CN101182568A - 一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法 - Google Patents

Abstract

一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法，涉及细菌鉴定技术，特别是鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的检测方法。先将待检测样品用PBS预处理；再用含抗生素、生长促进剂和鸡血清浓度为10％的布氏肉汤进行选择性增菌；经一次性PCR扩增弯曲菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌基因片段后；进行选择性培养基分离，最后特异性生化鉴定。本发明能形成大量的基因复制片段，方便比较，一次就能鉴定是否为空肠弯曲菌、结肠弯曲菌，较经典方法的细菌分离、鉴定方法快速、准确。

Description

一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的方法

技术领域

本发明涉及细菌鉴定技术，特别是鉴定空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)的检测方法。

背景技术

弯曲菌是全球范围内胃肠炎的主要病因，是主要的食源性病原菌，能引起散发性和地方流行性的胃肠炎爆发，特别是在缺陷性的个体，如癌症病人、艾滋病病人、糖尿病人、小孩和老人等，5岁以下儿童的发病率最高，另外，格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)是特定血清型空肠弯曲菌感染后最严重的并发症，可以导致呼吸肌麻痹而死亡，因此，弯曲菌也是全球公共卫生关注的重点。近些年来，弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势，已成为最常见的、急性细菌性肠道传染病，据美国国家食品网的监测，弯曲菌是发病率最高的病原菌，其病例数已超过李斯特菌病、沙门氏菌病和志贺氏菌病。使人致病的弯曲菌中99％的是空肠弯曲菌，其次是结肠弯曲菌，其它弯曲菌偶尔致病。

空肠弯曲菌和结肠弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是检测的项目，有重要的社会、经济意义。弯曲菌是兼性微需氧菌，培养条件苛刻，常规培养需要丰富的营养条件和稳定适宜的气体条件，国内外的研究起步较晚，其常规培养方法还有待于进一步完善。传统的弯曲菌检测主要依靠生化试验和血清凝集试验。由于空肠弯曲菌、结肠弯曲菌具有对培养基营养要求高、培养条件苛刻，对氧气都比较敏感，只能在低氧环境中生长，培养周期较长等特点，采用不同的检验程序、方法，报告结果差异较大，且确诊检验结果至少需10～20天，检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷。因此，快速、准确、简便的细菌检测方法将是发展的方向。建立一种能同时快速检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否被空肠弯曲菌、结肠弯曲菌污染的检测方法。

本发明包括以下步骤：

1)将待检测样品用PBS预处理；

2)用含抗生素、生长促进剂和鸡血清浓度为10％的布氏肉汤进行选择性增菌；

3)一次性PCR扩增弯曲菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌基因片段；

4)经选择性培养基分离，最后特异性生化鉴定。

由于单个疑似样本中的特征菌落数量极少，本发明对样本先进行选择性增菌，然后，再一次性同时对可能存在的弯曲菌属16S rRNA基因、空肠弯曲菌mapA基因和结肠弯曲菌CeuE基因进行扩增，形成大量的基因复制片段，方便比较，一次就能鉴定是否为空肠弯曲菌、结肠弯曲菌。本发明较经典方法的细菌分离、鉴定方法快速、准确。

进行PCR扩增时，弯曲菌基因片段引物为：

引物I：5’-[ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC]-3’；

引物II：5’-[GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T]-3’。

扩增空肠弯曲菌基因片段引物为：

引物III：5’-[CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG]-3’；

引物IV：5’-[GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A]-3’。

扩增结肠弯曲菌基因片段引物为：

引物V：5’-[AAT TGA AAA ATT GCT CCA ACT ATG]-3’；

引物VI：5’-[TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG]-3’。

另，本发明在选择性增菌时，增菌培养条件为42℃、摇床转速120rpm、培养环境为厌氧培养罐，内含微需氧产气袋。

在检测样品中，由于环境压力的作用，一些细菌能够进入存活不可培养状态(Viable nonculturable stage，VNC)，在这种状态下，细菌仍然具有代谢活力和感染性，在培养基中增殖困难，培养气体要求高，本发明较经典方法的细菌培养方法敏感度高、准确。

