CN108559724A - 一种配子缓冲液及其缓冲体系 - Google Patents
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Abstract
本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种配子缓冲液。本发明的配子缓冲液采用MOPS、HEPES混合的缓冲体系，相较于普通的仅使用MOPS或HEPES缓冲体系的配子缓冲液，能控制pH在更窄的范围内，且减少MOPS或HEPES组分的浓度又能减小细胞毒性。因此，本发明的配子缓冲液能够在配子采集和准备时提供更稳定的pH值，减小环境的波动，从而保持配子的活力。使用该配子缓冲液洗涤的配子，在后期胚胎实验中囊胚成型率大大提高，且形态均匀。
Description
技术领域
本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种配子缓冲液的缓冲体系及由其制备的配子缓冲液。
背景技术
配子是指生物进行有性生殖时由生殖系统所产生的成熟性细胞，简称生殖细胞。配子分为雄配子(male gamete)和雌配子(female gamete),动物和植物的雌配子通常称为卵细胞(ova,或egg),而将雄配子称为精子(sperm)。
配子缓冲液是一种含抗菌素、基础离子以及各种丰富能量物质的缓冲液，在培养箱外用于卵细胞和精子的洗涤，为IVF(体外受精)做准备。
自IVF领域诞生以来，科学家们一直在努力研究健康的胚胎植入，这是生殖学研究的中心目标。配子采集和准备可能是体外受精中最紧张的一步。环境的剧烈波动会严重削弱配子的活力，从而对胚胎的质量和生存能力造成毁灭性的影响。IVF中随后的操作过程是否成功则取决于卵母细胞内稳态能否得以维持。配子缓冲液可以维持卵母细胞的新陈代谢，减轻应激效应对配子的影响，从而为受精做好准备。
目前，传统的配子缓冲液中多采用MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、或碳酸氢钠-二氧化碳缓冲对。虽然MOPS和HEPES被广泛用于辅助生殖领域，但往往忽视了温度对两者pKa值的影响，以及MOPS受光照的影响。因此，缓冲对对配子和胚胎质量的潜在危害，促使我们重新评估目前用于临床体外受精的pH缓冲系统。
因此开发一种pH更为稳定的配子缓冲液缓冲体系，以及应用该体系制备的配子缓冲液。本发明的配子缓冲液减小pH对配子活力的影响，使用该配子缓冲液洗涤的配子，在后期胚胎实验中囊胚成型率大大提高，且形态均匀。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种配子缓冲液的缓冲体系，其能提供更稳定的pH环境，从而降低环境对配子活力的伤害。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种配子缓冲液的缓冲体系，其同时包含MOPS和HEPES。
MOPS和HEPES均为以胺基磺酸为基础的两性离子，作为两性电解质，能够提供较为稳定的pH梯度。传统的配子缓冲液中多采用MOPS、HEPES、或碳酸氢钠-二氧化碳缓冲对。
本发明人员发现MOPS和HEPES结合使用，能控制pH在更窄的范围内，同等浓度下比单一的缓冲对有更强的缓冲能力。因此使用MOPS和HEPES缓冲体系，能够减小配子的应激效应，为后续的IVF做好准备。
同时，同等浓度的MOPS和HEPES缓冲体系与单一缓冲对相比，减小了缓冲对对细胞毒性，更有利于配子保持活力。
作为优选的方案，上述缓冲体系中MOPS、HEPES浓度均为8-12mmol/L。
作为优选的方案，上述缓冲体系pH值为7.25-7.35。
本发明的目的之二在于提供一种目的一的缓冲体系制备的配子缓冲液，其pH更稳定，减小配子的应激效应。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
采用目的一的缓冲体系，添加配子所需的营养及能量物质，配制成配子缓冲液。
作为优选的方案，上述配子缓冲液包含钠、钾、钙、镁离子，并以葡萄糖、丙酮酸钠、白蛋白为能量物质。
作为优选的方案，上述缓冲体系中MOPS、HEPES浓度均为8-12mmol/L。
作为优选的方案，上述配子缓冲液的pH值为7.25-7.35。
