CN103667194B

CN103667194B - 用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用

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Publication number: CN103667194B
Application number: CN201310658809.9A
Authority: CN
Inventors: 林菊生; 廖家智; 孙淑珍; 闫静君; 何星星; 常莹; 田德安; 赵秋; 但自立
Original assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2013-12-06
Filing date: 2013-12-06
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-12-06
Also published as: CN103667194A

Abstract

本发明属于动物细胞系领域，具体涉及用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用。该人类肝癌细胞系，其特征在于：所述的人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签。本发明提供的细胞系可以直接与双砷染料结合，持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程，更直观的表现乙肝病毒的特性。

Description

用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用

技术领域

本发明属于动物细胞系领域，具体涉及用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用。

技术背景

全球各个地区都有乙肝病毒感染者，亚洲地区、南太平洋地区、非洲、新西兰等地区乙型肝炎病毒HBV是危害人类健康的主要病原体之一。中国是乙型肝炎的高发区，预防和治疗乙型肝炎是一项艰巨而重要的工作。

乙型肝炎病毒属于嗜肝病毒DNA病毒科，只有很窄的宿主范围，如人乙肝病毒只能感染人或者灵长类的猩猩和狒狒，鸭乙肝病毒并不能自然传染给所有种系的家鸭。乙肝病毒的复制周期经动物体内和体外研究，尤其借鉴鸭乙肝病毒，阐述人乙肝病毒的复制周期。乙肝颗粒的外膜与宿主细胞接触，以前S蛋白附着和侵入细胞，但是病毒颗粒如何附着和侵入细胞还所知甚少，迄今的报道较多，但是无法真正确认。研究HBV感染人体的机制是解决问题的关键，但是由于缺乏敏感的细胞系和病毒可视化的方法，乙肝病毒如何进入细胞、如何在胞内运输、复制、表达及出胞等方面的研究仍然没有确切的方法证实。

乙肝病毒C基因区相当保守，但在慢性感染中，多数变异集中在C基因区，这可能是由于核心抗原和E抗原有共同的T细胞表位，在HBeAg消失后，HBcAg承受免疫活性施加的选择压力，而C基因区的变异与基因型有关，所以C基因区变异有地理学的特点。我国的慢性乙肝病人常集中在AA48-60、AA84-101、AA147-155这几个序列中。

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，提供了可以分泌可视化病毒颗粒的人类肝癌细胞系，此人类肝癌细胞系可以持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程。

本发明是通过以下技术方案实现的：

编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，所述真核表达载体命名为pcHBV1.3-TC，所述真核表达载体以pcDNA3.1+为基本骨架，所述的乙肝病毒真核表达载体含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上还同时含有TC标签。

进一步地，所述真核表达载体为：

真核表达载体pcHBV1.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759个碱基后插入TC标签，或；

真核表达载体pcHBV1.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906个碱基后插入TC标签，或；

真核表达载体pcHBV1.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990个碱基后插入TC标签，或；

真核表达载体pcHBV1.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218个碱基后插入TC标签。

编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体的方法，包括步骤如下：

1)1.3倍乙肝病毒基因的获得

以含1.3倍乙肝病毒基因的环形载体质粒pTHBV1.3为模板设计引物，扩增pTHBV1.3质粒上从5675位点顺时针方向到3270位点的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段；

2)1.3倍乙肝病毒基因真核表达载体的构建

根据酶切位点分析，结合pcDNA3.1+真核表达载体的限制性酶切位点图谱，选用HindIII和NotI两个限制性内切酶对1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表达载体进行双酶切，分别回收酶切的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化感受态细胞，酶切鉴定，载体命名为pcHBV1.3；

3)pcHBV1.3-TC真核表达载体的构建

利用SOE-PCR技术，设计引物并将TC标签设计入引物内，进行PCR，得到编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表达载体，命名为pcHBV1.3-TC。

将构建的乙肝病毒基因真核表达载体转染到人类肝癌细胞中，得到人类肝癌细胞系，

人类肝癌细胞系，该人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签。

进一步地，所述人类肝癌细胞系包括四种人类肝癌细胞系，其中：

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC2，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第2位氨基酸后插入TC标签，或；

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC49，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第49位氨基酸后插入TC标签，或；

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC79，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第79位氨基酸后插入TC标签，或；

