CN110029148A - 一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，属于生物技术领域。包括以下步骤：（1）针对不同样品采取不同方法进行细胞破碎，释放核酸，得到含有核酸的处理液；（2）通过核酸吸附柱吸附步骤（1）所释放的核酸，使核酸附着并富集于核酸吸附柱的核酸吸附膜上；（3）去除核酸吸附膜上的杂质；（4）洗脱核酸吸附膜上的核酸，得到核酸洗脱液；（5）将核酸洗脱液滴加于核酸试纸条上进行检测。本发明能最大化的简化核酸提取和纯化步骤，使核酸试纸条的检测效果进一步提高，且能提高检测限和检测成功率。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，属于生物技术领域。
背景技术
自上世纪80年代以来，我国的水产养殖业的规模和产量增长迅猛，已成为我国农业的四大支柱产业（粮食、肉类、水产和禽蛋）之一。然而，近年来，随着水产养殖规模的增加、养殖集约程度的加大，养殖环境不断恶化，各种水产养殖病害频繁发生，给水产养殖业造成巨大的经济损失，严重阻碍了水产养殖业的可持续发展。据初步统计，目前危害水产养殖生物的病害已达400～500种，其中水产病原微生物是水产品的主要病害菌之一，其种类多、分布广、传播性强，容易引起世界范围内的多种水产养殖传染病的大规模爆发流行，发病率和死亡率高，容易引起世界范围内的多种水产养殖传染病的大规模爆发。因此建立和开发水产病原菌的快速检测诊断技术对水产养殖病害的防控具有重要意义。
目前针对水产病害较为普遍的检测技术是针对病原微生物核酸标靶建立的PCR扩增技术，但在养殖渔场等基层现场检测环境往往不具备PCR仪、荧光PCR仪等常规检测设备，并缺乏具有专业技能的操作人员，因此，该技术难以在养殖渔场等基层单位推广应用。免疫试纸条检测技术无疑是目前大家公认的一种最为便捷的检测方法，它是将固定了捕获蛋白为抗体或抗原的硝酸纤维素膜作为基板，采用胶体金为标记物对抗体进行标记，通过亲和反应转化成可视化信号，其检测结果可以用肉眼直接观测，在病害检测与防治等方面发挥了巨大的作用，非常适用于基层及现场检测，具有广阔的市场应用前景。然而该检测技术的最大瓶颈需要制备针对病原蛋白的专一抗体实施检测，而抗体的制备周期长、成功率低，这极大的制约了该检测技术的发展与相关检测产品的开发，目前可以应用于水产病害检测的免疫试纸条非常有限。
近年来人们开始尝试开发和制备核酸检测试纸条对水产病害进行检测，核酸试纸条同免疫试纸条一样也是由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫等部分组成的，但与免疫试纸条所不同的是其以核酸为检测对象，金标垫上所吸附的不是金标抗体而是纳米金标记的核酸检测探针，硝酸纤维素膜上所吸附的检测线和质控线探针也均为与病原微生物相关的核酸序列。与传统免疫试纸条相比，核酸检测试纸条打破了对抗体的依赖，以人工合成核酸探针代替抗体，具有设计合成简便、易于修饰标记、价格低廉、稳定性强等诸多优势，因此，核酸试纸条有望代替免疫试纸条，在分析检测领域前景广阔。但是，核酸试纸条在使用过程中常常受到假阴性问题的困扰，造成误判。这是由于很多核酸试纸条对检测样本的要求比较高，需要较高纯度和浓度的核酸样品才能得到预期的检测结果，因此样品不能采用简单的前处理，在检测前往往要经历样品裂解、抽提、沉淀、漂洗、晾干、回溶等复杂的样品前处理过程，有的还要经过信号放大阶段才能实施，使其实际应用受到限制，这也成为核酸检测试纸条无法在水产养殖基础单位推广和应用的重要原因。
因此，亟待发明一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的不足之处，提供一种特别适用于核酸试纸条检测的样品前处理工艺，该样品前处理工艺能最大化的简化核酸提取和纯化步骤，使核酸试纸条的检测效果进一步提高，且能提高检测限和检测成功率。
一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特殊之处在于包括以下步骤：
（1）对样品进行细胞破碎，释放核酸，得到含有核酸的处理液；
进一步的，所述样品为供试分离菌，具体步骤为：将供试分离菌培养至对数增长期，取培养液0.5~10 mL，5000~12000 r/min离心1~10 min，弃上清，加入裂解液1~10 mL，50~100℃水浴5~30 min，得处理液；
