CN111172099B - 配子缓冲液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种配子缓冲液及其制备方法。所述配子缓冲液包括基本缓冲液和添加物；以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：褪黑素0.01～100nmol/L；辅酶Q10 0.5～2.0mg/L；所述基本缓冲液包括MOPS缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰‑谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸。本发明的配子缓冲液可以发挥良好的清除自由基、保护配子细胞的作用，还可以促进配子细胞的有丝分裂和细胞发育。

Description

配子缓冲液及其制备方法
技术领域
本发明涉及辅助生殖领域，特别是涉及一种配子缓冲液及其制备方法。
背景技术
辅助生殖技术是人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)的简称，指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精(ArtificialInsemination，AI)和体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and EmbryoTransfer，IVF-ET)及其衍生技术两大类。其中体外受精-胚胎移植(IVF-ET)，是指将患者双方的配子取出后，在体外进行受精，再将受精卵或者胚胎移植回母体子宫内发育成胎儿，上面所述的配子即为人及哺乳动物进行有性生殖时由生殖系统所产生的成熟性细胞，简称生殖细胞。配子分为雄配子(male gamete)和雌配子(female gamete)，雌配子通常称为卵细胞(ova或egg)，而将雄配子称为精子(sperm)。
配子的采集和准备是辅助生殖中涉及体外操作很重要的一环，体外操作环境的变化和波动会严重影响配子的活力，进而影响到后续的受精卵及胚胎的发育质量。因此体外操作中的配子缓冲液极为重要。配子缓冲液可以维持配子细胞的新陈代谢，减轻应激效应对配子的影响，从而为受精做好准备。
在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，卵母细胞的质量是获得良好子代胚胎的关键，线粒体是决定卵母细胞质量的核心因素之一。线粒体的数量、分布及mtDNA拷贝数对于卵母细胞的发育成熟、受精后的胚胎发育潜能都起到决定性作用。线粒体是人体细胞中制造能量的细胞器，它在利用氧分子的同时也不断受到外界氧毒性的伤害，线粒体产生能量供卵母细胞分裂时染色体均等分离，同时会释放大量的自由基，当线粒体损伤超过一定限度，细胞就会衰老死亡。
目前，配子缓冲液主要是一种含有抗菌素、基础离子以及各种丰富能量物质的缓冲液，其多采用添加MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)或碳酸氢钠-二氧化碳缓冲对，以上缓冲液主要是为配子提供合适的体外操作的环境及pH值，从而减少体外操作环境的变化和波动对配子活力的影响。但是，上述方法对于提高配子的质量以及提高IVF-ET的成功率所起的作用十分有限，仍然需要进一步探索其他可以高效提高配子的质量的配子缓冲液。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种配子缓冲液，其可以发挥良好的清除自由基、保护配子细胞的作用，还可以促进配子细胞的有丝分裂和细胞发育。
具体技术方案如下：
一种配子缓冲液，所述配子缓冲液包括基本缓冲液和添加物；以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.01～100nmol/L；
辅酶Q10 0.5～2.0mg/L；
所述基本缓冲液包括MOPS缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸；
所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为0.1～6：1～22：0.01～1.1：0.07～4.2：0.1～2.2：0.01～0.6：0.001～0.05。
本发明的另一目的是提供一种上述的配子缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
将褪黑素、辅酶Q10和基本缓冲液中的溶质添加到水中，过滤除菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人经过大量的实验研究发现，将褪黑素和辅酶Q10两者添加入本发明所述的基本缓冲液中，可以发挥良好的清除自由基、保护配子细胞免受活性氧刺激的作用，还可以促进配子细胞的有丝分裂和细胞发育，提高精卵受精率。
同时，本发明的配子缓冲液还能提供稳定的pH环境，从而可以降低pH波动对配子细胞活力的影响。
附图说明