一种人类肝癌细胞系，命名为：HepG/TC155，简称：TC155，其中，将人类肝癌细胞系HepG/TC155于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏地址为：武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：C2013191

再进一步地，所述的TC标签是一个由四个半胱氨酸组成的发夹结构。

本发明还提供了一种利用人类肝癌细胞系在活细胞中示踪HBV的应用。

本发明的优点：

1、本发明提供的细胞系可以直接与双砷染料结合，持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程，更直观的表现乙肝病毒的特性。

2、本发明提供的细胞系所有细胞生长旺盛，和HepG2一般生物学性状一致，具有典型的上皮样形态，可以无限传代培养。

3、本发明提供的细胞系所有细胞可以稳定分泌乙肝病毒。

4、本发明提供的细胞系所有细胞分泌的乙肝病毒携带有TC标签，可以与双砷染料结合，持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程。

5、本发明在于提供4种可以稳定传代并且可以分泌乙肝病毒的细胞系，这4种细胞均可分泌的完整的乙肝病毒颗粒，并且分泌的乙肝病毒颗粒的核心蛋白上携带有四半胱氨酸(tetracysteine,TC)标签(核苷酸序列TGCTGCCCAGGATGCTGC)，TC标签是一个由4个半胱氨酸组成的发夹结构，这个结构可以特异地结合膜渗性双砷染料(ReAsH)。这种染料是一种荧光素类似物，含有两个氧苯砷环。当双砷染料与蛋白中融合的TC标签共价结合后，这些TC嵌合型蛋白就会特异地发出荧光。

6、本发明在乙肝核心蛋白的第2位，第49位，第79位，第155位氨基酸后面插入TC标签。

附图说明

图1为pTHBV1.3的载体示意图；

图2为pcDNA3.1+的载体示意图；

图3为pcHBV1.3-TC载体示意图；

图4为pcHBV1.3-TC-1的质粒双酶切电泳图。

图5为显微镜下观察HepG2细胞(*100)

图6为显微镜下观察稳转了pcHBV-TC的乙肝病毒的HepG2细胞系(*400)

图7为Western-blot检测HBcAg的表达。A图从左至右依次为HepG2细胞，TC2、TC49、TC79、TC155。B图为B-actin条带。

图8为细胞荧光染色。Anti-core为FITC标记的HBcAg，ReAsh为双砷标记的HBcAg，DAPI为DAPI标记的细胞核，Merge为两种标记HbcAg以及细胞核的叠加图。激光共聚焦显微镜下观察，图中所示比例尺为50um。

图9为PCR检测HBcAg mRNA的表达。

图10为电镜观察细胞上清中的乙肝病毒颗粒。图中所示比例尺为100nm。

图11为细胞内微管与病毒的共定位情况。A图感染1h后的情况，B图为感染4h后的情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施方式来对本发明做进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1

真核表达载体pcHBV1.3-TC-1构建

1、获得1.3倍乙肝病毒基因

1)设计引物，如下：

引物如下：

2)反应体系

轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。

3)PCR扩增

预变性95℃，5min

循环(30次)30s→95℃，30s→58℃，4min30s→72℃，

末段延伸72℃，5min

4)电泳回收纯化

(1)向CA2吸附柱中加入500μL平衡液，12000g离心30s，弃上清。

(2)将目的条带切下放入干净离心管中。

(3)加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴直到胶块溶解。

(4)将溶液转入CA2吸附柱中，12000g离心30s，弃上清。

(5)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，离心30s，弃上清。

(6)将吸附柱放回收集管，12000g离心2min。

(7)将吸附柱放入新的干净离心管，加入30μL洗脱缓冲液，12000g离心2min，所得溶液即为回收的DNA。

2、重组乙型肝炎HBV病毒基因正义表达载体构建

1)PCR回收产物酶切

在0.2mL离心管中加入以下试剂：

混匀后，稍稍离心，37℃温浴过夜，纯化产物

用限制性内切酶NotI酶切上述纯化产物

混匀后，稍稍离心，37℃温浴过夜，纯化回收。

2)酶切pcDNA3.1(+)质粒

混匀后，稍稍离心，37℃温浴过夜，纯化质粒产物

用限制性内切酶NotI酶切上述纯化产物

混匀后，稍稍离心，37℃温浴过夜，纯化回收质粒产物。

3)连接

(1)建立如下连接体系

4)感受态的细菌制备和转化及酶切鉴定

(1)E.coli DH5α感受态细胞的制备

参照分子克隆实验指南(黄培堂2002)