所述裂解液包含1~100 mM Tris-HCl、 1~20 mM EDTA、1~20 mM NaCl、0.5~5 %SDS、0.05~5mg/L蛋白酶K；
进一步的，所述样品为海洋生物组织，具体步骤为：选取组织0.1~2 g，剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入1~10 mL匀浆液，匀浆至无组织块，将研磨好的匀浆液转入离心管，加入蛋白酶K 10~100 μL，颠倒混匀，50~100℃ 恒温水浴锅中水浴5~30 min，冰上冷却，得处理液；
所述匀浆液包含50~500 mM Tris-HCl、100~1000 mM EDTA、5~50 mM NaCl、5~20 %SDS；
所述蛋白酶K的浓度为1~50 mg/mL；
进一步的，所述样品为养殖水体，具体步骤为：取养殖水体样品50~500 mL, 50~100℃水浴5~30 min，室温冷却，得处理液；
（2）通过核酸吸附柱吸附步骤（1）所释放的核酸，使核酸附着于核酸吸附柱的核酸吸附膜上；
进一步的，所述步骤（2）的具体步骤为：取步骤（1）的处理液5000~15000 rpm离心1~10min，取上清加入核酸吸附柱中，放置2-5min，5000~15000 rpm离心1~10 min，倒掉核酸吸附柱收集套管中的液体，本步骤可重复1次；
进一步的，所述核酸吸附柱包括由热塑性聚合物材质制成的中空管及外部收集套管，中空管的底部由核酸吸附膜封底，核酸吸附柱分为三种型号：
A型：为小量吸附柱，外部套管为2mL离心管，核酸吸附量＞20 μg，最大上样量为800μL；
B型：为中量吸附柱，外部套管为6mL离心管，核酸吸附量＞200 μg，最大上样量为2.5mL；
C型：为大量吸附柱，采用化学修饰的高吸附强度膜，外部套管为50mL离心管，核酸吸附量＞500 μg，最大上样量为17 ml；
进一步的，所述核酸吸附膜为二氧化硅吸附膜、硅胶吸附膜、正硅酸乙酯吸附膜、纤维素吸附膜中的任意一种；
（3）去除核酸吸附膜上的杂质；
进一步的，所述步骤（3）的具体步骤为：向核酸吸附柱的核酸吸附膜上加入1~20 mL 50~100 %乙醇，pH值为 3.0~7.0，50000~15000 rpm 离心0.5~5 min，倒掉核酸吸附柱收集套管中液体，本步骤重复1-2次。
（4）洗脱核酸吸附膜上的核酸，得到核酸洗脱液；
进一步的，所述步骤（4）的具体步骤为：将吸附有核酸的核酸吸附柱敞口放置1~5 min，在核酸吸附柱的核酸吸附膜中央加入5~100 μl 去离子水，放置0.5~5 min，50000~15000rpm离心0.5~5 min，得到核酸洗脱液。
（5）将核酸洗脱液滴加于核酸试纸条上进行检测；
进一步的，所述步骤（5）的具体步骤为：
加样：取上述洗脱液5~100 μL滴加于核酸试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，30~80 ℃ 孵育1~10 min之后再加5~100 μL 1~100 mM PBS或TE缓冲液（pH 5.0~8.0）至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
判读：
根据试纸条上检测线和质控线的显色情况对结果进行判读：
若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；
若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；
若质控线不显色，则检测无效。
进一步的，所述核酸试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫等部分依次连接并固定在底板上。在金标垫上吸附有含有纳米金标记探针Probe1，在硝酸纤维素膜上分别划有一条由探针probe2包被的检测线和一条由探针probe1’包被的质控线。探针Probe1和Probe2分别根据灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段的5’端和3’端设计，探针Probe1’则与Probe1互补。
进一步的，所述步骤（2）核酸吸附之前还要进行对核酸吸附柱进行活化，具体步骤如下：
利用结合液将核酸吸附柱的核酸特异性吸附膜充分润湿，并在洁净环境下干燥；
所述结合液包含1~5 M异硫氰酸胍、20~500 mM Tris-HCl、10~100 mM EDTA，结合液的pH3.0~7.0；
