CN111226908A - 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细胞冻存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞冻存液及其制备方法和应用。所述的干细胞冻存液包含以下成分：水，基础培养基，多聚L‑赖氨酸，丁二酸酐，右旋糖苷40，维生素E，维生素C等。本发明创新性地采用羧基化多聚L‑赖氨酸(CPLL)作为有效抗冻组分。CPLL由多聚L‑赖氨酸和丁二酸酐在温水体系中反应而来。本发明的干细胞冻存液不含有血清和DMSO，成分明确安全，批间稳定性高，有效保持细胞在冻存和复苏后的高活率，细胞形态正常，后续增殖能力和分化潜能不受影响。该冻存液非常适合在临床上用于替代含血清和DMSO的冻存液。

Description

一种细胞冻存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物试剂领域，涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术
细胞冻存是指利用专门的冻存技术将细胞置于超低温长期保存，使细胞脱离生长状态，保持细胞特性并且在需要的时候可以通过专门的复苏技术将细胞复苏用于后续科研实验、工业生产或临床应用。
目前，实验室常用的细胞冻存液或商品化的细胞冻存液中通常需要加入二甲基亚砜(DMSO)和血清。二甲基亚砜(DMSO)可以在低温冻存过程中有效地减少细胞内冰晶的形成、维持细胞内外溶质平衡，减少渗透压的改变、细胞结构变化等导致的细胞损伤，是目前最常用的细胞冻存液的有效成分。虽然，通常认为当浓度小于10％时，二甲基亚砜(DMSO)的毒性作用很小，但是在回输细胞的治疗过程中，冻存细胞中残留的二甲基亚砜(DMSO)依旧会产生许多的副作用，例如神经毒性、恶心呕吐、心率失常等。同时二甲基亚砜(DMSO)会抑制细胞增殖，并且被发现对多种细胞具有毒性，例如成牙本质细胞、星形细胞、干细胞等。而血清作为一种成分尚不明确的动物源物质，具有一定的批次间差异，影响细胞冻存液效果的稳定性，并且在临床使用中容易导致过敏。因此，细胞冻存领域一直需要一种高效、安全、稳定的细胞冻存液，也要求该冻存液可以对一些常用于临床的细胞进行冻存，比如免疫细胞细胞、间充质干细胞等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种细胞冻存液的制备方法。
本发明的另一目的是提供该方法制备的到的细胞冻存液。
本发明的又一目的是提供该细胞冻存液的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种细胞冻存液的制备方法，包含以下步骤：
(1)将10％～80％多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～50g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2～3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：20～500mg/100ml，1，2丙二醇：0.5～5mol/L，维生素E：10～50mg/100ml,维生素C：20～200mg/100ml。
(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。
其中，步骤(1)中所述的多聚L-赖氨酸水溶液的浓度优选20～30g/100mL。
步骤(1)中所述的丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比优选10～20g:100ml。
步骤(2)中所述的反应液与所述的DMEM基础培养基的体积比优选1:2.3。
步骤(3)中各物质的终浓度优选：右旋糖苷40：280～350mg/100ml，1，2丙二醇：1～2mol/L，维生素E：20～25mg/100ml,维生素C：80～130mg/100ml。
步骤(3)中各物质的终浓度为：右旋糖苷40：280～300mg/100ml，1，2丙二醇：1～1.5mol/L，维生素E：20～22mg/100ml,维生素C：90～105mg/100ml。
步骤(3)中各物质的终浓度更进一步优选：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。
按照本发明所述的制备方法制备得到的细胞冻存液。
本发明所述的细胞冻存液在间充质干细胞或者其他类型细胞的低温冻存中的应用。
有益效果
本发明公开了一种细胞冻存液，可用于间充质干细胞或者其他类型细胞的低温冻存。所述的干细胞冻存液包含以下成分：水，基础培养基，多聚L-赖氨酸，丁二酸酐，右旋糖苷40，维生素E，维生素C等。本发明创新性地采用羧基化多聚L-赖氨酸(CPLL)作为有效抗冻组分。CPLL由多聚L-赖氨酸和丁二酸酐在温水体系中反应而来。CPLL侧链氨基对细胞膜的高亲和力有助于维持细胞膜的完整性，同时CPLL对水具有高亲和力，也有助于在冷冻过程中将细胞内水分离到细胞周围,抑制冰晶生长和重结晶，从而保护了细胞免受冷冻损伤。本发明的干细胞冻存液不含有血清和DMSO，成分明确安全，批间稳定性高，有效保持细胞在冻存和复苏后的高活率，细胞形态正常，后续增殖能力和分化潜能不受影响。该冻存液非常适合在临床上用于替代含血清和DMSO的冻存液。
附图说明