1)挑取保存于LB固体培养基上的E.coli DH5α单菌落接种于液体LB培养基(不加抗生素)中，37℃，300rpm，培养过夜。次日按1％的体积转入新鲜的液体LB培养基中，37℃，摇动培养1～2小时，至OD₆₀₀约为0.3。

2)将菌液转入10mL灭菌离心管中，于冰上放置10min。

3)4℃，5000rpm离心10min，去上清，回收菌体。

4)加入3～5mL冰预冷的0.1M CaCl₂，重悬菌体，冰上放置30min。

5)离心回收菌体，以0.4mL冰预冷的0.1M CaCl₂重悬菌体，所得即为感受态宿主菌。

(2)连接产物转化E.coli DH5α

参照分子克隆实验指南(黄培堂2002)

1)取连接产物5.0μL加入100μL感受态细菌中，冰浴30min。同时设对照：正对照，标准质粒DNA及感受态细菌；负对照，不加质粒的感受态细胞。

2)42℃热激90sec，立即放回冰浴中。5min后补加500mL LB液体培养基(无抗生素)，37℃，200rpm，摇动培养40～60min。

3)取200μL转化菌均匀涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上。

4)平板上液体被吸收后，倒置平板，于37℃培养约12小时，观察平板上细菌的生长情况。

(3)酶切鉴定

在0.2mL离心管中加入以下试剂：

混匀后，稍稍离心，37℃温浴3h，然后将酶切产物在1％琼脂糖跑胶检验。

5)测序

由上海生工完成对所构建载体的测序，得到pcHBV1.3质粒。

2、TC标签插入乙肝病毒核心蛋白的第2位氨基酸后面

1)质粒提取

提取pcHBV1.3质粒。

2)SOE-PCR扩增SOE片段1-1

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段1-1：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

预变性94℃，2min

循环(30次)10s→98℃，30s→50℃，90s→68℃，

末段延伸68℃，5min

(4)电泳回收纯化

1)向CA2吸附柱中加入500μL平衡液，12000g离心30s，弃上清。

2)将目的条带切下放入干净离心管中。

3)加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴直到胶块溶解。

4)将溶液转入CA2吸附柱中，12000g离心30s，弃上清。

5)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，离心30s，弃上清。

6)将吸附柱放回收集管，12000g离心2min。

7)将吸附柱放入新的干净离心管，加入30μL洗脱缓冲液，12000g离心2min，所得溶液即为回收的DNA为SOE片段1-1回收产物。

3)SOE-PCR扩增SOE片段2-1

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段2-1：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同上。

(4)电泳回收纯化

步骤同上，得到所得溶液即为回收的DNA为SOE片段2-1回收产物。

4)全长扩增：使TC标签插入在重组乙肝病毒核心蛋白的第2位，氨基酸后面

(1)设计引物

(2)反应体系

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

预变性94℃，2min

循环(30次)10s→98℃，30s→50℃，2min20s→68℃，

末段延伸68℃，5min

(4)电泳回收纯化

1)向CA2吸附柱中加入500μl平衡液，12000g离心30s，弃上清。

2)将目的条带切下放入干净离心管中。

3)加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴直到胶块溶解。

4)将溶液转入CA2吸附柱中，12000g离心30s，弃上清。

5)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，离心30s，弃上清。

6)将吸附柱放回收集管，12000g离心2min。

7)将吸附柱放入新的干净离心管，加入30μL洗脱缓冲液，12000g离心2min，所得溶液即为回收的DNA为插入了TC标签序列的乙肝病毒基因。

3、含有TC标签序列的乙肝病毒基因插入真核表达载体

1)酶切TC标签序列的乙肝病毒基因的回收产物

在0.2mL离心管中加入以下试剂：

37℃温育过夜。

2)酶切pcDNA3.1+质粒

在0.2mL离心管中加入以下试剂：

37℃温育过夜。

3)连接

37℃温育过夜。

4)感受态制备及转化：

步骤同上。

5)酶切鉴定

提取质粒进行酶切鉴定。

6)测序

由上海生工完成对所构建载体的测序，得到真核表达载体pcHBV1.3-TC-1。

真核表达载体pcHBV1.3-TC-2构建

其构建方法与上述的步骤基本相同，不同之处为TC标签插入乙肝病毒核心蛋白的第49位，步骤如下：

1)质粒提取

提取pcHBV1.3质粒，方法同实施例1。

2)SOE-PCR扩增SOE片段1-2

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段1-2：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同实施例1

(4)电泳回收纯化

步骤同实施例1

3)SOE-PCR扩增SOE片段2-2

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段2-2：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

同上

(4)电泳回收纯化

同上，得到所得溶液即为回收的DNA为SOE片段2-2回收产物。

4)全长扩增：使TC标签插入在重组乙肝病毒核心蛋白的第49位，氨基酸后面

(1)设计引物

(2)反应体系

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同实施例1.

