CN111406736A - 一种细胞冻存液 - Google Patents

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彭昉
俞英豪
张孝松
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Abstract

本发明公开了一种细胞冻存液，主要成分为二甲基亚砜、右旋糖酐、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，利用本发明提供的细胞冻存液可用于冻存干细胞、脐带血、普通细胞等，同时该冻存液具有成本低、细胞存活率高、成分简单等优点，对于生物医学具有重要的应用价值。

Description

一种细胞冻存液
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液，具体涉及一种用于干细胞的冻存液。
背景技术
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源。
干细胞治疗是将具有不断自我繁殖能力和多向化潜能的干细胞在体外培养后，再将其移植入患者受损或缺损组织中，从而实现对损伤组织的补充和修复。
目前干细胞采集后，需要加入保存液进行冷冻保存，细胞冻存液是细胞冻存过程中的核心试剂，关系到细胞复苏后的活性及数量等问题，现有的细胞冻存液，一方面营养成分单一，配比不当，导致细胞存活率低、稳定性差；另一方面大多都是异种血清，会引入外源蛋白从而增加细胞污染和过敏的风险，不适用于临床。
因此，为有效开展干细胞移植及建立干细胞库，亟需开发一种成本低、细胞存活率高、成分简单的细胞冻存液，对于生物医学具有重要的研究与应用价值。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种细胞冻存液，使冻存培养后的细胞具有成活率高的优点，同时满足冻存液成分简单、成本低等要求。
本发明是通过如下技术方案得以实现上述目的。
第一方面，本发明提供了一种细胞冻存液，所述细胞冻存液的成分如下：
Figure BDA0001936800790000021
将上述组分加入到工业用水中，用于配置得到细胞冻存液。
该细胞冻存液采用联合渗透性和非渗透性保护液组合方案，细胞冻存液在完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免细胞过分脱水皱缩。
第二方面，本发明提供了一种细胞冻存液的使用方法，所述方法包括如下步骤：
1)冻存液制备：制备本发明第一方面所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法及相应的比例混合即可获得；
2)细胞悬液制备：
a.将培养细胞用0.04％乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)或0.29％胰蛋白酶消化3～7min(根据室温情况而定)，至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止，弃去消化液，加PBS液；
b.用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；
c.800～1000r/min，短时低速离心5min；
d.弃上清，加pH 7.4的PBS液5～8ml，低速短时离心，800～1000r/min 离心3～5min；重复2～3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；
e.加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀；加固定液或低温保存待用。
3)根据细胞悬液的体积，按一定比例以稳定速率加入细胞冻存液并充分混匀；
4)冻存：将步骤3)中充分混匀的细胞溶液分装至冻存管中，并转移至液氮中，进行程序性降温至-80℃并转至液氮中储存；
5)细胞复苏：
从液氮系统中取出装有冻存细胞样品，等待1～2min使残余液氮挥发之后，迅速放入37℃水浴中，待可见冰块刚好要消失至黄豆大小体积时，取出细胞样品待用。
6)计算细胞存活率
优选地，步骤3)中细胞悬液体积与细胞冻存液体积的比例为2～8：1，最优选地，细胞悬液体积与细胞冻存液的体积的比例为4：1
本发明的有益效果：
1.本发明的细胞冻存液，复苏细胞存活率可达96％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。
2.本发明的干细胞冻存液可以长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。
3.本发明细胞冻存方法，操作简单可行，具有较好的实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明的内容。本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明技术方案的实质和范围的情况下，对本发明的技术方案进行修改或等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1细胞冻存液的制备
以1L体积为标准，按照下列组分的含量，称取对应的重量：
Figure BDA0001936800790000031
上述两组分充分混匀形成细胞冻存液。
实施例2脐带血细胞的冻存
采用实施例1所述细胞冻存液，在冻存前24小时，将该冻存液置于2-8℃进行温度平衡，
以脐带血细胞为例制备细胞悬液，取800ul细胞悬液，按按细胞悬液(v): 细胞冻存液(v)＝4:1计算加入细胞冻存液的体积200ul，并以稳定速率加入细悬液中，这一过程需要在15min之内完成，同时需要不断进行混合，使得细胞冻存液能够在细胞悬液中均匀分布。随后，将充分混匀的细胞溶液分装至1.5ml 冻存管中，进行程序性降温至-80℃后转至液氮中储存。
从液氮系统中取出冻存的脐带血细胞样品，等待1～2min使残余液氮挥发之后，迅速放入37℃水浴中，待可见冰块刚好要消失至黄豆大小体积时，取出细胞样品计算细胞存活率。细胞存活率结果如表1所示。
实施例3间充质干细胞的冻存
采用实施例1所述细胞冻存液，在冻存前24小时，将该冻存液置于2-8℃进行温度平衡，
以间充质干细胞为例制备细胞悬液，取800ul细胞悬液，按按细胞悬液(v): 细胞冻存液(v)＝4:1计算加入细胞冻存液的体积200ul，并以稳定速率加入细悬液中，这一过程需要在15min之内完成，同时需要不断进行混合，使得细胞冻存液能够在细胞悬液中均匀分布。随后，将充分混匀的细胞溶液分装至1.5ml 冻存管中，进行程序性降温至-80℃后转至液氮中储存。
从液氮系统中取出冻存的充质干细胞样品，等待1～2min使残余液氮挥发之后，迅速放入37℃水浴中，待可见冰块刚好要消失至黄豆大小体积时，取出细胞样品计算细胞存活率。细胞存活率结果如表1所示。
实施例4 NK细胞的冻存
采用实施例1所述细胞冻存液，在冻存前24小时，将该冻存液置于2-8℃进行温度平衡，
以NK细胞为例制备细胞悬液，取800ul细胞悬液，按按细胞悬液(v):细胞冻存液(v)＝4:1计算加入细胞冻存液的体积200ul，并以稳定速率加入细悬液中，这一过程需要在15min之内完成，同时需要不断进行混合，使得细胞冻存液能够在细胞悬液中均匀分布。随后，将充分混匀的细胞溶液分装至1.5ml冻存管中，进行程序性降温至-80℃后转至液氮中储存。
从液氮系统中取出冻存的NK细胞样品，等待1～2min使残余液氮挥发之后，迅速放入37℃水浴中，待可见冰块刚好要消失至黄豆大小体积时，取出细胞样品计算细胞存活率。细胞存活率结果如表1所示。
细胞类型 细胞存活率
间充质干细胞 99.5％
脐带血细胞 99％
NK细胞 96％
表1不同细胞冻存后的细胞存活率。

