CN101100650A - 一种军团菌培养基及其配制方法以及军团菌试剂盒的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及军团菌检测技术领域，尤其是一种军团菌培养基及其配制方法、利用该培养基培养制成的军团菌试剂盒的使用方法。本发明的军团菌培养基是在GVPC琼脂的原配方中加入阿拉伯树胶和碳黑，形成新的质优价廉的军团菌培养基。本发明的方法简单、使用方便、产品成本低廉；可以广泛使用于军团菌的检验等方面。
Description
技术领域
本发明涉及军团菌检测技术领域，尤其是一种军团菌培养基及其配制方法、利用该培养基培养制成的军团菌试剂盒的使用方法。
背景技术
1977年在美国首次发现了军团菌及其引起的军团病。此病主要表现为严重肺炎，并有较高的死亡率；目前在美国占细菌性肺炎发病数的第三位，因此为世界各国所高度重视；我国政府卫生部也十分关心军团病的防治工作。但本病难以依靠临床表现和各种临床检查做出诊断，而几乎完全依赖实验室的病原检查方法做出确诊，因而很容易漏诊、误诊以至于耽误病人的治疗和预防。因此准备好并能充分供应，能够被广大防病医疗单位接受和常规使用的军团病检验产品极为重要。军团菌检验产品基本可分两类：
(1)从临床标本中培养检出军团菌；由军团菌培养制备出来的抗原和抗体产品如血清学微量凝集试剂盒、军团菌分型诊断血清试剂盒和军团菌尿抗原金标层析条试剂盒、直接免疫荧光技术等，都是当前军团病诊断的主流产品。
(2)军团菌分子生物学诊断产品：如核酸探针、聚合酶链反应技术等。但此类试验因为特异性、敏感性、价格等问题，目前仍仅作为辅助诊断方法，故未纳入本系列产品的范围。
由于军团菌的生长需要特殊的原料——半胱氨酸、可溶性铁和多种昂贵的进口试剂等，同时影响其生长的因素也很多，所以此类军团菌检验产品的制造要求和成本都很高，故国内至今仅有零星的产品供应，且不仅质量难以保证也价格不菲；而进口产品常常缺货，其价格更加昂贵，故至今国内包括北京、上海等大城市的绝大多数疾控中心和医院，都未能常规开展此类检验项目，从而使此问题成为阻碍我国军团病防治和研究工作进一步开展的瓶颈。
发明内容
本发明解决的技术问题之一在于提供一种有效、使用方便的军团菌培养基及其配制方法。
本发明解决的技术问题之二在于提供一种军团菌检验试剂盒的使用方法。
本发明解决的技术问题之一是通过如下技术方案实现的：主要成分包含有酵母、ACES、琼脂、可溶性焦磷酸铁、酮戊二酸、阿拉伯树胶、活性炭、碳黑、KOH、L-半胱氨酸、万古霉素、多黏菌素B、放线菌酮。
各成分的含量比为：酵母10克、ACES10克、琼脂15克、可溶性焦磷酸铁0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯树胶3克、活性炭1.5克、碳黑2克、KOH2.8克、L-半胱氨酸0.4克、万古霉素1毫升、多黏菌素B8万单位、放线菌酮80毫克。
按如下方法进行配制：
先将酵母粉10克、ACES 10克、琼脂粉15克、可溶性焦磷酸铁0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯树胶3克、活性炭1.5克、碳黑2克、KOH 2.8克和去离子水1000毫升充分混匀后并标定pH为6.9；
然后高压121℃，取出冷却到约50℃；
加入经0.22μ滤膜过滤的含L-半胱氨酸0.4克、万古霉素1毫克、多黏菌素B 8万单位、放线菌酮80毫克的5毫升液体；
再次充分混匀后倾倒平板即可。
本发明解决的技术问题之二是通过如下技术方案实现的：
按如下步骤进行：
A、准备待测血清：采集被检者的血液1-2毫升；分离血清后，取血清200微升加入1支清洁小试管中，再加入专用稀释液600微升混匀使成为1/4稀释的待测血清；
B、进一步稀释血清：取清洁稀释用塑条1条或清洁小试管6支，于塑条上的6个孔或6个小试管中，用加液器各加入专用稀释液200微升；然后再以待测血清顺次于前5孔或管中做对倍稀释，弃去最后的200微升稀释血清，使各孔或管中200微升被检血清的稀释度为1/8，1/16，1/32，1/64和1/128；最后1孔(或管)为无血清对照；