(4)电泳回收纯化

步骤同实施例1，所得溶液即为回收的DNA为插入了TC标签序列的乙肝病毒基因。

3、含有TC标签序列的乙肝病毒基因插入真核表达载体

步骤同实施例1。

由上海生工完成对所构建载体的测序，得到真核表达载体pcHBV1.3-TC-2。

真核表达载体pcHBV1.3-TC-3构建

其构建方法与上述的步骤基本相同，不同之处为TC标签插入乙肝病毒核心蛋白的第79位，步骤如下：

1)质粒提取

提取pcHBV1.3质粒，方法同实施例1。

2)、SOE-PCR扩增SOE片段1-3

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段1-3：取0.2mLPCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同实施例1

(4)电泳回收纯化

步骤同实施例1

3)SOE-PCR扩增SOE片段2-3

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段1：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

同上

(4)电泳回收纯化

同上，得到所得溶液即为回收的DNA为SOE片段2-3回收产物。

4)全长扩增：使TC标签插入在重组乙肝病毒核心蛋白的第79位，氨基酸后面

(1)设计引物

(2)反应体系

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同实施例1.

(4)电泳回收纯化

3、含有TC标签序列的乙肝病毒基因插入真核表达载体

步骤同实施例1。

由上海生工完成对所构建载体的测序，得到真核表达载体pcHBV1.3-TC-3。

真核表达载体pcHBV1.3-TC-4构建

其构建方法与上述的步骤基本相同，，不同之处为TC标签插入乙肝病毒核心蛋白的第155位，步骤如下：

1)质粒提取

提取pcHBV1.3质粒，方法同实施例1。

2)SOE-PCR扩增SOE片段1-4

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段1：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同实施例1

(4)电泳回收纯化

步骤同实施例1

3)SOE-PCR扩增SOE片段2-4

(1)设计引物

(2)反应体系

SOE片段1：取0.2mL PCR管，配制如下反应体系，配制4管：

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

同上

(4)电泳回收纯化

同上，得到所得溶液即为回收的DNA为SOE片段2-4回收产物。

4)全长扩增：使TC标签插入在重组乙肝病毒核心蛋白的第155位，氨基酸后面

(1)设计引物

(2)反应体系

轻弹混匀，瞬时离心；

(3)PCR扩增

步骤同实施例1.

(4)电泳回收纯化

3、含有TC标签序列的乙肝病毒基因插入真核表达载体

步骤同实施例1。

由上海生工完成对所构建载体的测序，得到真核表达载体pcHBV1.3-TC-4。

实施例2

以上述真核表达载体pcHBV1.3-TC-1为例，将其转染到人类肝癌细胞内1、细胞的培养：液氮罐取出冻存的TC2细胞，37℃水浴摇晃1分钟使之溶解，加入含5mL左右DMEM培养基的10mL离心管中，1000rpm/min离心5min，去上清，加入含10mL培养基的75mL培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中。