Claims (8)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由二甲基亚砜、右旋糖酐-40、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾组成。
2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜的体积含量为50％，右旋糖酐-40的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.02mol/L，磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L。
3.如权利要求1或2所述的细胞冻存液，其特征在于，细胞冻存液所用的水为工业用水。
4.一种细胞冻存液的使用方法，所述方法包括如下步骤：
1)进行细胞冻存液的制备
2)细胞悬液的制备
3)根据细胞悬液的体积，按一定比例以稳定速率加入细胞冻存液并充分混匀；
4)细胞冻存：将步骤3)中充分混匀的细胞溶液分装至冻存管中，并转移至液氮中，进行程序性降温至-80℃并转至液氮中储存；
5)细胞复苏
6)细胞存活率计算。
5.如权利要求4所述的细胞冻存液的使用方法，其特征在于，所述细胞冻存液由胞冻存液由二甲基亚砜、右旋糖酐-40、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾组成。
6.如权利要求4所述的细胞冻存液的使用方法，其特征在于，所述二甲基亚砜的体积含量为50％，右旋糖酐-40的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为0.02mol/L，磷酸二氢钾的浓度为0.01mol/L。
7.如权利要求4-6任一所述细胞冻存液的使用方法，其特征在于，所述步骤3)中细胞悬液体积与细胞冻存液体积的比例为2～8：1，优选地，细胞悬液体积与细胞冻存液的体积的比例为4：1。
8.权利要求1-3任一所述细胞冻存液在细胞冻存中的应用。
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