本发明的目的之三在于提供一种配子缓冲液，其采用目的一的缓冲体系，能减小配子的应激效应。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种配子缓冲液，溶剂为水，包含MOPS和HEPES缓冲体系；还包含钠、钾、钙、镁离子，以及葡萄糖、丙酮酸钠、白蛋白和人体非必需氨基酸。
作为优选的方案，上述配子缓冲液成分为：90.24-110.18mmol/L氯化钠，0.43-0.52mmol/L氯化镁，4.267-5.013mmol/L氯化钾，0.1522-0.2567mmol/L硫酸镁，0.13-0.30mmol/L泛酸钙，0.3513-0.3958mmol/L磷酸钾，21.0-21.6mmol/L乳酸钙，8-12mmol/LHEPES，8-12mmol/LMOPS，3.85-4.30mmol/L碳酸氢钠，0.3129-0.3501mmol/L丙酮酸钠，2.5-3mmol/L葡萄糖，0.95-1.06mmol/L丙氨酰谷氨酰胺，0.09-0.10mmol/L L-牛磺酸，5-10ug/mL硫酸庆大霉素，5mg/mL人血清白蛋白以及0.5mmol/L-1.5mmol/L人体非必需氨基酸。
其中使用的硫酸镁为硫酸镁七水合物。
作为优选的方案，上述人体非必需氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸。
作为优选的方案，上述配子缓冲液的pH值为7.25-7.35。
本发明的配子缓冲液的pH值与常规配子缓冲液相比，pH值控制在更窄的范围内。同时也意味着使用时配子能够更好的维持稳态，减轻配子活力的损失，从而为体外受精做好准备。
作为优选的方案，上述配子缓冲液的渗透压285-295mOsm/kg。
作为优选的方案，上述配子缓冲液的内毒素含量＜0.25EU/mL。
本发明的配子缓冲液与常规配子缓冲液相比较，其内毒素含量更低，即减小了使用时对配子的毒性。
本发明的配子缓冲液pH值范围更窄、更稳定，毒性更小，因此用其处理的配子在体外受精后胚胎囊胚形成率较单一缓冲对大大提高，胚胎形态也更为饱满。
本发明的有益效果在于：本发明提供的配子缓冲液缓冲体系以及应用该体系制备的配子缓冲液，与常规的缓冲体系相比，pH更为稳定，本发明的配子缓冲液的内毒素也比常规缓冲液中含量更低。因此通过此配方配制的缓冲液有以下优势：
1.pH更稳定，减小pH变化对配子活力的影响，有利于胚胎形成及发育；
2.胚胎囊胚形成率较单一缓冲对大大提高，胚胎形态也更为饱满均匀。
附图说明
图1为20mmol/L MOPS-培养基的pH变化图。
图2为20mmol/L HEPES-培养基的pH变化图。
图3为20mmol/L NaHCO3-培养基的pH变化图。
图4为10mmol/L HEPES+10mmol/L MOPS-培养基的pH变化图。
图5为10mmol/L HEPES+10mmol/L MOPS缓冲液与10mmol MOPS与10mmol HEPES缓冲液的缓冲能力。
图6为10mmol/L HEPES+10mmol/L MOPS缓冲液与20mmol MOPS与20mmol HEPES缓冲液的缓冲能力。
具体实施方式
以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1温度对缓冲对pH的影响
1.温度对MOPS和HEPES的pKa值影响
表1 MOPS、HEPES缓冲对的pKa值
由上表可见，温度对各缓冲对的pKa值影响比较明显。
2.含MOPS、HEPES、NaHCO3、MOPS+HEPES混合缓冲液的培养基pH变化
从实验室培养箱里分别取出500uL含各种缓冲液的培养基置于室温，在10min内每分钟读取温度与pH值，结果见图1、图2和图3和图4。
由上图可知，实际操作中两性缓冲液MOPS和HEPES能提供更稳定的pH值，但各缓冲对的缓冲能力不同。MOPS和HEPES混合后的缓冲体系较MOPS或HEPES更稳定，随着温度变化pH变化较小，意味着MOPS和HEPES混合缓冲体系能提供更为稳定的pH环境。
实施例2缓冲对的缓冲能力比较
通过滴定法对不同浓度的MOPS、HEPES和MOPS+HEPES缓冲液的缓冲能力进行比较。实验如下：
分别用0.1mol/LNaOH和0.1mol/L HCl用于滴定25mL含各种缓冲液的培养基。实验结果如图5、6。其中图5采用的是以1:1混合后的10mmol/L HEPES+10mmol/L MOPS缓冲液与10mmol MOPS与10mmol HEPES缓冲液缓冲能力比较；图6采用的是以1:1混合后的10mmol/LHEPES+10mmol/LMOPS缓冲液与20mmol MOPS与20mmol HEPES缓冲液缓冲能力比较。
