CN109187970A - 一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测水产病害金标核酸试纸条。包括样品垫、含有探针Probe1‑AuNPs复合物的金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上分别吸附有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’。本发明开发以纳米金核酸探针作为标记物、通过薄膜层析手段检测灿烂弧菌，为灿烂弧菌的病害防控提供简便快捷有效的检测方法。

Description

一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法。
背景技术
灿烂弧菌（Vibrio splendidus）为弧菌科，弧菌属，是海水养殖动物的主要致病菌之一，可感染鱼类、棘皮动物、双壳贝类和甲壳类等宿主，导致水产养殖病害的发生。由其引发的刺参腐皮综合征能导致刺参嘴肿、厌食、体表溃烂、身体萎缩、排脏等病理反应，最终导致刺参死亡，给水产养殖带来巨大的经济损失。尽早检测与诊断该病原菌是有效预防该类疾病发生的有效手段，因此，研究开发快速准确的病原检测技术非常重要。
目前针对灿烂弧菌的检测方法主要有常规微生物检测技术、基于分子生物学的检测方法（PCR法、斑点杂交等）和基于免疫学的检测方法（荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验、胶体金标抗体的免疫层析试纸条等）。但这些方法存在诸多的缺点和不足：传统的病原菌培养及生理生化检测需要经过分离培养、形态观察、生理生化指标鉴定等，耗时耗力，精度和可靠性有限；基于分子生物学技术的检测方法虽然检测快速、灵敏度高，但容易出现假阳性，并且需要专业技术人员和特殊仪器设备，限制了其在水产养殖业的推广应用；基于免疫学的检测方法是较为简便的检测方法，但都离不开单克隆抗体的制备，而单克隆抗体制备工艺复杂、生产周期长，成为此检测手段开发的瓶颈。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供一种简便快捷的水产病原菌灿烂弧菌的金标核酸快速检测试纸条。
本发明提供一种快速检测水产病害金标核酸试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有探针Probe1-AuNPs复合物的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；
所述硝酸纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；
所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：
Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；
Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；
Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。
本发明还提供一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤包括：
（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将80-120 µL纳米金溶液和20-40 µL 的1-10μmol/L的probe1混匀反应，再加入混合液继续反应，经离心收集纳米金颗粒；用混合液漂洗、重悬后，最终得到Probe1-AuNPs复合物；
所述混合液是NaCl 和PB的混合液，所述NaCl 浓度为0.05 -0.50mol/L，所述PB浓度为8-12mmol /L；
（2）将步骤（1）制备的AuNPs-DNA复合物加到玻璃纤维上，制备金标垫；
（3）将处理后的硝酸纤维素膜上划上probe2作为检测线，另一端划上Probe1’作为质控线，检测线和质控线之间的间隔为5.0-6.0mm；
（4）按照如上述的金标核酸试纸条的结构黏贴好样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装完成后，在室温下用重物压实，裁切、密封干燥保存，得到金标核酸试纸条。
进一步的，所述步骤（1） PBS缓冲液的pH值为7.0。
本发明还提供一种快速检测水产病原菌灿烂弧菌的方法，所述方法包括：以分离病原菌灿烂弧菌裂解液或水产品病灶组织裂解液为样品滴加在如上述的金标核酸试纸条上进行检测，根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：
若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；
若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；
若质控线不显色，则检测无效。
有益效果：
本发明在胶体金标抗体检测试纸条的基础上开发了一种新型检测试纸条，打破了试纸条对抗体的依赖，以人工合成核酸探针代替抗体，基于核酸分子杂交技术，开发以纳米金核酸探针作为标记物，通过薄膜层析手段检测灿烂弧菌，为灿烂弧菌的病害防控提供简便、快捷、有效的检测方法。
本发明制备工艺简便，生产成本低廉，反应结果不需要借助特殊设备，用肉眼直接判定，能满足广大水产养殖户的需要，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为本发明试纸条的结构示意图；
