CN107810948B

CN107810948B - 一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液

Info

Publication number: CN107810948B
Application number: CN201710925616.3A
Authority: CN
Inventors: 刘劼; 朱益辉; 黄明辉; 薛婷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-10-04
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2037-10-04
Also published as: CN107810948A

Abstract

本发明提供一种人脐带间充质干细胞的冻存液，属于干细胞培养技术领域，是适合临床应用的干细胞冻存液的组合物。采用多种成分对冻存条件进行优化，其体积百分比为含人脐带间充质干细胞无血清培养基65%‑75%、人血白蛋白9‑12%、二甲基亚砜9‑12%、腺苷3‑5.5%、以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液2.5‑5%和人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5‑5%的混合溶液。脐带间充质干细胞在上述冻存液中复苏后贴壁率达到95%以上，传代培养及扩增之后分析，流式细胞术结果显示干细胞的特性稳定。冻存液中不含胎牛血清，防止了外源性不明成分和病原性污染，有效保证干细胞治疗产品的质量稳定和标准化，为用于临床治疗奠定了基础。

Description

一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说是一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液。

背景技术

人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多能干细胞，与其他来源的间充质干细胞比较有明显的临床应用优势，如取材容易、易收集、冷冻保存及相对纯净等，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，如成骨细胞、软骨细胞、类肝细胞、类胰岛素细胞、神经细胞和心肌细胞等，且无伦理方面的问题。目前，人脐带间充质干细胞已经在临床领域得到应用并取得令人鼓舞的治疗效果。

人脐带间充质干细胞的种子库在临床上已经广泛应用，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞的冻存过程中无外源性污染是脐带间充质干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，另一方面采用动物血清培养的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

人脐带间充质干细胞种子库细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存液的微环境对人脐带间充质干细胞有着重要影响，当细胞微环境出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老，且细胞的生物学特性和遗传稳定性都可能发生变化，优化干细胞的冻存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有冻存条件的不足，提供一种脐带间充质干细胞的冻存液，解决常规冻存液中胎牛血清带来的动物源性成分和病原体污染问题，减少细胞死亡并维持干细胞特性。脐带间充质干细胞在无血清冻存液中保存在液氮中14天后重新复苏后贴壁率达到95%以上，死细胞很少，大大提高了细胞的活性与数量，同时流式细胞术检测细胞表型时, 阳性表达CD90/CD44/CD73/CD105，阴性表达CD34/CD45/CD19/CD11b/HLA-DR,干细胞特性没有变化。

一）本发明的技术方案是按以下方式实现的，该实验方法的步骤是：

1）本发明提出的一种脐带间充质干细胞冻存液, 是含各成分的体积百分比为：预先制备的人脐带间充质干细胞无血清培养基65%-75%、人血白蛋白9-12%、二甲基亚砜9-12%、腺苷3-5.5%、以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液2.5-5%和人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5-5%的混合溶液。

2)具体实施方式中，冻存液是含人脐带间充质干细胞无血清培养基的体积百分比可以为65%，67%，69%，71%，73%，75%；人血白蛋白的体积百分比可以为9%，9.5%，10%，10.5%，11%，12%；二甲基亚砜体积百分比可以为9%，9.5%，10%，10.5%，11%，12%、腺苷的体积百分比可以为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%，以及人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液体积百分比可以为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%、人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液的体积百分比可以为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%的混合溶液。

3）在冻存液中加入上述体积百分比的人脐带间充质干细胞无血清培养基，该培养基包括基础培养基和添加营养因子成份，其中，基础培养基为Alpha-MEM培养基，根据需要添加如下成份：营养因子A（50 ng/mL），营养因子B（50 ng/mL），血小板源性因子（50 ng/mL），表皮生长因子（50 ng/mL），碱性成纤维生长因子（50 ng/mL），细胞因子抗体A（20 ng/mL），细胞因子抗体B（20 ng/mL），细胞因子抗体C（20 ng/mL）。无血清培养基是一种主要的细胞营养成分，维持细胞的微环境。冻存液中加入适量的无血清培养基，保证了人脐带间充质干细胞的活性，同时保障了临床应用的安全性。