图1.实施例1细胞冷冻液冻存的细胞复苏后4天细胞形态
图2.实施例2细胞冷冻液冻存的细胞复苏后4天细胞形态
图3.实施例3细胞冷冻液冻存的细胞复苏后4天细胞形态
图4.实施例1冻存前细胞形态
具体实施方式
实施例1：
(1)将25g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为13g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的DMEM基础培养基的体积比为1:2.3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。
(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。
实施例2：
(1)将22g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为13g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。
实施例3：
(1)将28g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为13g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。
实施例4
(1)将20g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为11g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：290mg/100ml，1，2丙二醇：1.4mol/L，维生素E：23mg/100ml,维生素C：110mg/100ml。
实施例5
(1)将29g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为19g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.6；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：330mg/100ml，1，2丙二醇：1.1mol/L，维生素E：25mg/100ml,维生素C：120mg/100ml。
实施例6
(1)将20g/100mL的多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.0；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：320mg/100ml，1，2丙二醇：1.8mol/L，维生素E：25mg/100ml,维生素C：130mg/100ml。
比较例1：
实验室常用自配冻存液，含有胎牛血清，DMSO和α-MEM，三者体积比为胎牛血清：DMSO:α-MEM＝2:1:7。
比较例2：新赛美公司市售的含DMSO细胞冻存液。
比较例3：友康恒业公司市售的不含DMSO的细胞冻存液。
效果实施例
人脐带来源间充质干细胞冻存：培养生长成单层的人脐带来源间充质干细胞，在对数生长期时，将人脐带来源间充质干细胞用温和干细胞消化酶(北京友康恒业)消化2分钟，加入4倍体积的DPBS缓冲液，用移液管轻轻吹打使人脐带来源间充质干细胞均匀，用离心机以400g的转速离心5分钟，弃上清，轻轻弹散细胞沉淀，分别加入4℃预冷的实施例1～3以及比较例1～3的细胞冻存液混匀。以1×107cells/ml的浓度，1ml的体系置入1.5ml的冻存管中后转移到-80℃冰箱，隔天转移到液氮中长期保存。
人脐带来源间充质干细胞复苏：将人脐带来源间充质干细胞从-80℃的冰箱中取出，快速转移到37℃水浴锅中在2min内完全解冻，随后将人脐带来源间充质干细胞移到装有7ml预冷的DPBS离心管中，400g离心5min，弃上清，经间充质干细胞培养基(北京友康恒业)重悬后接种到T75培养瓶培养，取50微升用台盼蓝染色鉴定细胞死活，计数活细胞。结果见图1～4，及表1～2。从以上的实验结果(表1-表2,图1-图4)可以看出，与实验室常用自配的冻存液(比较例1)和市售的含二甲基亚砜(DMSO)的冻存液(比较例2)、不含无二甲基亚砜(DMSO)的冻存液(比较例3)相比，本发明的细胞冻存液能更好地提高冻存细胞复苏后的存活率，复苏后细胞扩增情况良好，形态正常。本发明的冻存液不含二甲基亚砜(DMSO)，成分安全无毒，也不包含血清等不不适合用于临床使用的动物源组分可广泛用于细胞冻存技术领域，特别是在临床级细胞冻存具有较好的应用前景。
表1.冻存90天复苏后台盼蓝检测细胞活率
细胞存活率％
冻存前 96.73
实施例1的冻存液 93.86
实施例2的冻存液 89.61
实施例3的冻存液 88.43
实施例4的冻存液 91.27
实施例5的冻存液 88.93
实施例6的冻存液 92.46
比较例1的冻存液 84.29
比较例2的冻存液 85.03
比较例3的冻存液 81.37
表2.冻存90天复苏后4天细胞扩增倍数(复苏4天后细胞数/复苏时细胞数)
细胞扩增倍数
实施例1的冻存液 25.62
实施例2的冻存液 22.98
实施例3的冻存液 21.09
实施例4的冻存液 22.45
实施例5的冻存液 21.85
实施例6的冻存液 21.88
比较例1的冻存液 18.42
比较例2的冻存液 16.37
比较例3的冻存液 12.51