图5表明两种两性缓冲液混合后缓冲能力增强，图6表明以1:1混合后的10mmol/LHEPES+10mmol/L MOPS缓冲能力与20mmol MOPS与20mmol HEPES缓冲液缓冲能力相当，且组合的两性缓冲液较单独的两性缓冲液能控制pH在更窄的范围内，且减少各组分的浓度又能减小细胞毒性，因此，我们采用了以MOPS+HEPES混合的缓冲体系。
实施例3配子缓冲液1的配制
以超纯水为溶剂，配方如下：
90.24mmol/L氯化钠，0.43mmol/L氯化镁5.013mmol/L氯化钾，0.2567mmol/L硫酸镁(七水合物)，0.30mmol/L泛酸钙，0.3513mmol/L磷酸钾，21.0mmol/L乳酸钙，10mmol/LHEPES(游离酸)，10mmol/L MOPS，4.30mmol/L碳酸氢钠，0.3129mmol/L丙酮酸钠，3mmol/L葡萄糖，1.06mmol/L丙氨酰谷氨酰胺，0.10mmol/L L-牛磺酸，5ug/mL硫酸庆大霉素，5mg/mL人血清白蛋白以及0.5mmol/L人体非必需氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺.H2O、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸)。
调节pH7.25-7.35,调节渗透压285-295mOsm/kg。
实施例4配子缓冲液2的配制
以超纯水为溶剂，配方如下：
110.18mmol/L氯化钠，0.52mmol/L氯化镁4.267mmol/L氯化钾，0.1522mmol/L硫酸镁(七水合物)，0.20mmol/L泛酸钙，0.3958mmol/L磷酸钾，21.6mmol/L乳酸钙，12mmol/LHEPES(游离酸)，12mmol/L MOPS，3.85mmol/L碳酸氢钠，0.331mmol/L丙酮酸钠，2.8mmol/L葡萄糖，1.0mmol/L丙氨酰谷氨酰胺，0.10mmol/L L-牛磺酸，10ug/mL硫酸庆大霉素，5mg/mL人血清白蛋白以及1.0mmol/L人体非必需氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺.H2O、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸)。
调节pH7.25-7.35,调节渗透压285-295mOsm/kg。
实施例5配子缓冲液3的配制
以超纯水为溶剂，配方如下：
105mmol/L氯化钠，0.5mmol/L氯化镁4.6mmol/L氯化钾，0.22mmol/L硫酸镁(七水合物)，0.13mmol/L泛酸钙，0.37mmol/L磷酸钾，21.6mmol/L乳酸钙，12mmol/L HEPES(游离酸)，10mmol/L MOPS，4.20mmol/L碳酸氢钠，0.3501mmol/L丙酮酸钠，2.5mmol/L葡萄糖，1.06mmol/L丙氨酰谷氨酰胺，0.09mmol/L L-牛磺酸，8ug/mL硫酸庆大霉素，5mg/mL人血清白蛋白以及1.5mmol/L人体非必需氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺.H2O、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸)。
调节pH7.25-7.35,调节渗透压285-295mOsm/kg。
实施例6配子缓冲液4的配制
以超纯水为溶剂，配方如下：
95mmol/L氯化钠，0.48氯化镁4.60mmol/L氯化钾，0.190mmol/L硫酸镁(七水合物)，0.25mmol/L泛酸钙，0.37mmol/L磷酸钾，21.6mmol/L乳酸钙，8mmol/L HEPES(游离酸)，12mmol/L MOPS，4.30mmol/L碳酸氢钠，0.33mmol/L丙酮酸钠，3mmol/L葡萄糖，1.06mmol/L丙氨酰谷氨酰胺，0.09mmol/L L-牛磺酸，10ug/mL硫酸庆大霉素，5mg/mL人血清白蛋白以及1.0mmol/L人体非必需氨基酸(甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺.H2O、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸)。
