CN104140948A - 卵子与胚胎处理液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵子与胚胎处理液及其制备方法，卵子与胚胎处理液，包含对卵子和受精卵进行处理培养的组合物、杀菌剂，可以选择性加入指示剂。本发明的卵子与胚胎处理液各项指标达到体外培养液的标准使用安全且易于判断培养液是否变质，为辅助生殖技术提供有力保证。
Description
技术领域
本发明涉及人工辅助生殖技术，尤其涉及一种卵子与胚胎处理液及其制备方法。
背景技术
卵子与胚胎处理液对囊胚的发育培养已广泛应用于试管婴儿技术中。卵子与胚胎处理液的目的是：一是提供卵子存活的营养物质；二是为胚胎的生存提供必要的环境。卵子与胚胎处理液的用途：用来在培养箱外处理和操作卵子和胚胎的液体。
目前，我国辅助生殖技术中的卵子与胚胎处理液依赖进口成品，成本高且溶液的有效性的好坏不能很好的表现，如果在培养液变质后仍继续使用将对实验或临床操作造成不可逆转的结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种各项指标达到体外培养液的标准使用安全，易于判断培养液是否变质的卵子与胚胎处理液，为辅助生殖技术提供有力保证。
本发明的卵子与胚胎处理液，包含对受精卵进行处理培养的组合物、杀菌剂。
所述杀菌剂为庆大霉素，浓度9.5-10.5mg/L。
所述组合物中包含氯化钠92.815-102.585mmol/L,氯化钾4.465-4.935mmol/L，硫酸镁0.19-0.21mmol/L，氯化钙1.9-2.1 mmol/L，碳酸氢钠3.8-4.2mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 19.95-22.05mmol/L，葡萄糖2.66-2.94mmol/L，丙酮酸钠0.314-0.347mmol/L，乳酸钠2.274-2.514g/L，丙氨酰谷氨酰胺0.95-1.05mmol/L，牛磺酸0.095-0.105mmol/L，磷酸二氢钾0.352-0.389mmol/L，庆大霉素9.5-10.5 mg/L。
卵子与胚胎处理液的溶剂采用超纯水。
所述处理液中还可以选择性加入指示剂酚红，浓度9.5-10.5mg/L。
本发明的卵子与胚胎处理液的pH=7.20-7.40，渗透压260-290mOsm/Kg。
本发明卵子与胚胎处理液的制备方法，包括下面步骤：
（1）卵子与胚胎处理液原液的配制
a、先按照比例称量各组分，并分开放置；
b、先将称量好的组分（除杀菌剂、选择性添加指示剂和碳酸氢钠）溶于超纯水中，溶解过程中遵循先固体后液体，NaHCO3最后加入的原则；
c、向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、选择性添加指示剂和NaHCO3；
d、检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值，并记录最终渗透压和pH值；
（2）卵子与胚胎处理液原液的处理
a、将卵子与胚胎处理液的原液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；
b、在无菌环境下对过滤后的卵子与胚胎处理液原液进行分装封口，得到卵子与胚胎处理液，将其放置冰箱或冷库内保存。
（3）卵子与胚胎处理液的检测
对卵子与胚胎处理液进行检测，检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断卵子与胚胎处理液是否合格。
本发明的有益效果是， 1、本发明卵子与胚胎处理液的原料均是已经证明其安全性的物质，在制备过程中其溶剂采用超纯水，超纯水的总有机碳（TOC）超低，避免了因杂质过多影响测定的结果。2使用抗生素来抑制细菌的生长，如庆大霉素是一种广谱、热稳定性好的抗生素，在卵子与胚胎处理液中添加庆大霉素可以有效抑制细菌的生长。3、、国内还没有成型的用于试管婴儿技术的培养液，此配方和制备方法为国内的试管婴儿技术提供了有力的保证，避免了国外产品因长途运输带来的不明因素，同时配制工艺操作简单合理，检测严密，能够提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。4、卵子与胚胎处理液中选择性添加指示剂酚红，酚红在pH变化时颜色变化明显，pH在7.20-7.40范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值小于6.8时为黄色，当pH值大于8.4时为红色，变色比较明显,卵子与胚胎处理液的pH 7.20-7.40在此范围内溶液为粉红色到橙红色，当卵子与胚胎处理液颜色与此不符时，说明该卵子与胚胎处理液变质，不能用于实验或临床，从而避免了使用变质卵子与胚胎处理液而产生的风险。卵子与胚胎处理液中如不含酚红，则溶液呈透明、清澈，在有效期内能保证无菌且正常使用，如变浑浊则不能使用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的说明。
一、卵子与胚胎处理液配方及制备方法
表1卵子与胚胎处理液的配方
本发明卵子与胚胎处理液的制备方法，包括下面步骤：
（1）卵子与胚胎处理液原液的配制
a、先按照比例称量各组分，并分开放置；
b、先将称量好的组分（除杀菌剂、选择性添加指示剂、碳酸氢钠）溶于超纯水中，溶解过程中遵循先固体后液体，NaHCO3最后加入的原则；
c、向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、选择性添加指示剂和NaHCO3；
d、检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值，并记录最终渗透压和pH值；
（2）卵子与胚胎处理液原液的处理
a、将卵子与胚胎处理液的原液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；
b、在无菌环境下对过滤后的卵子与胚胎处理液原液进行分装封口，得到卵子与胚胎处理液，将其放置冰箱或冷库内保存。
（3）卵子与胚胎处理液的检测
对卵子与胚胎处理液进行检测，检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断卵子与胚胎处理液是否合格。