本发明利用硅胶膜对核酸的吸附特性，在试纸条检测前针对不同的样本采用不同的样品前处理方法，吸附并富集菌裂解液、养殖生物的组织匀浆及养殖水体中的核酸，通过反复吸附和洗涤，最终在30 min以内即可得到适于核酸试纸条的检测样本。目前针对水产病害最为流行的检测方法是PCR检测体系，有研究表明PCR对灿烂弧菌的细菌浓度检测限为1×103 cfu/mL，而本检测体系可以检测浓度低至1×10 CFU/mL的灿烂弧菌菌液，并且本体系不需要PCR扩增和电泳，处理好的样品通过试纸条直接检测，肉眼观察，方便快捷，无需专业人员和设备。本发明极大简化了核酸提取和纯化步骤，并使核酸试纸条的检测效果进一步提高，为水产病害的检测提供了便捷的样品处理方法，为实现核酸试纸条的现场检测及基层推广奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验结果图；
图2为本发明实施例2的实验结果图。
具体实施方式
本发明的适用于核酸试纸条检测的样品前处理工艺简单易操作，利用本发明处理后的样品直接滴加到核酸检测试纸条的的样品垫上，能快速的检测样品中的病害情况，通过本发明的处理方法可以使核酸检测试纸条具有更好的检测效果，提高了检测限和检测成功率。
实施例1
（1）将灿烂弧菌划线接种于2216E固体培养基平板28℃培养24 h，挑取单菌落于2216E液体培养基中，28℃200rpm振荡过夜培养，用生理盐水将培养菌液梯度稀释至浓度分别为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10 CFU/mL后，取菌培养液1 mL，8000 r/min离心5min，弃上清，加入裂解液（50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA，10 mM NaCl，1%SDS，0.1mg/L蛋白酶K）1 mL，70℃水浴10 min。
（2）取上述处理液12000rpm离心5min，取上清800μL加入A型核酸吸附柱中，放置2min。12000 rpm离心1min，倒掉收集套管中液体，重复本步骤1次；
（3）加入1 mL 80%乙醇（pH 5.5），12000 rpm 离心1 min；
（4）敞口放置3 min，在硅胶吸附膜中央加入10μl 去离子水，放置2 min，12000 rpm离心1min，将得到的洗脱溶液用于后续检测试验；
（5）取上述洗脱液50 μL滴加于灿烂弧菌核酸检测试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加10mM PBS缓冲液（pH 7.0）20μL至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
实验结果见附图1，图中从左至右分别是浓度为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10 CFU/mL的菌裂解液的检测结果，由图可以看出所有检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。随着菌液细胞密度的减少检测试纸条的检测线显示逐渐变淡，当菌液细胞密度在1×10 CFU/mL时，检测线仍能显色，因此采用本发明的处理方法可以检测浓度低至1×10 CFU/mL的灿烂弧菌菌液。
实施例2
（1）刺参体壁样品的组织0.5 g，剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入5 mL匀浆液（100 mMTris-HCl, 500 mM EDTA, 20 mM NaCl，10%SDS），匀浆至无组织块，将研磨好的匀浆液转入离心管，加入蛋白酶K （20mg/mL）20 μL，颠倒混匀，70℃ 恒温水浴锅中水浴20min，冰上冷却。
（2）取上述处理液10000rpm离心5min，取上清2.5 mL加入B型核酸吸附柱中，放置5min。10000 rpm离心3min，倒掉收集套管中液体，重复本步骤1次。
（3）加入2.5 mL 80%乙醇（pH 5.5），12000 rpm 离心1 min，重复本步骤1次。
（4）敞口放置3 min，在硅胶吸附膜中央加入20μL 去离子水，放置2 min，12000rpm离心1min，将得到的洗脱溶液用于后续检测试验。