图1为小鼠促排卵后，手术获取的小鼠的卵冠丘复合物。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施方式提供一种配子缓冲液，所述配子缓冲液包括基本缓冲液和添加物；以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.01～100nmol/L；
辅酶Q10 0.5～2.0mg/L；
所述基本缓冲液包括MOPS缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸；
所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为0.1～6：1～22：0.01～1.1：0.07～4.2：0.1～2.2：0.01～0.6：0.001～0.05。
其中，所述基本缓冲液的溶剂为水，优选为超纯水。
在其中一些实施例中，所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸在基本缓冲液中的总摩尔浓度为100-300mmol/L。
进一步地，所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸在基本缓冲液中的总摩尔浓度优选为130～180mmol/L。
优选地，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.1～10nmol/L；
辅酶Q10 0.5～1.5mg/L。
优选地，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.5～2nmol/L；
辅酶Q10 0.8～1.3mg/L。
优选地，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.5～1.3nmol/L；
辅酶Q10 0.8～1.3mg/L。
优选地，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.9～1.1nmol/L；
辅酶Q10 0.8～1.3mg/L。
优选地，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 1nmol/L；
辅酶Q10 1mg/L。
在其中一些实施例中，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述基本缓冲液中还包括：
人血清白蛋白 1～10g/L；和/或，
杀菌剂 20～100mg/L。
其中，所述杀菌剂可以有效抑制和杀灭培养过程中产生的有害微生物。
优选地，述杀菌剂为青霉素、链霉素、庆大霉素的中的至少一种。优选地，所述杀菌剂为庆大霉素。
优选地，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述杀菌剂的添加量为40～60mg/L；所述人血清白蛋白的添加量为4.5～5.5g/L。
优选地，所述杀菌剂的添加量为50mg/L；所述人血清白蛋白的添加量为5g/L。
在其中一些实施例中，所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸、四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为0.4～0.7：9～11：0.3～0.4：0.63～1.05：0.8～1.2：0.08～0.12：0.008～0.012。通过对基本缓冲液中的组分含量进行进一步优选，可以进一步提高培养效果，且为配子缓冲液提供更稳定的pH环境。
在其中一些实施例中，所述MOPS缓冲液包括以下组分：MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙；
优选地，所述MOPS、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙的摩尔比为16～24：80～110：3.5～8：0.4～0.6：0.05～1.2：0.2～3.2：10～35：0.5～3；
进一步优选地，所述MOPS、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙的摩尔比为19～21：85～95：5～6：0.44～0.53：0.2～0.4：0.8～1.2：20～30：1.5～2。
在其中一些实施例中，MOPS缓冲液中溶质的总摩尔浓度为110.65～185mmol/L，优选为131.94～156.13mmol/L。
在其中一些实施例中，氨基酸包括丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸；
优选地，所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为0.01～0.16：0.01～0.16：0.01～0.16：0.01～0.16：0.01～0.16：0.01～0.16：0.01～0.16；
进一步优选地，所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为0.09～0.11：0.09～0.11：0.09～0.11：0.09～0.11：0.09～0：11：0.09～0.11：0.09～0.11。