图2为本发明试验例1中检测灵敏度的实验结果图；
图3为本发明试验例2中检测特异性的实验结果图。
具体实施方式
实施例1
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤包括：
（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将10 mL纳米金溶液浓缩成100 µL后加入30 µL 10 μmol/L的probe1, 充分混匀，在避光条件下，4℃静置12-24h，加入0.3mol /L NaCl 和10mmol /L PB(pH7.0) 的混合液1 mL，充分混匀，4℃静置24-72h，4℃、12000r/min 离心6min，以收集纳米金颗粒。弃上清，用0.3mol /L NaCl 和10mmol /L PB(pH7.0) 的混合液1mL漂洗，4℃、12000r/min 离心5min以去除多余的寡核苷酸探针。弃上清，最后用100μl 含0.3mol /L NaCl 和10mmol /L PB( pH7.0) 的混合液重悬沉淀，4℃避光保存；
（2）将25µl的步骤（1）制备的AuNPS-DNA复合物加到玻璃纤维上制备金标垫，在室温下避光干燥过夜，保存在4℃干燥器中待用；
（3）将硝酸纤维素膜在10mM PBS缓冲液中浸泡5-10min，并在30-40℃下干燥2-3h；在浸泡后的硝酸纤维素膜上划上probe2做为检测线，另一端划上Probe1’做为质控线，紫外灯下交联2h，并保存于4℃干燥器中待用；检测线和质控线之间的间隔为5.0-6.0mm；
（4）将吸水垫在10mM PBS缓冲液中浸泡5min，在37℃下干燥2h；
（5）将样品垫在处理缓冲液中浸泡1h，并在37℃下干燥2h；
（6）最后按照如图1所示的金标核酸试纸条的结构黏贴好样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装完成后，在室温下用重物压实，裁切、密封干燥保存，得到金标核酸试纸条。
最后以分离病原菌灿烂弧菌裂解液或水产品病灶组织裂解液为样品滴加在如上述的金标核酸试纸条上进行检测，根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：
若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；
若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；
若质控线不显色，则检测无效。
所述的探针Probe1、Probe2为：对数据库中查找到的20条灿烂弧菌菌株的毒力基因序列进行同源性分析，从中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：
Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；
Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；
Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。
所述步骤（1）中的纳米金的制备：将100ml 1mM氯金酸溶液置于双颈瓶中，快速搅拌加热至沸腾，迅速加入10ml 38.8mM柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，至溶液变为深红色，除去热源后继续搅拌至室温；将冷却后的纳米金溶液置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存备用。
所述步骤（1）中的NaCl 的浓度对于探针的金标制备至关重要，为得到最佳浓度，我们将NaCl 的浓度在 0.05-0.50 mol /L范围内设置不同浓度，进行上述实验，实验结果表明当 NaCl浓度为0.3mol /L时，巯基标记的Probe1能与纳米金有效结合，最终检测线和质控线的显色最为明显。因此，本实验选择NaCl浓度为0.3mol /L。
所述步骤（5）中的处理缓冲液为：含0.25% TritonX-100、20mM Tris-HCl及150mMNacl的溶液，pH为8.0。
对比例1
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处仅在于采用灿烂弧菌常规分子检测所选用的序列设计探针。设计探针序列如下：
Probe1：5'-SHAAAAAAGTGAAATCTGCCGTTGAACA-3'；
Probe2：5'-GCGATGGGTGAAAAACTGTC-3'；
Probe1’：5'-TGTTCAACGGCAGATTTCAC-3'；
按照上述条件组装试纸条，并对1×106CFU/mL浓度的灿烂弧菌裂解液进行检测，结果该组装试纸条仅质控线有显色，而检测线不显色，说明探针的选用会直接影响试纸条的检测结果，而此分子生物学的检测序列并不适用于本发明。
对比例2
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处仅在于采用灿烂弧菌常规分子检测所选用的序列设计探针。设计探针序列如下：
Probe1：5'-SHAAAAAACCAACAAAACCCCGATCATC-3'；
Probe2：5'-CAAAAAATCTTCCACTTCGA-3'；
Probe1’：5'-GATGATCGGGGTTTTGTTGG-3'；