以上抗生素包括多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮。

以上生长促进剂包括丙酮酸、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁。

为了进一步提高检测的准确性，本发明还采用了对扩增的特定基因片段的纯化：对多重PCR扩增阳性的样品增菌液，采用由头孢哌酮和两性霉素B组成的抗生素的CCDA(Campylobacter blood-free selective agar base)培养分离纯化，分离培养条件为42℃、培养环境为浓度12％的二氧化碳培养箱。

另外，本发明对多重PCR扩增阳性的样品，采用含抗生素的CCDA培养基分离纯化，氧化酶和马尿酸钠水解试验鉴定，分离培养条件为42℃、培养环境为二氧化碳培养箱(CO₂浓度为12％)。本发明较经典方法的细菌培养、分离和鉴定方法简便、特异、准确。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图。

图2为待检菌在氧化酶试纸上的显色照片图。

图3为待检菌马尿酸钠水解后显色照片图。

具体实施方式

一、样品采集、样品预处理和选择性增菌

用灭菌棉拭采集样品或直接将样品插入Carry-Blair运送培养基中，于24h内送检，样品采集遵循统计学要求。

从运送培养基中取出样品，置于含500μl灭菌PBS(pH 7.2)的指形管中，充分浸透，20min，间隔振荡数次；取出棉拭，将浸液加至含9.5ml布氏肉汤(含抗生素混合液、生长促进剂和浓度10％的鸡血清)的试管中，置2.5L厌氧培养罐中，加入微需氧产气袋后立即密封厌氧罐，以42℃、转速120rpm的摇床振摇培养36h。

抗生素混合液：多粘菌素B 0.25g、甲氧苄氨嘧啶0.25g、利福平0.25g和放线菌酮2.5g，加入50ml 1∶1丙酮和蒸馏水混合液中充分溶解，用0.22μm滤膜过滤备用。

弯曲菌生长促进剂：丙酮酸、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁各称取3.125g，加入50ml蒸馏水充分溶解，用0.22μm滤膜过滤备用。

二、引物

根据弯曲菌属16S rRNA基因、空肠弯曲菌mapA基因和结肠弯曲菌CeuE基因高度保守序列设计三对特异性引物，上述三对特异性引物由上海博亚生物有限公司合成。预期扩增出的目的片段大小分为弯曲菌：857bp；空肠弯曲菌：589bp；结肠弯曲菌：462bp。

弯曲菌属：

引物I：5’-[ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC]-3’；

引物II：5’-[GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T]-3’。

空肠弯曲菌：

引物III：5’-[CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG]-3’；

引物IV：5’-[GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A]-3’。

结肠弯曲菌：

引物V：5’-[AAT TGA AAA ATT GCT CCA ACT ATG]-3’；

引物VI：5’-[TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG]-3’。

三、多重PCR

1、DNA模板制备：

取菌液0.5ml，8000rpm离心5min弃上清，加入100μl超纯水，用移液器将其混合均匀，隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，8000rpm离心5min，取上清进行PCR检测，或置于-20℃冰箱中备用。

2、多重PCR扩增：

①10×PCR Buffer(含1.5mmol/L Mg²⁺)：                2.5μl

②dNTP(2.5mmol/L)：                                 1.5μl

③引物

弯曲菌引物I、II(浓度为2.5μmol/L)：               各1.2μl

空肠弯曲菌引物III、IV(浓度为2.5μmol/L)：         各1.2μl

结肠弯曲菌引物V、VI(浓度为2.5μmol/L)：           各1.0μl

④待检测样品模板：                                2.0μl

⑤Taq聚合酶[北京天根生物工程公司普通PCR扩增酶     0.2μl

(5U/μl)]：

⑥灭菌超纯水：                                    7.0μl

总体积                                            20.0μl

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min后，12℃保存。

四、PCR扩增产物的鉴定

取PCR扩增产物8μl，点样于10g/L琼脂糖凝胶(含0.3mg/L溴化乙锭)，以1000bp Marker作为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于1倍的TAE电泳缓冲液中电泳2h，紫外线下观察产物，凝胶成像系统拍照。如图1所示。

