CN101921719B

CN101921719B - 军团菌运送增菌培养基

Info

Publication number: CN101921719B
Application number: CN 201010192273
Authority: CN
Inventors: 朱庆义; 胡朝晖; 赵利伟; 王娟; 刘洋敏
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Current assignee: Chongqing Kingmed Diagnostics Co ltd
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2010-05-31
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2030-05-31
Also published as: CN101921719A

Abstract

本发明公开了一种军团菌运送增菌培养基，其特征是在军团菌BCYEα-基础培养基制备过程中添加了军团菌选择成分：甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮。其中添加特定优化量的抗生素，既可以用作军团菌分离培养标本的运送，又可使军团菌在运送过程中增殖。有益效果如下：一是提高对非军团菌属及杂菌类的抑制能力，减少杂菌污染，二是降低对军团菌的抑制性，从而提高了对军团菌属分离培养阳性率。

Description

军团菌运送增菌培养基

技术领域：

本发明涉及一种培养基，具体为一种特别适合临床标本中军团菌的分离培养，在标本采集运送过程中减少杂菌污染，但能保持军团菌适当生长，从而提高军团菌的分离培养阳性率的军团菌运送增菌培养基。

背景技术：

据军团菌检测国际标准ISO11731：1998、美国疾病预防控制中心(CDC)和我国卫生部卫生行业标准《军团病诊断标准及处理原则》WS-195-2001规定，对军团菌病的诊断，细菌培养是金标准。但对军团菌的分离培养，要求营养丰富的选择性分离培养基，技术难度大、耗时长，阳性率低，经常延误了临床对军团菌病的准确诊断和及时采取有效的治疗措施，而造成军团菌病的病死率增高。其中最主要的是临床标本军团菌分离培养难，在标本采集和运送过程中，由于杂菌生长，军团菌受抑制，而导致军团菌分离培养阳性率偏低的对整个军团菌病的诊断影响巨大。至今，国内外尚无一种可用于军团菌分离培养的运送增菌培养基。

发明内容：

本发明的目的为了克服临床标本军团菌分离培养难，在标本采集和运送过程中，由于杂菌生长，军团菌受抑制，而导致军团菌分离培养阳性率偏低的问题，提供了一种目前国内外尚没有的军团菌运送增菌培养基。该培养基在BCYE α-基础培养基中，通过实验研究，优化组合，添加了适当浓度的选择性抗生素，使军团菌培养的临床标本在运送过程中减少杂菌污染、但保持军团菌适当生长，从而提高军团菌的分离培养阳性率。

本发明是这样实现的：军团菌运送增菌培养基，既可以用作军团菌分离培养标本的运送，又可使军团菌在运送过程中增殖，其是在军团菌BCYE α-基础液中添加了军团菌选择成分：甘氨酸(Glycine)、万古霉素(vancomycin)、多粘菌素B(polymixin B)和放线菌酮(Cycloheximide)。

所述的军团菌运送增菌培养基，-基础液中添加了如下重量份的成分：

万古霉素 0.0005～0.0015，

多粘菌素B 0.005～0.012，

放线菌酮 0.005～0.012，

甘氨酸 2.0～4.0。

所述的军团菌运送增菌培养基，其包括的组份重量份数如下：

基础液：

酵母粉 6～15，

ACES 6～15，

a-酮戊二酸 0.5～1.5，

焦磷酸铁 0.2～0.3，

氨基酸蛋白液：

甘氨酸 2.0～4.0，

L-半胱氨酸 0.3～0.7，

白蛋白 0.05～0.15，

抗生素液：

万古霉素 0.0005～0.0015，

多粘菌素B 0.005～0.012，

放线菌酮 0.005～0.012；

制备步骤包括如下：

(1)基础液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水900～1000份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后在121℃蒸汽中灭菌15min；将焦磷酸铁溶于8～12份水中，过滤灭菌；将灭菌后的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸溶液冷却至55℃，加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；