24h后换液一次，细胞大约长到90％融合后，按照1︰2进行传代。等到细胞足够多的时候做后续实验。

显微镜下观察细胞(*100)，发现细胞解冻后8h即可贴壁，24h后观察细胞，见细胞生长密集，呈团生长，胞质丰富，其内可见一个或者多个细胞核，核仁清晰(见图5)。

2、细胞转染：

(1)质粒提取；提取pcHBV1.3-TC-1的质粒，方法同上。

(2)铺六孔板；待细胞长到90％融合度时候铺六孔板，细胞密度以第二天转染时候达70％为宜。

(3)250μL无血清培养基OPTI-MEM稀释4.0ugDNA轻轻混匀室温放置5min。

(4)将10μL lipo2000加入到250μL血清培养基OPTI-MEM，轻轻混匀，室温放置5min。

(5)将混合稀释好的DNA和lipoprotein2000轻轻混合，室温放置20min使DNA-lipoprotein2000复合物形成。

(6)将六孔板内的旧培养基吸出，用OPTI-MEM洗两次，每孔加入1500μLOPTI-MEM。

(7)逐滴加入500μL DNA-lipoprotein2000复合物到每孔中轻轻混合。

(8)6h后更换含10％胎牛血清的DMEM。

3、单克隆细胞的筛选：

(1)转染后24小时，将生长培养基更换为含500μg/mLG418，10％FBS的筛选培养基进行培养。筛选第6天左右出现大量细胞凋亡，继续筛选到第二十天时，对存活细胞行96孔板有限稀释法挑选单克隆细胞株。

(2)96孔板有限稀释法挑选单克隆细胞的方法如下：

①0.25％胰酶消化细胞后制成细胞悬液，计数细胞后取适量悬液稀释为1000个细胞/mL；

②在96孔板中除A1孔外每孔加入100μL的筛选培养基；

③向A1孔中加入200μL稀释好的细胞悬液，混匀后吸取A1中100μL的悬液到B1孔中并混匀，然后从B1孔中吸取100μL悬液于C1孔中并混匀，依次向下，直至H1孔，最后将H1孔中液体吸弃100μL；

④将A1至H1每孔中加入额外100μL筛选培养基并混匀，将A1孔吸取100μL悬液于A2孔中并混匀，将A2孔中吸取100μL悬液于A3孔中并混匀，依次向左，直至A12孔，最后将A12孔中液体吸弃100μL。同法将B至H横排稀释，最后一竖排吸弃100μL；

⑤每孔补足200μL筛选培养基；

⑥将96孔板置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养。

⑦4～5天后检查单克隆生长的孔并做好标记，7～10天后单克隆生长到一定密度，将其转移至24孔板中继续培养。(如图6)

(四)ELISA检测上清中HBsAg的表达：

ELISA试剂盒购于上海科华公司，按照试剂盒说明进行。方法如下：

1、每孔加入待测标本75μL，设置阴性对照和阳性对照各2孔，加入阴性

对照或者阳性对照75μL，空白对照孔一个。

2、用封片纸覆盖反应板，37℃孵育60min

3、每孔加入50μL酶结合物。微孔振荡器上震荡10s

4、贴上封片纸，反应板置于37℃孵育30min

5、洗涤反应板5次。

6、每孔加入显色剂A和B各50μL，混匀，震荡10s。

7、覆盖上封片纸37℃孵育30min

8、所有的孔加入50μL终止液，混匀

9、酶标仪读数波长450nm，参考波长为630nm。

10、结果判断：

COV：cut-off value参考值

NCx：阴性对照平均OD值

NCn：阴性对照OD＝3

PC：阳性对照OD值

计算NCx：

NCx＝(NC₁+NC₂+NC₃)/3.若NCx<0,则按0计算

检测有效性：若NCx<＝0.100、PC>＝1.000，结果有效

显色剂空白：双波长读数，显色剂空白<＝0.0400,单波长读数，显色剂

空白<＝0.0800，则检测结果有效。

计算COV：COV＝NCx+0.100

11、结果解释：

S：待测样本OD值

S/COV：待测样本和COV的比值

当S/COV>＝1.0为阳性，反之为阴性

结果如下：

全部为阳性

(五)Western Blot检测HBV相关蛋白HBcAg的表达

1、细胞蛋白的提取：

(1)分别去稳定转染的细胞、HepG2细胞，丢弃培养基，PBS洗3遍。

(2)加入100μL细胞裂解液，加入1μL的PMSF，冰上裂解30min。每隔10min，震荡一次。

(3)12000rpm，4℃离心5min，取上清，转移至Ep管中，保存于-80℃。

2、蛋白含量的测定

(1)制作标准曲线

1)从-20℃取出1mg/mL BSA，室温融化后，备用。

2)取18个1.5mL离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

3)、按下表在各管中加入各种试剂。

4)混匀后，室温放置2min，在生物分光光度计上比色分析。

(2)检测样品蛋白含量

1)取足量的1.5mL离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1mL。室温放置30min后即可用于测蛋白。

2)取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100μL，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3)弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用无菌水洗一次。

4)取一管考马斯亮蓝加95μL0.15mol/L NaCl溶液和5μ待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