在其中一些实施例中，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述配子缓冲液包括以下添加量的组分：
3-(N-吗啉)丙磺酸19～21mmol/L、NaCl 85～95mmol/L、KC1 5～6mmol/L、MgCl20.4～0.6mmol/L、NaH2P04 0.2～0.4mmol/L、MgSO4 0.8～1.2mmol/L、NaHCO320～30mmol/L、CaCl2 1.5～2mmol/L、葡萄糖0.4～0.7mmol/L、乳酸钠9～11mmol/L、丙酮酸钠0.3～0.4mmol/L、丙氨酸0.09～0.11mmol/L、天门冬氨酸0.09～0.11mmol/L、天冬酰胺0.09～0.11mmol/L、谷氨酸0.09～0.11mmol/L、甘氨酸0.09～0.11mmol/L、脯氨酸0.09～0.11mmol/L、丝氨酸0.09～0.11mmol/L、丙氨酰-谷氨酰胺0.8～1.2mmol/L、牛磺酸0.08～0.12mmol/L、四元羧酸乙二胺四乙酸0.008～0.012mmol/L、人血清白蛋白4.8～5.2g/L、庆大霉素40～60mg/L、辅酶Q100.8～1.2mg/L或褪黑素0.5～1.5nmol/L。
在其中一些实施例中，所述配子缓冲液的pH为7.25～7.35。
本实施方式还提供一种上述配子缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将褪黑素、辅酶Q10和基本缓冲液中的溶质添加到水中，过滤除菌。
所述水优选为超纯水。
当上述配子缓冲液中还包括人血清白蛋白时，所述人血清白蛋白可以与其他缓冲液原料一起加入水中；或者所述人血清白蛋白可以待使用时再按相应的比例加入已配置好的缓冲液中。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中所涉及的试剂，如未特别说明，选自常规商业产品。
以下对照试验中所使用的卵母细胞及精子均来自实验用小鼠，小鼠的来源：ICR品系SPF级别小鼠，采购于北京维通利华实验动物技术有限公司。：
实施例1
配子缓冲液配方：
制备方法如下：
1)在百级无尘车间条件下配制，按上述各自比例依次准确称量物料添加到超纯水中，混合后得溶液I。
2)将步骤1)配置好的溶液I用0.2um的滤膜过滤除菌后，无菌分装，得到一种配子缓冲液。其中，人血清白蛋白(HSA)可提前加入溶液I中，或不加HSA，待使用时再按相应的比例加入HSA混合。
实施例2配子缓冲液配方：
物料 组分
MOPS 20mmol/L
NaCl 90.08mmol/L
KC1 5.5mmol/L
MgCl2 0.5mmol/L
NaH2P04 0.25mmol/L
MgSO4 1mmol/L
NaHCO3 25mmol/L
CaCl2 1.8mmol/L
葡萄糖 0.5mmol/L
乳酸钠 10.5mmol/L
丙酮酸钠 0.32mmol/L
丙氨酸 0.1mmol/L
天门冬氨酸 0.1mmol/L
天冬酰胺 0.1mmol/L
谷氨酸 0.1mmol/L
甘氨酸 0.1mmol/L
脯氨酸 0.1mmol/L
丝氨酸 0.1mmol/L
丙氨酰-谷氨酰胺 1mmol/L
牛磺酸 0.1mmol/L
四元羧酸乙二胺四乙酸 0.01mmol/L
HSA 5g/L
庆大霉素 40mg/L
辅酶Q10 1.5mg/L
褪黑素 1nmol/L
本实施例的制备方法与实施例1一致。
实施例3
配子缓冲液配方：
本实施例的制备方法与实施例1一致。
实施例4
配子缓冲液配方：
本实施例的制备方法与实施例1一致。
对比例1
本对比例提供一种配子缓冲液，其配方与实施例1的配方的区别在于不含有褪黑素。制备方法与实施例1一致。
对比例2
本对比例提供一种配子缓冲液，其配方与实施例1的配方的区别在于不含有辅酶Q10。制备方法与实施例1一致。
对比例3
本对比例提供一种配子缓冲液，其配方与实施例1的配方的区别在于：MOPS缓冲液中的组分MOPS用HEPES代替。制备方法与实施例1一致。
对比例4
本对比例提供一种配子缓冲液，由现有的市售成品配子基础培养液(丹麦Vitrolife公司，G-MOPS)、辅酶Q10(1mg/L)、褪黑素(1nmol/L)为原料制备而成。
精卵授精实验：
分别用实施例、对比例的配子缓冲液制作取卵用皿，并在液体上方覆盖液体石蜡油，在37摄氏度温度的环境下做涮洗和暂存操作，拣取、处理卵母细胞卵丘细胞复合物(如图1所示)，体外耗时5～15分钟后转移至受精培养液中。同时将优选的精子加入到受精培养液中，进行受精。
授精前检测精子活力，第二天观察卵子受精率(观察原核形成及是否有卵裂)。检测结果见表1：
表1
组别 精子活力 受精率(％)
实施例1 83.35土3.34 91.79±5.31
实施例2 82.27土3.62 89.54±5.12
实施例3 83.16±7.62 89.61±4.85
实施例4 82.75土3.34 88.21±4.25
对比例1 83.14土3.04 85.73±6.16
对比例2 82.90土3.74 84.61±4.25
对比例3 82.75土2.64 87.14±3.26
对比例4 83.05土4.34 88.14±5.31
