，加入到带玻璃珠的95mL的无菌水中，于微型漩涡混合仪上混匀2min，静置20min后在旋转式摇床上充分振荡，静置10min后再次在旋转式摇床上充分振荡，振荡频率为300r/min，震荡时间为15min，得母液菌悬液备用；
（5）菌肥稀释：使用无菌吸管吸取5mL母液菌悬液加入45mL无菌水中混匀，制成1:10稀释的菌悬液，随后依次稀释成1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106、1:1×107、1:1×108稀释度的菌悬液，分别取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀；菌悬液有效菌数0.01亿/mL~1亿/mL，选取1:1×106、1:1×107、1:1×108三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；菌悬液有效菌数0.0001亿/mL~0.01亿/mL，选取1:1×104、1:1×105、1:1×106三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；
（6）首次培养：将菌肥稀释液置于无菌培养皿中，在培养皿中加入温度50℃、10倍量菌肥稀释液的培养基，随后置入恒温箱培养，恒温箱温度为20℃，培养时间50h，待稀释液凝固后，将无菌培养皿倒置，继续培养；
（7）二次培养：首次培养结束后，取出培养皿，加入等体积菌肥稀释液的蒸馏水，再次倒入培养基，置入恒温箱中进行培养，恒温箱温度为20℃，培养时间50h，待稀释液凝固后，倒置无菌培养皿，继续培养；
（8）菌落计算：取出培养皿观察可见菌落，并对菌落计数和计算，获得该样品中有效活菌数量。
实施例3
一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法
（1）制备液体菌种：以FJAT-90为菌种，接种于马铃薯葡萄糖为液体培养基上，制成液体菌种；
（2）制备液体微生物菌肥：取100kg猪粪水、3kg蔗糖、2kg玉米粉混合均匀，分装于食用菌袋中进行灭菌，接种5kg液体菌种，置于28℃恒温培养发酵18天，即得液体微生物菌肥；
（2）制备培养基：取10kg蛋白胨、5kg氯化钠、3kg牛肉膏、1000kg蒸馏水混合溶解后，调节pH至7.2，加入20kg琼脂，加热溶化后分装，121℃灭菌30min；
（3）制备母液菌悬液：按照微生物肥料行业标准NY 227-94的规定，无菌操作下取液体微生物菌肥5mL，加入到带玻璃珠的95mL的无菌水中，于微型漩涡混合仪上混匀2min，静置20min后在旋转式摇床上充分振荡，静置10min后再次在旋转式摇床上充分振荡，振荡频率为300r/min，震荡时间为15min，得母液菌悬液备用；
（4）菌肥稀释：使用无菌吸管吸取5mL母液菌悬液加入45mL无菌水中混匀，制成1:10稀释的菌悬液，随后依次稀释成1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106、1:1×107、1:1×108稀释度的菌悬液，分别取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀；菌悬液有效菌数0.01亿/mL~1亿/mL，选取1:1×106、1:1×107、1:1×108三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；菌悬液有效菌数0.0001亿/mL~0.01亿/mL，选取1:1×104、1:1×105、1:1×106三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；
（5）首次培养：将菌肥稀释液置于无菌培养皿中，在培养皿中加入温度60℃、10倍量菌肥稀释液的培养基，随后置入恒温箱培养，恒温箱温度为30℃，培养时间40h，待稀释液凝固后，将无菌培养皿倒置，继续培养；
（6）二次培养：首次培养结束后，取出培养皿，加入等体积菌肥稀释液的蒸馏水，再次倒入培养基，置入恒温箱中进行培养，恒温箱温度为30℃，培养时间40h，待稀释液凝固后，倒置无菌培养皿，继续培养；
（7）菌落计算：取出培养皿观察可见菌落，并对菌落计数和计算，获得该样品中有效活菌数量。
对比例1
液体微生物菌肥制备方法同实施例1，只是检测方法按照农业部颁发的“微生物肥料行业标准NY-227-94”规定的常规方法进行。
试验例
将实施例1~3和对比例1中所得的菌落进行计数和计算，获得该样品中有效活菌数量，结果列于表1。
表1 液体微生物肥检测结果
。
由表1结果可看出：