按照上述条件组装试纸条，并对1×106CFU/mL浓度的灿烂弧菌裂解液进行检测，结果该组装试纸条质控线和检测线均为明显条带显示，说明探针的选用会直接影响试纸条的检测结果，而此分子生物学的检测序列并不适用于本发明。
对比例3
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处仅在于Probe1-AuNPs复合物的制备，具体为：将10 mL纳米金溶液浓缩成100 µL后加入30 µL 10 μmol/L的probe1, 充分混匀，在避光条件下，4℃静置16h，加入NaCl和1%SDS溶液直至NaCl浓度为0.3mol /L，SDS终浓度为0.01%，充分混匀，4℃静置48h，4℃、12000r/min 离心6min，以收集纳米金颗粒。弃上清，用0.3mol /L NaCl 和0.01% SDS 的混合液1 mL漂洗，4℃、12000r/min 离心5min以去除多余的寡核苷酸探针。弃上清，最后用100μl 含0.3mol /LNaCl 和0.01% SDS的混合液重悬沉淀，4℃ 避光保存。
最终该组装试纸条检测1×106CFU/mL浓度的灿烂弧菌裂解液的结果为：检测线和质控线均无明显条带显现。
对比例4
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处仅在于Probe1-AuNPs复合物的制备，具体为：将10 mL纳米金溶液浓缩成100 µL后加入30 µL 10 μmol/L的probe1, 充分混匀，在避光条件下，4℃静置16h，加入1 mol /L Tris-HCl (pH7.0)至终浓度20 mmol /L，充分混匀，4℃静置48h， 4℃、12000r/min 离心6min，以收集纳米金颗粒。弃上清，用0.3mol /L NaCl 和20 m mol /L Tris-HCl混合液1 mL漂洗，4℃、12000r/min 离心5min以去除多余的寡核苷酸探针。弃上清，最后用100μl 含0.3mol /LNaCl 和20mmol /L Tris-HCl ( pH7.0) 的混合液重悬沉淀，4℃ 避光保存。
最终该组装试纸条检测1×106CFU/mL浓度的灿烂弧菌裂解液的结果为：检测线和质控线均无明显条带显现。
对比例5
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处仅在于Probe1-AuNPs复合物的制备，具体为：将10 mL纳米金溶液浓缩成100 µL后加入30 µL 10 μmol/L的probe1, 充分混匀，在避光条件下，4℃静置16h，加入10×SSC ( pH7.0)至终浓度为2×SSC(pH7.0，含0.3mol /L NaCl)，充分混匀，4℃静置48h， 4℃、12000r/min 离心6min，以收集纳米金颗粒。弃上清，用2×SSC(pH7.0，含0.3mol /L NaCl) 1 mL漂洗，4℃、12000r/min 离心5min以去除多余的寡核苷酸探针。弃上清，最后用100μl 含2×SSC(pH7.0，含0.3mol /L NaCl)重悬沉淀，4℃ 避光保存。
最终该组装试纸条检测1×106CFU/mL浓度的灿烂弧菌裂解液的结果为：检测线和质控线均无明显条带显现。
对比例6
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤同实施例1。不同之处仅在于Probe1-AuNPs复合物的制备，具体为：将10 mL纳米金溶液浓缩成100 µL后加入30 µL 10 μmol/L的probe1, 充分混匀，在避光条件下，4℃静置16h，加入10mmol /L PBS缓冲液(pH7.0) 1mL，充分混匀，4℃静置48h，4℃、12000r/min 离心6min，以收集纳米金颗粒。弃上清，用10mmol /L PBS(pH7.0) 的混合液1 mL漂洗，4℃、12000r/min 离心5min以去除多余的寡核苷酸探针。弃上清，最后用100μL 10mmol /L PBS缓冲液(pH7.0)重悬沉淀，4℃ 避光保存。
最终该组装试纸条检测1×106CFU/mL浓度的灿烂弧菌裂解液的结果为：有检测线和质控线的显色现象，但均不明显。
试验例1
将灿烂弧菌划线接种于2216E平板28℃培养24 h，挑取单菌落悬浮于2216E培养液中于恒温摇床28℃200rpm振荡培养过夜，培养液用生理盐水梯度稀释至1×106CFU/mL后，100℃水浴煮沸10 min, 冷却至室温，12000 r/min离心10 min，取上清液50 μL滴加于本发明试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃孵育5 min之后再加20μL PBS至试纸条的样品垫冲洗试纸条。5min后纳米金在检测线和质控线处的积累，会显现出紫红色条带之后检测线和质控线颜色维持稳定不变。实验结果见附图2，图中从左至右分别是浓度为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的菌裂解液的检测结果，由图可以看出所有检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。当菌液细胞密度在1×102CFU/mL以下时，检测线显色不明显；当菌液细胞密度为1×103~1×106CFU/mL时，检测线清晰显色。
因此判定本灿烂弧菌检测试纸条的检测灵敏度为1×103CFU/mL的菌液浓度。
试验例2