调节pH7.25-7.35,调节渗透压285-295mOsm/kg。
实施例7配子缓冲液的对比检测
经过试验，本发明实施例3-6配得的配子缓冲液能将产品各参数控制在以下范围内：
表2本发明配子缓冲液参数
| pH: | 7.25-7.35 |
| 渗透压 | 275-285 mOsM |
| 内毒素 | ＜0.25EU/mL |
| 囊胚形成率 | ≥85％ |
将本发明的配子缓冲液与cook,Vitrolife、Global公司产品比较，结果见表3：
表3各配子缓冲液的参数比较
| 公司名称 | 产品名称 | pH | 内毒素(EU/mL) | 囊胚形成率％ |
| cook | Sydney IVF Gamete Buffer | 7.3-7.5 | ＜0.4 | ≥80 |
| Vitrolife | G-GAMETETM | 7.2-7.4 | ＜0.25 | ≥80 |
| Global | Globalw/HEPES | 7.2-7.4 | ≤0.5 | ≥80 |
| 本发明 | 配子缓冲液 | 7.25-7.35 | ＜0.25 | ≥85％ |
通过比较本发明提供的配子缓冲液，相比cook等公司，将pH控制在了更窄的范围内，内毒素含量也更低，囊胚形成率显著提高。
综上，本发明提供了一种pH更为稳定的配子缓冲液缓冲体系，以及应用该体系制备的配子缓冲液。并经试验证明本发明的配子缓冲体系较单个缓冲对pH更稳定，以及配子缓冲液的pH范围更窄，洗涤的配子用于体外受精提高了囊胚形成率。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种配子缓冲液的缓冲体系，其特征在于，所述缓冲体系同时包含MOPS和HEPES。
2.根据权利要求1所述的缓冲体系，其特征在于，所述MOPS、HEPES浓度分别为8-12mmol/L、8-12mmol/L。
3.权利要求1所述的缓冲体系用于制备的配子缓冲液。
4.根据权利要求3所述的配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液pH值为7.25-7.35。
5.一种配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液以水为溶剂，包含MOPS和HEPES缓冲体系；还包含钠、钾、钙、镁离子，以及葡萄糖、丙酮酸钠、白蛋白和人体非必需氨基酸。
6.根据权利要求5所述的配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液成分包含：90.24-110.18mmol/L氯化钠，0.43-0.52mmol/L氯化镁，4.267-5.013mmol/L氯化钾，0.1522-0.2567mmol/L硫酸镁，0.13-0.30mmol/L泛酸钙，0.3513-0.3958mmol/L磷酸钾，21.0-21.6mmol/L乳酸钙，8-12mmol/L HEPES，8-12mmol/LMOPS，3.85-4.30mmol/L碳酸氢钠，0.3129-0.3501mmol/L丙酮酸钠，2.5-3mmol/L葡萄糖，0.95-1.06mmol/L丙氨酰谷氨酰胺，0.09-0.10mmol/L L-牛磺酸，5-10ug/mL硫酸庆大霉素，5mg/mL人血清白蛋白以及0.5mmol/L-1.5mmol/L人体非必需氨基酸。
7.根据权利要求6所述的配子缓冲液，其特征在于，所述人体非必需氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸。
8.根据权利要求6所述的配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液pH值为7.25-7.35。
9.根据权利要求5所述的配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液的渗透压285-295mOsm/kg。
10.根据权利要求5所述的配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液的内毒素含量＜0.25EU/mL。
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