4）在冻存液中加入上述百分体积比的浓度为40g/L的医用人血白蛋白，主要是调节细胞内水分动态平衡，维持细胞渗透压相对稳定，也是一种细胞的防冻保护剂。冻存液中加入适量的医用人血白蛋白，保证了人脐带间充质干细胞在冻存过程中的安全性。

5）在冻存液中加入上述百分体积比的二甲基亚砜，这是一种主要的细胞防冻保护剂。冻存液中加入适量的医用二甲基亚砜降低细胞内的水熔点，保证了人脐带间充质干细胞细胞内水分动态平衡，防止微冰晶造成的细胞损伤。

6）在冻存液中加入上述百分体积比的浓度为4mmol/L浓度的腺苷，可在冻存过程中保持细胞内ATP 水平的稳定，为细胞生长必须的能量物质，在细胞的代谢过程中起着非常重要的营养作用，能够增强细胞活性，同时发挥细胞保护作用，防止冻存条件下造成的功能损伤。

7）在冻存液中加入400 ng/mL浓度的人脐带间充质干细胞P3-P6 代来源的外泌体，可以促进人脐带间充质干细胞的增殖及迁移，抑制细胞的凋亡信号通路，对维持细胞的干性具有重要意义。

8）在冻存液中加入400 ng/mL的人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物，可显著提高人脐带间充质干细胞的存活率，抑制细胞的凋亡信号通路，在对维持细胞的活性与干性具有重要意义。

上述各成分均是生物医药领域常用的化学试剂、生物制品或原料药，在用于细胞冻存时，优选使用国家食品药品监督管理局批准的药用级产品，白蛋白优选使用人血白蛋白，外泌体、短肽和多肽类化合物为人脐带间充质干细胞的自身产物，通过无菌质量检测。

二）人脐带间充质细胞在上述冻存液中冻存，然后进行复苏、传代培养及扩增的实验步骤是：

1) 细胞复苏步骤：

a) 从液氮罐中快速取出1管冻存的细胞（7×10⁵个/管冻存）至备有液氮的冰盒中，待用；

b)打开水浴锅至37℃；

c)用10mL移液管吸取9mL无血清培养基至15mL离心管中，待用；

d)用镊子从冰盒中夹出细胞，在37℃水浴中快速解冻，轻轻摇晃，直至只有一小块冰坨，复苏时间控制在2min以内；

e)用100-1000μL Tip头将复苏好的细胞吸至离心管中，轻晃混匀，Tip头可吸取少量离心管中的细胞悬液清洗一遍冻存管，400g，室温离心3min；

f)用移液管向1个T75培养瓶中加入7mL完全培养基；离心完，倒去上清，擦拭管口，加入8mL完全培养基重悬细胞，吹打10次混匀，取20μL细胞悬液用于计数，接种至培养瓶中；

g)培养瓶上手动标记细胞名称、复苏代数和复苏日期，放至37℃，5%CO2培养箱中培养；

h)20μL细胞悬液用配制好的台盼蓝染液（0.4%台盼蓝染液用PBS稀释1倍）稀释2倍计数；

i)操作完，整理生物安全柜和桌面，放入下次操作时需用耗材，紫外照射消毒30min。

2) 传代培养步骤（以T75cm2培养瓶为例）：

a)显微镜下观察细胞生长状态，当细胞汇合度至80%时，按1:3比例传代；

b)从培养箱中取出细胞，倒去废液，擦拭瓶口，用5mL移液管吸取5mL生理盐水将细胞洗一遍（注：不要直接吹打细胞），轻晃培养瓶，吸去废液；

c)吸取2mL0.25%Trypsin-EDTA加入到培养瓶内，丢弃移液管，轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖整个培养瓶，5%CO2培养箱中放置3min，在显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞完全从培养瓶底壁脱落；

d)用5mL移液管吸取2mL完全培养基至培养瓶内，吹打10次混匀，移入1个15mL离心管中，混匀，丢弃移液管；

e)用5mL移液管吸取5mL 生理盐水将培养瓶中残留的细胞洗一遍，移入上述15mL离心管中，丢弃移液管，400g，室温离心3min；

f)倒去上清，擦拭管口，用10mL移液管吸取32mL完全培养基至1个T225培养瓶中；再吸取8mL完全培养基重悬细胞，吹打10次混匀，取20μL细胞悬液用于计数，接种至培养瓶中；

g)培养瓶上手动标记细胞名称、传代代数和传代日期，放至37℃，5%CO2培养箱中培养；

h)20μL细胞悬液用配制好的台盼蓝染液（0.4%台盼蓝染液用PBS稀释1倍）稀释5倍计数；

3）培养细胞的表面标记分析的试验步骤是:

取P3-P6代的细胞，去掉培养液，洗涤2次，用1:1的质量0.05%浓度胰蛋白酶液消化，离心，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为10⁶/ml的细胞悬液，加入10uL抗体，在4度下孵育，用PBS洗涤1次，离心，用500uL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测进行检测并记录结果。

本发明的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，克服了动物源性血清污染的缺陷和并解决了细胞扩增数量和维持干细胞特性的问题：不含血清，避免了不明血清成份中动物源性的污染；培养基中添加了特殊的细胞因子和特定的细胞因子抗体，可促进脐带间充质干细胞的增殖和维持干细胞特性，增加了脐带间充质干细胞的存活率，确保了细胞的质量和安全性符合国家的GMP要求，为广泛的临床应用铺平道路。

本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液中的脐带间充质干细胞保持良好的贴壁特性，脐带间充质干细胞均呈现出梭形的成纤维状细胞形态，同时经过多代培养的情况下，细胞可保持正常状态。

本发明的冻存体系中的人脐带间充质干细胞在72-96小时前能够生长至平台期，但在对照的冻存体系中脐带间充质干细胞只能在120-168小时后才能够生长至平台期，由此可以看出，本发明的无血清冻存液能够有效地促进脐带间充质干细胞的生长，调高细胞的存活率。

本发明所述的无血清冻存液和对照组冻存液中冻存的细胞的流式细胞表型对比结果显示, 本发明提供的无血清培养基和对照组培养基阳性表达CD90/CD44/CD73/CD105，阴性表达CD34/CD45/CD19/CD11b/HLA-DR，没有统计学差异。

附图说明

1）图1A为本发明的脐带间充质干细胞无血清冻存液保存的人脐带间充质干细胞复苏以后培养的细胞形态图片；

图1B为常规冻存液保存的人脐带间充质干细胞复苏以后培养的细胞形态图片；

图1C为无血清冻存液中保存的人脐带间充质干细胞复苏培养96小时后的细胞形态图片，细胞融合达到80%，细胞形态均一，呈长梭形，细胞核为圆形或椭圆形，位于胞体中央；

2）图2为无血清冻存液和常规冻存液中保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的生长曲线图，细胞生长情况：两种冻存液保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的细胞生长情况差异有显著性意义(P > 0.05)；

图2中的曲线1为本发明的人脐带间充质干细胞无血清冻存液中保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的生长曲线图；

图2中的曲线2为常规冻存液冻存中保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的生长曲线图；

图2中，横坐标表示生长时间单位为天数，纵坐标表示细胞计数值。

3）图3A为本发明的无血清冻存液中保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的细胞的流式细胞表型检测数据；

图3B为常规冻存液保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的细胞的流式细胞表型检测数据；

无血清冻存液和常规（对照组）冻存液中保存的人脐带间充质干细胞复苏后培养的干细胞阳性表达CD90/CD44/CD73/CD105，阴性表达CD34/CD45/CD19/CD11b/HLA-DR，没有统计学差异。

Claims

1.一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液，具体包含以下成分：

无血清培养基，所述无血清培养基为Alpha-MEM培养基，体积百分比为69％；

医用人血白蛋白，浓度为40g/L，体积百分比为10％；

二甲基亚砜，体积百分比为10％；

腺苷，浓度为4mmol/L，体积百分比为4％；

人脐带间充质干细胞来源的外泌体溶液，所述外泌体溶液来自于人脐带间充质干细胞P3-P6代来源，浓度为400ng/mL，体积百分比为3.5％；

人脐带间充质干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液，浓度为400ng/mL，体积百分比为3.5％。