二、卵子与胚胎处理液检测方法及结果
（一）pH值检测
取一定量成品用pH计进行检测记录三次的值并取平均值为最终液体的pH值，在范围内为合格。
（二）渗透压
取10μL液体滴入渗透压仪（露点渗透压仪）探头的滤纸片上把探头推入仪器等待检测值稳定，读出数值，同样方法检测三遍取平均值即为该液体的渗透压，在范围内为合格。
（三）细胞毒性
按GB/T 16886.5的规定进行，细胞毒性计分应不超过1分。
（四）皮内刺激
按GB/T 16886.10的规定进行，无皮内刺激反应。
（五）致敏
按GB/T 16886.10的规定进行，应无致敏反应。
（六）无菌检测
采用中国药典的无菌检测的薄膜过滤法进行，过滤后的滤膜在细菌和真菌的培养基内培养应无菌生长为无菌合格。
（七）热原
按照中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅺ D规定方法，体外受精液应无热原。
（八）细菌内毒素检测
采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行，判为定小于1.0EU/mL合格；
（九）体外鼠胚试验
1.超数排卵
选择6~8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10 IU/只；48 h后经腹腔注射hCG 10 IU/只，注射hCG当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。
2.准备培养皿
培养胚胎前在细胞培养皿中制备一定数量30～50 μL大小的液体微滴，表面覆盖培养用油，在CO2培养箱内预平衡4~18小时。
3 鼠胚采集
合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。
1-细胞胚胎收集：注射hCG后18至22小时后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎。将收集到的絮状受精卵团放置到37 ℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移到供试品卵子与胚胎处理液中20分钟，然后挑选出正常形态的受精胚胎，转移到培养微滴M16中，用于1-细胞鼠胚检测试验。
4 体外培养
采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，置于已平衡的培养液中，于37 ℃，5% CO2 ，饱和湿度的培养箱中培养。每组鼠胚数不少于50个。
5 试验结果
1-细胞胚胎体外分别培养96 小时后记录囊胚数量。
观察指标：囊胚形态观察。
可接受准则：
1）阳性对照组的囊胚形成率经统计学分析显著低于阴性对照组；
2）阴性对照组的囊胚形成率≥80 %。
（十）检测结果
| 项目 | 配方1 | 配方2 | 配方3 | 配方4 |
| pH值 | 7.2 | 7.3 | 7.3 | 7.2 |
| 渗透压mOsm/Kg | 269 | 275 | 280 | 270 |
| 细胞毒性 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 皮内刺激 | 无皮内刺激 | 无皮内刺激 | 无皮内刺激 | 无皮内刺激 |
| 致敏 | 无致敏反应 | 无致敏反应 | 无致敏反应 | 无致敏反应 |
| 热原 | 无热原 | 无热原 | 无热原 | 无热原 |
| 无菌检测 | 无菌 | 无菌 | 无菌 | 无菌 |
| 细菌内毒素检测 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 体外鼠胚试验 | 囊胚合格率82% | 囊胚合格率86% | 囊胚合格率81% | 囊胚合格率80% |
Claims (6)
1.卵子与胚胎处理液，其特征在于：包含对受精卵进行处理培养的组合物、杀菌剂。
2.根据权利要求1所述卵子与胚胎处理液，其特征在于：杀菌剂为庆大霉素，浓度9.5-10.5mg/L。
3.根据权利要求1所述卵子与胚胎处理液，其特征在于：所述组合物中包含氯化钠92.815-102.585mmol/L,氯化钾4.465-4.935mmol/L，硫酸镁0.19-0.21mmol/L，氯化钙1.9-2.1 mmol/L，碳酸氢钠3.8-4.2mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 19.95-22.05mmol/L，葡萄糖2.66-2.94mmol/L，丙酮酸钠0.314-0.347mmol/L，乳酸钠2.274-2.514g/L，丙氨酰谷氨酰胺0.95-1.05mmol/L，牛磺酸0.095-0.105mmol/L，磷酸二氢钾0.352-0.389mmol/L，庆大霉素9.5-10.5 mg/L。
4.根据权利要求1所述卵子与胚胎处理液，其特征在于：卵子与胚胎处理液的溶剂采用超纯水。
5.根据权利要求1-4任一项所述卵子与胚胎处理液，其特征在于：所述处理液中选择性加入指示剂酚红，浓度9.5-10.5mg/L。
6.制备权利要求1-5项所述的卵子与胚胎处理液的制备方法，包括下面步骤：
（1）卵子与胚胎处理液原液的配制
a、先按照比例称量各组分，并分开放置；
b、先将称量好的除杀菌剂、选择性添加指示剂和碳酸氢钠之外的组分溶于超纯水中；
c、向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、选择性添加指示剂和NaHCO3；
d、检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值，并记录最终渗透压和pH值；
（2）卵子与胚胎处理液原液的处理
a、将卵子与胚胎处理液的原液在超净工作台下利用0.2μm的滤膜过滤除菌；
b、在无菌环境下对过滤后的卵子与胚胎处理液原液进行分装封口，得到卵子与胚胎处理液，将其放置冰箱或冷库内保存；
（3）卵子与胚胎处理液的检测
对卵子与胚胎处理液进行检测，检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断卵子与胚胎处理液是否合格。
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