由表1的结果可知，本发明将褪黑素和辅酶Q10两者添加入本发明所述的基本缓冲液中，可以发挥良好的促进配子细胞的有丝分裂和细胞发育，提高精卵受精率的效果。从对比例1～4与实施例1受精率的对比可知，本发明的配子缓冲液中褪黑素和辅酶Q10与本发明特定的基本缓冲液之间是通过相互配合、相互促进来实现上述效果的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种配子缓冲液，其特征在于，所述配子缓冲液包括基本缓冲液和添加物；以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.5~1.3 nmol/L；
辅酶Q10 0.8~1.3mg/L；
所述基本缓冲液包括MOPS缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸；
所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为0.4~0.7：9~11：0.3~0.4：0.63~1.05：0.8~1.2：0.08~0.12：0.008~0.012；
所述MOPS缓冲液包括以下组分：摩尔比为16~24：80~110：3.5~8：0.4~0.6：0.05~1.2：0.2~3.2：10~35：0.5~3的3-(N-吗啉)丙磺酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙；
以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述基本缓冲液中还包括：
人血清白蛋白 1~10 g/L；和/或，
杀菌剂 20~100 mg/L；
所述氨基酸包括丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸；
所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为0.01~0.16：0.01~0.16：0.01~0.16：0.01~0.16：0.01~0.16：0.01~0.16：0.01~0.16。
2.根据权利要求1所述的配子缓冲液，其特征在于，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述添加物包括以下组分：
褪黑素 0.9~1.1nmol/L；
辅酶Q10 0.8~1.3mg/L。
3.根据权利要求1所述的配子缓冲液，其特征在于，所述杀菌剂的添加量为40～60mg/L；所述人血清白蛋白的添加量为4.5～5.5g/L。
4.根据权利要求3所述的配子缓冲液，其特征在于，所述杀菌剂为青霉素、链霉素和庆大霉素中的至少一种；以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述杀菌剂的添加量为50mg/L；所述人血清白蛋白的添加量为5g/L。
5.根据权利要求1所述的配子缓冲液，其特征在于，所述3-(N-吗啉)丙磺酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙的摩尔比为19~21：85~95：5~6：0.44~0.53：0.2~0.4：0.8~1.2：20~30：1.5~2。
6.根据权利要求1所述的配子缓冲液，其特征在于，所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为0.09~0.11：0.09~0.11：0.09~0.11：0.09~0.11：0.09~0：11：0.09~0.11：0.09~0.11。
7.根据权利要求1所述的配子缓冲液，其特征在于，以在所述基本缓冲液中的添加量计，所述配子缓冲液包括以下添加量的组分：
3-(N-吗啉)丙磺酸19~21 mmol/L、NaCl 85~95mmol/L、KC1 5~6 mmol/L、MgCl2 0.4~0.6mmol/L、NaH2P04 0.2~0.4mmol/L、MgSO4 0.8~1.2mmol/L、NaHCO3 20~30mmol/L、CaCl21.5~2mmol/L、葡萄糖0.4~0.7mmol/L、乳酸钠9~11mmol/L、丙酮酸钠0.3~0.4mmol/L、丙氨酸0.09~0.11mmol/L、天门冬氨酸0.09~0.11mmol/L、天冬酰胺0.09~0.11mmol/L、谷氨酸0.09~0.11mmol/L、甘氨酸0.09~0.11mmol/L、脯氨酸0.09~0.11mmol/L、丝氨酸0.09~0.11mmol/L、丙氨酰-谷氨酰胺0.8~1.2mmol/L、牛磺酸0.08~0.12mmol/L、四元羧酸乙二胺四乙酸0.008~0.012mmol/L、人血清白蛋白4.8~5.2 g/L、庆大霉素40~60 mg/L、辅酶Q10 0.8~1.2 mg/L和褪黑素0.9~1.1 nmol/L；和/或，所述配子缓冲液的pH为7.25~7.35。
8.权利要求1~7任一项所述的配子缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将褪黑素、辅酶Q10和基本缓冲液中的组分添加到水中，过滤除菌。
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