将灿烂弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌分别划线接种于2216E平板28℃培养24 h，分别挑取单菌落悬浮培养于2216E培养液中于恒温摇床28℃200rpm振荡培养过夜，取培养液1m L，100℃水浴煮沸10 min, 冷却至室温，12000 r/min离心10 min，取上清液50 μL滴加于组装试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加20μL PBS至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。实验结果如附图3显示，图中从左至右分别为灿烂弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌裂解液的检测结果，由图可以看出只有灿烂弧菌裂解液对应的试纸条的检测线和质控线都显色，为阳性结果；而副溶血弧菌、哈维弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌的结果都只有质控线显色，为阴性，说明本发明检测试纸条对灿烂弧菌检测具有良好的特异性。
试验例3
取海洋生物溃烂的病灶组织1g，用无菌生理盐水10mL匀浆, 将研磨好的组织匀浆液于100℃水浴煮沸10 min, 迅速置于冰上冷却5 min，取上清液50 μL滴加于组装试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加20μL PBS至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。根据海洋生物的患病情况，检测试纸条会分别呈现阴性或阳性结果。
该检测试纸条检测灵敏度高、特异性强，稳定性好，结果可用肉眼判读，不需特殊仪器即可专一检测灿烂弧菌，适合水产养殖业基层推广使用，可以对该菌引起的水产病害起到良好的防控作用。
本发明的检测试纸条便于携带、操作简单快速、能够现场即时检测，并且打破了试纸条对抗体的依赖，以人工合成核酸探针代替抗体，绕开了耗时耗力的杂交瘤制备单克隆抗体过程，所需检测探针直接可以在生物公司中快速合成，大大降低了生产成本和制备周期。不需依靠特殊检测仪器设备、不需要专业的技术人员，5-10分钟即可完成检测过程，检测灿烂弧菌灵敏度高、特异性强，利于基层的推广使用。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

Claims (4)

1.一种快速检测水产病害金标核酸试纸条，其特征在于，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有探针Probe1-AuNPs复合物的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；
所述硝酸纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；
所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：
Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；
Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；
Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。
2.一种如权利要求1所述的快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，其特征在于，步骤包括：
（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将80-120 µL纳米金溶液和20-40 µL 的1-10μmol/L的probe1混匀反应，再加入混合液继续反应，经离心收集纳米金颗粒；用混合液漂洗、重悬后，最终得到Probe1-AuNPs复合物；
所述混合液是NaCl 和PB的混合液，所述NaCl 浓度为0.05 -0.50mol/L，所述PB浓度为8-12mmol /L；
（2）将步骤（1）制备的AuNPs-DNA复合物加到玻璃纤维上制备金标垫；
（3）将处理后的硝酸纤维素膜上划上probe2作为检测线，另一端划上Probe1’作为质控线，检测线和质控线之间的间隔为5.0-6.0mm；
（4）按照金标核酸试纸条的结构黏贴好样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装完成后，在室温下用重物压实，裁切、密封干燥保存，得到金标核酸试纸条。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1） PBS缓冲液的pH值为7.0。
4.一种利用如权利要求1所述的金标核酸试纸条快速检测水产病害的方法，其特征在于，所述方法包括：以分离病原菌灿烂弧菌裂解液或水产品病灶组织裂解液为样品加在所述金标核酸试纸条上进行检测，根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：
若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；
若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；
若质控线不显色，则检测无效。
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