(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入25～35份水进行溶解，过滤灭菌；

(3)将万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入8～12份水中进行溶解，过滤灭菌；

(4)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中混匀。

(5)无菌操作分装培养基，5ml/支，2℃-8℃，保存，有效期6个月。

本发明在包括以酵母粉、ACES(N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸)缓冲剂、α-酮戊二酸、可溶性焦磷酸铁以及L-半胱氨酸等军团菌生长所必需的营养成分的基础配方上，添加选择性甘氨酸(Glycine)以及万古霉素(vancomycin)、多粘菌素B(polymixin B)和放线菌酮(Cycloheximide)等抗生素，以抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，使军团菌培养的临床标本在运送过程中减少杂菌污染、但保持军团菌适当生长，从而提高军团菌的分离培养阳性率。在BCYEα-基础培养基中，添加的万古霉素(vancomycin)、多粘菌素B(polymixin B)和放线菌酮(Cycloheximide)可抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，但对军团菌并不影响其生长繁殖，从而提高军团菌的分离培养阳性率。

总的来说，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)调整选择性抗生素浓度，提高对非军团菌属及杂菌类的抑制能力，降低对军团菌种的抑制性，从而提高了对军团菌属分离培养阳性率；(2)采集的临床标本(痰、支气管抽出物等)直接种人运送增菌培养基在室温(25℃)或保温箱(35℃)中运送，非军团菌属细菌受抑制，军团菌属可在运送过程中生长，提高军团菌分离培养阳性率，填补了一项军团菌运送增菌培养基的国内外空白。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明军团菌的运送增菌培养基进行详细的说明。

实施例1

军团菌运送增菌培养基，其包括的组份重量份数如下：

基础液：

酵母粉 6，

ACES 6，

a-酮戊二酸 0.5，

焦磷酸铁 0.2，

氨基酸蛋白液：

甘氨酸 2.0，

L-半胱氨酸 0.3，

白蛋白 0.05，

抗生素液：

万古霉素 0.0005，

多粘菌素B 0.005，

放线菌酮 0.005。

实施例2

军团菌运送增菌培养基，其包括的组份重量份数如下：

基础液：

酵母粉 15，

ACES 15，

a-酮戊二酸 1.5，

焦磷酸铁 0.3，

氨基酸蛋白液：

甘氨酸 4.0，

L-半胱氨酸 0.7，

白蛋白 0.15，

抗生素液：

万古霉素 0.0015，

多粘菌素B 0.012，

放线菌酮 0.012。

实施例3

军团菌运送增菌培养基，其包括的组份重量份数如下：

基础液：

酵母粉 8～12，

ACES 8～12，

a-酮戊二酸 0.8～1.2，

焦磷酸铁 0.24～0.28，

氨基酸蛋白液：

甘氨酸 2.5～3.5，

L-半胱氨酸 0.4～0.6，

白蛋白 0.08～0.12，

抗生素液：

万古霉素 0.0008～0.0012，

多粘菌素B 0.008～0.010，

放线菌酮 0.008～0.010。

实施例4

军团菌运送增菌培养基，其包括的组份重量份数如下：

基础液：

酵母粉 10，

ACES 10，

a-酮戊二酸 1.0，

焦磷酸铁 0.25，

氨基酸蛋白液：

甘氨酸 3.0，

L-半胱氨酸 0.5，

白蛋白 0.1，

抗生素液：

万古霉素 0.001，

多粘菌素B 0.008，

放线菌酮 0.008。

以上实施例的制备步骤包括如下：

(1)基础液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水900～1000份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后在121℃蒸汽中灭菌15min；将焦磷酸铁溶于8～12份水中，过滤灭菌；将灭菌后的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸溶液冷却至55℃，加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液中混匀；

以上实施例优选的制备步骤包括如下：

(1)基础液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水950份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后在121℃蒸汽中灭菌15min；将焦磷酸铁溶于10份水中，过滤灭菌；将灭菌后的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸，冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；

(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入30份水进行溶解，过滤灭菌；

(3)将万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入10份水中进行溶解，过滤灭菌；

(4)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中混匀；

以上所述的过滤灭菌可以是在在121℃蒸汽中灭菌15min。

本发明军团菌运送增菌培养基在BCYE α-基础培养基中添加了军团菌选择性成分：甘氨酸(Glycine)、万古霉素(vancomycin)、多粘菌素B(polymixinB)和放线菌酮(Cycloheximide)。本培养基既可以当作军团菌增菌培养基使用，防止培养过程中，其他细菌的污染，另一方面又可作为军团菌临床标本运送培养基应用，其中添加的抗生素可以抑制杂菌生长，提高军团菌分离培养阳性率。