Claims (9)

1.一种细胞冻存液的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将10～80g/100mL多聚L-赖氨酸水溶液与丁二酸酐混合，50℃反应1小时；其中丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～50g：100mL；
(2)将上一步的反应液与DMEM基础培养基混合得混合液1；其中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2～3；
(3)将右旋糖苷40，1,2丙二醇，维生素E和维生素C加入混合液1并用纯水定容，使得各物质的终浓度为：右旋糖苷40：20～500mg/100ml，1，2丙二醇：0.5～5mol/L，维生素E：10～50mg/100ml,维生素C：20～200mg/100ml。
(4)将上述步骤配好的溶液PH调整为7.0后经0.22微米滤膜过滤得所述的细胞冻存液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的多聚L-赖氨酸水溶液的浓度为20～30g/100mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的丁二酸酐与多聚L-赖氨酸水溶液的质量体积比为10～20g:100ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的反应液与所述的基础培养基的体积比为1:2.3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中各物质的终浓度为：右旋糖苷40：280～350mg/100ml，1，2丙二醇：1～2mol/L，维生素E：20～25mg/100ml,维生素C：80～130mg/100ml。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中各物质的终浓度为：右旋糖苷40：280～300mg/100ml，1，2丙二醇：1～1.5mol/L，维生素E：20～22mg/100ml,维生素C：90～105mg/100ml。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中各物质的终浓度为：右旋糖苷40：300mg/100ml，1，2丙二醇：1.5mol/L，维生素E：20mg/100ml,维生素C：100mg/100ml。
8.按照权利要求1～7中任一项所述的制备方法制备得到的细胞冻存液。
9.权利要求8所述的细胞冻存液在间充质干细胞或者其他类型细胞的低温冻存中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106064A (zh) * 2021-02-24 2021-07-13 河南省银丰生物工程技术有限公司 一种免疫细胞cik的冻存液及其活性研究方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107494519A (zh) * 2017-09-06 2017-12-22 岳阳市阿罗格医药技术有限公司 一种环保型液基细胞保存液及其制备方法以及应用
CN109221082A (zh) * 2018-09-14 2019-01-18 上海慧存医疗科技有限公司 细胞冻存液、冻存复苏方法及其应用
CN110495450A (zh) * 2019-09-24 2019-11-26 湖南丰晖生物科技有限公司 一种细胞冻存运输液及其应用
CN110622956A (zh) * 2019-09-27 2019-12-31 广州南医大生物工程有限公司 一种脐带间充质干细胞保存液
CN111480645A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 深圳安吉赛尔生物科技有限公司 一种脂肪干细胞的储存方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107494519A (zh) * 2017-09-06 2017-12-22 岳阳市阿罗格医药技术有限公司 一种环保型液基细胞保存液及其制备方法以及应用
CN109221082A (zh) * 2018-09-14 2019-01-18 上海慧存医疗科技有限公司 细胞冻存液、冻存复苏方法及其应用
CN111480645A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 深圳安吉赛尔生物科技有限公司 一种脂肪干细胞的储存方法
CN110495450A (zh) * 2019-09-24 2019-11-26 湖南丰晖生物科技有限公司 一种细胞冻存运输液及其应用
CN110622956A (zh) * 2019-09-27 2019-12-31 广州南医大生物工程有限公司 一种脐带间充质干细胞保存液

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106064A (zh) * 2021-02-24 2021-07-13 河南省银丰生物工程技术有限公司 一种免疫细胞cik的冻存液及其活性研究方法

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