图1中各列分别为：M.DNAMarker；1.空肠弯曲菌；2.结肠弯曲菌；3.空肠、结肠弯曲菌混合；4、5.沙门氏菌；6.大肠杆菌；7、8李斯特菌；9.空白对照。

五、PCR产物的序列鉴定

利用DNA回收试剂盒(大连宝生物公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行克隆(pGEM-T vector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合基因公司完成。

六、选择性培养基分离菌株

取一铂耳环PCR阳性增菌液，三区划线接种于含抗生素的CCDA平板，分离培养条件为42℃、培养环境为二氧化碳培养箱(CO₂浓度为12％)、培养时间为48h；挑取灰白或灰绿色的菌落3～5个，再次接种于含抗生素的CCDA平板，重复2～3次，直至得到单一纯培养菌落。

其中，含抗生素CCDA：按CCDA产品说明书配制培养基，高压灭菌后，冷却至50～60℃加入头孢哌酮(32mg/L)和两性霉素B(10mg/L)。

七、特异性生化鉴定

氧化酶实验：

取一张氧化酶试纸条置干净平皿内，用灭菌铂儿取待检菌涂于试纸条上，10s内观察结果，紫色或紫红色为阳性，无色或淡黄色为阴性。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌均呈紫色或紫红色。如图2所示。

马尿酸钠水解实验：

将细菌接种于1％的马尿酸钠0.4ml，37℃水浴2h，徐徐加入滴加3.5％茚三酮溶液0.2ml，应注意避免相混，放置10min后，观察结果，深紫色或紫色为阳性，蓝色或无色为阴性。如图3所示。

空肠弯曲菌马尿酸钠水解实验阳性(深紫色或紫色)，结肠弯曲菌马尿酸钠水解试验阴性(蓝色或无色)。

1％马尿酸钠溶液：马尿酸钠1g，99ml PBS，溶解并分装指形管，每管400μl，-20℃保存，备用。

3.5％茚三酮溶液：茚三酮3.5g，丙酮50ml，丁酮50ml，各成份混合，置棕色瓶，4℃保存，备用。

八、总结

本发明公开了一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验的新方法，先将待检测样品用PBS预处理，经含抗生素和生长促进因子的布氏肉汤选择性增菌，然后进行一次性PCR扩增弯曲菌属16S rRNA基因857bp、空肠弯曲菌mapA基因589bp和结肠弯曲菌CeuE基因462bp，电泳鉴定，DNA序列测定结果与报道的三种基因序列一致。经含抗生素的CCDA选择性培养基分离，最后氧化酶和马尿酸钠特异性生化鉴定。

Claims (8)

1.一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将待检测样品用PBS预处理；

2)用含抗生素、生长促进剂和鸡血清浓度为10％的布氏肉汤进行选择性增菌；

3)一次性PCR扩增弯曲菌、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌基因片段；

4)经选择性培养基分离，最后特异性生化鉴定。

2.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于PCR扩增弯曲菌基因片段引物为：

引物I：5’-[ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC]-3’；

引物II：5’-[GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T]-3’。

3.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于PCR扩增空肠弯曲菌基因片段引物为：

引物III：5’-[CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG]-3’；

引物IV：5’-[GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A]-3’。

4.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于PCR扩增结肠弯曲菌基因片段引物为：

引物V：5’-[AAT TGA AAA ATT GCT CCA ACT ATG]-3’；

引物VI：5’-[TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG]-3’。

5.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于选择性增菌时，增菌培养条件为42℃、摇床转速120rpm、培养环境为厌氧培养罐，内含微需氧产气袋。

6.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于所述抗生素包括多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶、利福平和放线菌酮。

7.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于所述生长促进剂包括丙酮酸、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁。

8.根据权利要求1所述空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的快速检验方法，其特征在于对多重PCR扩增阳性的样品增菌液，采用由头孢哌酮和两性霉素B组成的抗生素的CCDA培养分离纯化，分离培养条件为42℃、培养环境为浓度12％的二氧化碳培养箱。

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