1、由于采用以猪粪水作为基础培养基制备的液体生物菌肥种菌种较多，活性较高，其中不乏以营养体为基质生长的菌种，导致在产品出厂时采用常规检测方法，测得了较高数量的活性菌数。但是同一产品经室温保存2个月后，再采用常规方法检测，则由于产品中各种菌种互相竞争营养和生存空间，导致活菌数量大幅度下降。对比例1在2个月后的检测结果仅为出厂检测结果的85.07%，数量大幅度下降，结果表明：常规方法虽然可以相对准确地测出产品中的活菌总数，但对于液体活性菌剂的检测，则有很大的误差和局限性，不能真正反映出液体活性菌剂在有效期内的活菌数量。
2、采用本发明所检测的结果，由于在液体微生物肥中倒入10~20倍，50~60℃的培养基进行处理，可以迅速的激发菌肥中的菌种，形成菌落，对其中未能形成的菌体，使之提前死亡，避免了因为液体微生物菌肥中，活性高，以营养体形成菌落而计入活菌总数，干扰检测结果，实施例1~3中结果与产品保存2个月后的检测数据基本一致，表明该项方法测定的结果更符合实际情况，值得应用推广。
本发明未详细说明的内容均为现有技术，本领域技术人员可以从本实施例及现有技术获得启发，进行变形得到其它实施例。因此，本发明的保护范围应 该根据权利要求的保护范围来确定。
Claims (8)
1.一种液体微生物菌肥中有效菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）制备母液菌悬液：按照微生物肥料行业标准NY 227-94的规定，无菌操作下取液体微生物菌肥5mL，加入到带玻璃珠的95mL的无菌水中，于微型漩涡混合仪上混匀2min，静置20min后在旋转式摇床上充分振荡，静置10min后再次在旋转式摇床上充分振荡，得母液菌悬液备用；
（2）菌肥稀释：使用无菌吸管吸取5mL母液菌悬液加入45mL无菌水中混匀，制成1:10稀释的菌悬液，随后依次稀释成1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106、1:1×107、1:1×108稀释度的菌悬液，分别取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀；菌悬液有效菌数0.01亿/mL~1亿/mL，选取1:1×106、1:1×107、1:1×108三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；菌悬液有效菌数0.0001亿/mL~0.01亿/mL，选取1:1×104、1:1×105、1:1×106三个稀释度进行培养，每个稀释度做三平行，同时用无菌水做空白对照；（3）首次培养：将菌肥稀释液置于无菌培养皿中，在培养皿中加入培养基，随后置入恒温箱培养，待稀释液凝固后，将无菌培养皿倒置，继续培养；
（4）二次培养：首次培养结束后，取出培养皿，加入等体积菌肥稀释液的蒸馏水，再次倒入培养基，置入恒温箱中进行培养，待稀释液凝固后，倒置无菌培养皿，继续培养；
（5）菌落计算：取出培养皿观察可见菌落，并对菌落计数和计算，获得该样品中有效活菌数量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述摇床振荡频率为300 r/min，震荡时间为15 min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液体微生物菌肥由如下方法制得：按重量份配比计，取100kg猪粪水、3kg蔗糖、2kg玉米粉混合均匀，分装于食用菌袋中进行灭菌，接种5kg液体菌种，置于26.5℃恒温培养发酵19天，即得液体微生物菌肥。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养基由如下方法制成：按重量份配比计，取10份蛋白胨、5份氯化钠、3份牛肉膏、1000份蒸馏水混合溶解后，调节pH至7.0~7.2，加入20份琼脂，加热溶化后分装，121℃灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述首次培养倒入的培养基为菌肥稀释液的10~20倍量，温度50~60℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述首次培养中恒温箱温度为20~30℃，培养时间40~50h。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述二次培养中恒温箱温度为20~30℃，培养时间40~50h。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述液体菌种由如下方法制得：以FJAT-90为菌种，接种于马铃薯葡萄糖为液体培养基上制成。
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