3、电泳：

配制12％分离胶，5％的浓缩胶。90V，3h

4、转膜：将PVDF膜剪至适合大小后，在无水甲醇中浸泡15s，然后将PVDF膜转移到转膜液中备用。撬开玻璃板，按照蛋白Marker所指示的条带，切下包括目的蛋白的分离胶。小心将切下的目的胶转移到滤纸上，用玻璃棒轻轻赶去气泡。PVDF膜做好标记后覆盖于胶上，然后再用玻璃棒赶去气泡。在膜上覆盖适当厚度的滤纸，盖上海绵垫后合气夹子。将转膜夹放入到转膜槽中，倒入转膜液，250mA，转0.5h到2h。

5、封闭：转膜结束后将PVDF膜在TBST液中漂洗3次，每次10min。漂洗结束后，将PVDF膜置于装有含5％牛奶的封闭液平皿中，将平皿放置到摇床上，室温下封闭2h。

6、孵育一抗：b-actin购于scanta公司，1︰1000比例稀释。HBcAg购于abcam公司，1︰300稀释。4℃摇床孵育过夜

7、孵育二抗：二抗用5％牛奶1︰5000稀释，孵育2h

8、曝光：将发光试剂等比例混合后滴与膜上，显影后曝光。(见图7)

(六)免疫荧光测定：

1、铺板：细胞密度待长到50％左右为宜

2、PBS洗3次，每次10min。

3、4％多聚甲醛固定20min。自然干燥

4、PBS洗3次，每次10min。

5、用0.1％Tritonx-100破膜，37℃水浴20min。

6、PBS洗3次，每次10min。

7、5％BSA封闭水浴30min，弃液不清洗。

8、滴加一抗(用BSA稀释)，鼠抗人核心抗原单克隆抗体，4℃过夜。

9、PBS洗3次，每次10min。

10、滴加FITC-抗鼠二抗，以及双砷试剂，避光孵育1h

11、PBS洗3次，每次10min。

12、封片观察(如图8)

(七)实时定量PCR鉴定HBcAg mRNA水平

1、提取细胞内的总RNA，具体方法如下：

1)倒出旧培养液，用PBS洗3次。

2)每孔加入500ul RNAiso Plus，轻轻晃动，使裂解液均匀铺在细胞表面。

3)用移液器反复吹打直到无明显沉淀后，将裂解液转移到离心管中。置于冰上静置10min。

4)向裂解液中加入约1/5体积的氯仿，盖紧管盖，振荡器上震荡混合，混合后溶液呈乳白色。

5)冰上静置10min。

6)4℃，12000g离心15min，从离心机中小心取出离心管，离心管中的溶液分3层：上层无色的水相上清液，中间是白色的蛋白层以及带有颜色的下层有机相。

7)吸取上清液转移到一个新的离心管中，如果吸到中间白色层的话重复步骤6，在重新吸取，一定要将白色层分离。

8)向离心管中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒离心管，室温下静置10min。

9)12000g，4℃离心10min。

10)RNA沉淀的清洗：下心弃去上清，切勿触及沉淀。每管加入1mL的75％乙醇(用DEPC水现配现用)，上下颠倒洗涤离心管管壁，注意一定要动作轻柔。

11)7500g，4℃离心5min后弃去上清。

12)RNA溶解：打开离心管管盖，于通风处室温干燥几分钟。加入适量的0.1％DEPC水溶解沉淀。

13)测定RNA浓度：Nanodrop可以测RNA的纯度和浓度。

2、逆转录

1)按照下列组分配制RT反应液：冰上进行：

2)逆转录反应条件：

37℃15min (反转录反应)

85℃5sec (反转录酶的失活反应)

4℃

得到的cDNA保存于-20℃

3、实时定量PCR。

用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，反应体系为20μL。

1)引物：

2)配制PCR反应体系(冰上进行，25μL体系)：每个样品做三个重复，以β-actin为内参。反应体系配制方法见下表：

3)PCR反应条件：

95℃for30s hold

95℃for5s hold

45cycles of:

95℃5s

60℃30s

4)数据分析：用2^-△△Ct法分析Real-Time PCR数据，以β-actin作为内参照，应用t检验进行样本间的比较。(如图9)

(八)电镜观察：

上清经差速离心后，在进行蔗糖密度梯度离心，取30％蔗糖层和40％蔗糖层，高速离心去除蔗糖成分，用PBS稀释后滴加于载玻片上电镜观察。(如图10)