C、用装上1支200微升吸头的玻璃套管，于1块清洁的96(V形)孔板中，先加1滴(约25微升)专用稀释液于对照排各孔，然后按低稀释度到高稀释度的顺序，再分别加1滴于相应稀释血清排各孔；
D、分别将装有1支200微升吸头的染色抗原瓶(7种)摇匀并倒置，于各孔中滴加1滴染色抗原；最后在板上加一块玻璃盖并置于36±1℃处，第二天取出观察结果。
如准备待测血清步骤中使用3倍稀释液时，可取1份稀释液加2份灭菌蒸馏水或去离子水并混匀。
本发明改进的培养基效果如下表：
军团菌*在改进配方GVPC琼脂(36℃4日)中的生长情况
| GVPC琼脂 | 嗜肺1型菌* | 嗜肺5型菌* | ||
| 菌落数** | 菌落大小 | 菌落数** | 菌落大小 | |
| 改进配方原配方对照 | 162.561.3 | 2.8+/-0.41.75+/-0.3 | 189.293.1 | 2.7+/-0.61.7+/-0.4 |
*LP1 Knoxville(ATCC 33153)，LP6 Chicago 2(ATCC 33215)
**三次实验的均数；LP1 X2＝4.24，LP6 X2＝3.94 P≤0.05
在本发明以上工作的基础上，为填补国内空白，首次研制和初步建立了除分子生物学以外的几乎完整并可长期稳定供应的军团菌军团病检验产品；如各种规格的军团菌培养基、微量凝集试剂盒、分型诊断血清试剂盒和军团菌尿抗原金标条等；并首次根据市场用户的不同需要，创新性地设计和制备了《军团菌成套鉴定试验试剂盒》《军团菌环境水标本培养试剂盒》《军团菌病人标本培养试剂盒》等。如此可以不仅进一步方便了用户，也提高了工作质量。另外，在保证原有效果的前提下，也首次在《军团菌血清学微量凝集试剂盒》等多种试剂盒的操作方法中，创新性地少用或不用定量吸管或加液枪而大幅简化了方法，从而显著提高效率，有利于方法的进一步推广。特别是《军团菌尿抗原金标层析条试剂盒》是当前最简便、有效、快速因而最有市场前景的军团病诊断产品。
具体实施方式
本发明的军团菌培养基是在GVPC琼脂的原配方中加入阿拉伯树胶和碳黑，以及用自制的ACES取代进口ACES，形成新的质优价廉的军团菌培养基。新配方和配制方法为：酵母粉10克、ACES 10克、琼脂粉15克、可溶性焦磷酸铁0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯树胶3克、活性炭1.5克、碳黑2克、KOH 2.8克和去离子水1000毫升充分混匀后并标定pH为6.9；然后高压121℃、取出冷却到约50℃；再加入经0.22μ滤膜过滤的含L-半胱氨酸0.4克、万古霉素1毫克、多黏菌素B8万单位、放线菌酮80毫克的5毫升液体；再次充分混匀后倾倒平板。
新的培养基上军团菌在漆黑的背景下发育良好，呈微蓝灰色饱满闪光的菌落，在菌落特色、菌落大小和菌落数等方面，均明显优于原有配方配制的培养基；这样就能够为建立我国自己的质优价廉的军团菌系列检验产品打下基础。
此外，本发明参照军团菌检验的国家标准，重点研制了更适合我国国情的简化微量凝集试验试剂盒；其使用结果稳定，操作方便。
该整套的试剂盒主要包括：
1、军团菌血清学微量凝集染色抗原
A、中套I(嗜肺1-10，米克戴德，博杰曼) 12瓶(每瓶4毫升)
B、中套II(嗜肺1-6，米克戴德) 7瓶(每瓶4毫升)
C、小套(嗜肺1和嗜肺6) 2瓶(每瓶4毫升)
2、军团菌阳性对照血清(抗嗜肺1)
3、专用稀释液：1-2种，单倍(1×)和3倍(3×)浓度。
4、96孔板(V形孔)附玻板盖。
以中套II为例，在使用本发明的试剂进行临床菌和环境菌检测时；
1、先准备测血清：采集被检者的血液1-2毫升。分离血清后，取血清200微升加入1支清洁小试管(自备)中，再加入专用稀释液600微升混匀(如使用3倍稀释液时，可取1份稀释液加2份灭菌蒸馏水或去离子水并混匀，下同)，使成为1/4稀释的待测血清。