在军团菌运送增菌培养基中，添加选择性抗生素可抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，从而提高军团菌分离培养阳性率。其中甘氨酸(glycine)对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为1280μg/ml和160μg/ml；对痢疾杆菌的最低抑菌浓度为640μg/ml，对伤寒杆菌的最低抑菌浓度分别为1280μg/ml和640μg/ml，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为1280μg/ml；万古霉素(vancomycin)对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用；多粘菌素B(polymixin B)对绿脓杆菌和其他革兰阴性杆菌有明显抑制作用；放线菌酮(Cycloheximide)对霉菌类有明显抑制作用。

将检测样品(痰、支气管抽出物等)约1ml，加入该运送增菌培养基中，于室温(25℃)或保温箱(35℃)中运送，经18h～24h，一般情况下非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长受抑制，而军团菌仍可生长繁殖。

取运送增菌培养物0.1ml，接种军团菌选择性分离培养基(BCYE α-DGVPC)进行军团菌常规分离培养，置5％CO2孵育箱48-72h，也可培养至1周，观察菌落形态。根据菌落形态和颜色，鉴定和区分军团菌属目标菌。本发明经临床应用考证，基对军团菌分离培养样品，在运送过程中可减少杂菌污染，而且能保持军团菌适当生长，从而提高军团菌的分离培养阳性率，填补了一项军团菌运送增菌培养基的国内外空白。

临床试验：

应用本发明军团菌运送增菌培养基分别在两个医院(A、B)进行临床应用试验，同时和分子生物学检测方法比较：A医院采集275例呼吸道感染病人的痰液标本1ml，放置本运送增菌培养基中，室温(25℃)运送，再行分离培养，结果分离到1株嗜肺军团菌，这是我国近10多年来非常罕见的从临床痰液标本中分离到的嗜肺军团菌；B医院采集325例呼吸道感染病人的痰液标本1ml，未用本运送培养基处理、直接进行分离培养，未检出军团菌阳性菌株。通过临床实际应用表明，该军团菌运送增菌培养基确实有利于军团菌的分离培养。

Claims

1.军团菌运送增菌培养基，其特征在于：其包括的组份重量份数如下：

基础液：

氨基酸蛋白液：

甘氨酸2.0～4.0，

L-半胱氨酸0.3～0.7，

白蛋白0.05～0.15，

抗生素液：

万古霉素0.0005～0.0015，

多粘菌素B0.005～0.012，

放线菌酮0.005～ 0.012；

制备步骤包括如下：

（1）基础液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水900～1000份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后在121℃蒸汽中灭菌15 min；将焦磷酸铁溶于8～12份水中，过滤灭菌；将灭菌后的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸溶液冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液中混匀；

（2）将甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入25～35份水进行溶解，过滤灭菌；

（3）将万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入8～12份水中进行溶解，过滤灭菌；

（4）将（1）步骤的溶液加入（2）步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入（3）步骤得到的溶液中混匀。

2.如权利要求1所述的军团菌运送增菌培养基，其特征在于：其包括的组份重量份数如下：

基础液：

氨基酸蛋白液：

甘氨酸2.５～３.５，

L-半胱氨酸0.４～0.６，

白蛋白0.0８～0.1２，

抗生素液：

万古霉素0.000８～0.001２，

多粘菌素B0.00８～0.01０，

放线菌酮0.00８～ 0.01０。

3.如权利要求2所述的军团菌运送增菌培养基，其特征在于：其包括的组份重量份数如下：

基础液：

氨基酸蛋白液：

甘氨酸3.0，

L-半胱氨酸0.5，

白蛋白0.1，

抗生素液：

万古霉素0.001，

多粘菌素B0.008，

放线菌酮0.008。

4.如权利要求1所述的军团菌运送增菌培养基，其特征在于：制备步骤包括如下：

（1）基础液中的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水950份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后在121℃蒸汽中灭菌15 min；将焦磷酸铁溶于10份水中，过滤灭菌；将灭菌后的酵母粉、ACES和α-酮戊二酸，冷却至55℃，加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；

（2）将甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入30份水进行溶解，过滤灭菌；

（3）将万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入10份水中进行溶解，过滤灭菌；