实施例2

荧光HBV病毒体的制造

(1)细胞培养：

人肝癌细胞株TC2的常规培养，用含10％FBS、250ug/ml G418的DMEM培养液，于37℃、5％CO2、湿度饱和的条件下进行培养，2天更换1次培养液，视细胞生长情况传代。

(2)掺合了TC嵌合型核心蛋白的HBV病毒体的制造：

取稳定转染细胞，应用双砷标记试剂盒(LumioTM Red In-Cell Labeling Kits)进行标记。

收集稳转了pcHBV1.3-TC-1的TC2细胞上清，一部分经蔗糖密度梯度离心后，收集ELISA检测HBsAg的阳性片段，负染后EM观察，HepG2细胞上清作为阴性对照组，实验组电镜下可见绝大多数22nm小球形颗粒及少量杆状及42nmDane样颗粒(见图10)。EM结果显示TC标签的插入和双砷荧光染料与标签的共价结合对病毒的组装没有明显影响。

HepG2细胞稳定转染pcHBV1.3-TC后收集细胞上清，一部分用于HBsAg检测和HBV DNA的荧光定量检测，结果如下：ELISA检测HBsAg：阳性；HBV-DNA:1.849×10⁵；

四荧光HBV病毒体在活细胞中示踪HBV病毒的应用

细胞的转染：取对数生张期的HepG2细胞于6孔培养板中生长，待细胞密度达80％左右，将质粒pcHBV1.3-TC通过脂质体瞬时转染细胞。加入G418，筛选单克隆细胞。

双砷标记：稳定转染的单克隆细胞弃培养液，Hank's平衡盐溶液(HBSS)彻底润洗细胞三次，双砷荧光染料标记细胞中表达的TC嵌合型核心蛋白(37℃孵育30～60min)，标记完毕后，弃双砷标记液，用HBSS彻底润洗染色后的细胞以去除未结合的双砷染料，再用新的生长培养基继续常规培养细胞24h。

回收荧光HBV：培养24h后，收集细胞上清液，6％PEG8000沉淀、浓缩培养液中的病毒颗粒，最终得到含有荧光HBV的浓缩液。

取对数生长期的HepG2细胞，置于50mL培养瓶中，用含2％DMSO，10％FCS的DMEM培养液，在37℃、5％CO₂、湿度饱和的条件下培养6天，在此6天期间可视细胞生长情况传代，但始终用含2％DMSO的培养液培养细胞。6天后，将细胞转至24孔培养板中(内置灭菌盖玻片)培养，用于荧光HBV的感染实验。

取荧光HBV浓缩液50μL，同450μL培养液混匀后，代替24孔板中经DMSO处理过的HepG2细胞的培养液，37℃、5％CO₂、湿度饱和的条件下，孵育1～4h，让病毒感染细胞。

荧光病毒感染细胞1～4h后，弃感染液(内含病毒，妥善处理)，PBS清洗细胞3次，每次10min，4％多聚甲醛室温固定细胞10min。

PBS清洗细胞3次，每次10min，用DAPI工作液复染胞核，室温下孵育细胞5min，吸出DAPI染液，PBS清洗三次，每次10min。荧光显微镜下观察(如图8)

将DMSO处理过的HepG2细胞接种于6孔培养板中(内置灭菌玻片)，继续培养。

取荧光HBV浓缩液200μL，同1800μL培养液混匀后，于37℃下感染细胞1h或者4h。

病毒感染1h或者4h后，将细胞爬片小心挑出，龛于特制的30mm培养皿架中，培养液不换，立即送检。

感染1h、4h后HepG2细胞中荧光HBV的分布：经DMSO处理过的HepG2细胞同荧光HBV(红色)制备物孵育后，固定，DAPI(细胞核染料，蓝色)复染。共聚焦显微镜所拍照片显示了荧光HBV病毒体的亚细胞定位(见图11)。(标尺，10微米)。

Claims

1.人类肝癌细胞系，其特征在于：所述的人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签，TC标签是一个由四个半胱氨酸组成的发夹结构；其中，一种人类肝癌细胞系，命名为：TC2，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第2位氨基酸后插入TC标签，或；

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC155，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第155位氨基酸后插入TC标签。

2.一种权利要求1所述的人类肝癌细胞系，其特征在于：利用人类肝癌细胞系在活细胞中示踪HBV的应用。