2、进一步稀释血清：取清洁稀释用塑条1条或清洁小试管6支(自备)，于塑条上的6个孔或6个小试管中，用加液器各加入专用稀释液200微升(根据实际需要可增减，下同)；然后再以待测血清顺次于前5孔(或管)中做对倍稀释(反复抽吸4次)，弃去最后的200微升稀释血清，使各孔(或管)中200微升被检血清的稀释度为1/8，1/16，1/32，1/64和1/128。最后1孔(或管)为无血清对照。
3、用装上1支200微升吸头的玻璃套管，于1块清洁的96(V形)孔板中，先加1滴(约25微升)专用稀释液于对照排孔，然后按低稀释度到高稀释度的顺序，再分别加1滴于相应稀释血清排孔。
4、分别将装有1支200微升吸头的染色抗原瓶(7种)摇匀并倒置，滴加1滴染色抗原。最后在板上加一块玻璃盖并置于36±1℃处，第二天(16-24小时)取出观察结果。
判断结果的标准是(++以上为阳性)：
++++：蓝色菌细胞凝集块铺于孔底，边缘清晰；
+++：蓝色菌细胞凝集块铺于孔底，边缘不清晰；
++：部分菌细胞凝集，边缘不清晰；
+：少数细菌凝集，中心未凝集的细菌堆聚形成蓝色较深的小点
-：全部未凝集，中心呈蓝色小点。
以上是对本发明较佳实施例的描述，但并非对本发明保护范围的限制；凡依前述说明，本领域技术人员可得之等效技术方案，皆属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1、一种军团菌培养基，其特征在于：主要成分包含有酵母、ACES、琼脂、可溶性焦磷酸铁、酮戊二酸、阿拉伯树胶、活性炭、碳黑、KOH、L-半胱氨酸、万古霉素、多黏菌素B、放线菌酮。
2、根据权利要求1所述的军团菌培养基，其特征在于：各成分的含量比为：酵母10克、ACES10克、琼脂15克、可溶性焦磷酸铁0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯树胶3克、活性炭1.5克、碳黑2克、KOH2.8克、L-半胱氨酸0.4克、万古霉素1毫升、多黏菌素B8万单位、放线菌酮80毫克。
3、一种权利要求1所述的军团菌培养基的配制方法，其特征在于：按如下方法进行配制：
先将酵母粉10克、ACES 10克、琼脂粉15克、可溶性焦磷酸铁0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯树胶3克、活性炭1.5克、碳黑2克、KOH 2.8克和去离子水1000毫升充分混匀后并标定pH为6.9；
然后高压121℃，取出冷却到约50℃；
加入经0.22μ滤膜过滤的含L-半胱氨酸0.4克、万古霉素1毫克、多黏菌素B 8万单位、放线菌酮80毫克的5毫升液体；
再次充分混匀后倾倒平板即可。
4、一种利用权利要求1所述的军团菌培养基培养制成的军团菌试剂盒的使用方法，其特征在于：按如下步骤进行：
A、准备待测血清：采集被检者的血液1-2毫升；分离血清后，取血清200微升加入1支清洁小试管中，再加入专用稀释液600微升混匀使成为1/4稀释的待测血清；
B、进一步稀释血清：取清洁稀释用塑条1条或清洁小试管6支，于塑条上的6个孔或6个小试管中，用加液器各加入专用稀释液200微升；然后再以待测血清顺次于前5孔或管中做对倍稀释，弃去最后的200微升稀释血清，使各孔或管中200微升被检血清的稀释度为1/8，1/16，1/32，1/64和1/128；最后1孔(或管)为无血清对照；
C、用装上1支200微升吸头的玻璃套管，于1块清洁的96(V形)孔板中，先加1滴(约25微升)专用稀释液于对照排各孔，然后按低稀释度到高稀释度的顺序，再分别加1滴于相应稀释血清排各孔；
D、分别将装有1支200微升吸头的染色抗原瓶(7种)摇匀并倒置，于各孔中滴加1滴染色抗原；最后在板上加一块玻璃盖并置于36±1℃处，第二天取出观察结果。
5、根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于：如准备待测血清步骤中使用3倍稀释液时，可取1份稀释液加2份灭菌蒸馏水或去离子水并混匀。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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