（5）取上述洗脱液50 μL滴加于灿烂弧菌核酸检测试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加10mM PBS缓冲液（pH7.0）20μL至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
实验结果见附图2，两个检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。左侧检测试纸条检测线不显色，呈现阴性结果；右侧检测试纸条检测线显出清晰条带，呈现阳性结果。
实施例3
（1）取养殖水体样品100 mL,100℃水浴10 min，室温冷却。
（2）取上述处理液8500rpm离心5min，取上清17 mL加入C型核酸吸附柱中,放置5min。8500rpm rpm离心3min，倒掉收集套管中液体，重复本步骤1次。
（3）加入10 mL 80%乙醇（pH 5.5），10000 rpm 离心1 min。
（4）敞口放置3 min，在硅胶吸附膜中央加入30μL 去离子水，放置2 min，12000rpm离心1min，将得到的洗脱溶液用于后续检测试验。
（5）取上述洗脱液50 μL滴加于灿烂弧菌核酸检测试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加10mM PBS缓冲液（pH7.0）20μL至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
实验结果表明所有检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。根据养殖水体情况，检测试纸条检测线分别呈现阴性或阳性结果。
对比例1
对照组1：将灿烂弧菌划线接种于2216E固体培养基平板28℃培养24 h，挑取单菌落于2216E液体培养基中，28℃200rpm振荡过夜培养，用生理盐水将培养菌液梯度稀释至浓度分别为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10 CFU/mL后，取菌培养液1 mL，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入裂解液（50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA，10 mM NaCl，1%SDS，0.1mg/L蛋白酶K）1 mL，70℃水浴10 min。12000rpm离心5min，取上清液50 μL滴加于灿烂弧菌核酸检测试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加10mM PBS缓冲液（pH7.0）20μL至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
对照组2：采用实施例1中的方法对梯度稀释的灿烂弧菌培养液的裂解液利用A型核酸吸附柱处理后再进行灿烂弧菌核酸试纸条的检测。
实验结果表明所有检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。当菌液密度在1×10 CFU/mL以上时，检测线清晰显色；在1×10 CFU/mL时，检测线显色不明显，说明此检测体系对灿烂弧菌的检测限为1×10 CFU/mL。
实验结果表明对照组1和对照组2中的检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。但当菌液细胞密度在1×102CFU/mL以下时，对照组1中的检测试纸条检测线显色不明显；对照组2中的检测试纸条检测线对所有菌液细胞密度均能显色，不明显当菌液细胞密度在1×10 CFU/mL时，检测线仍能显色，因此采用本发明的处理方法可以检测浓度低至1×10 CFU/mL的灿烂弧菌菌液，而不经该样品前处理过程直接用灿烂弧菌核酸检测试纸条检测的检测限为1×103 CFU /mL，说明通过本样品前处理技术可以明显提高核酸试纸条的检测效果。
对比例2
对照组1：取经PCR检测为灿烂弧菌阳性的刺参体壁样品的组织0.5 g，剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入5 mL匀浆液（100 mM Tris-HCl, 500 mM EDTA, 20 mM NaCl，10%SDS），匀浆至无组织块，将研磨好的匀浆液转入离心管，加入蛋白酶K （20mg/mL）20 μL，颠倒混匀，65℃ 恒温水浴锅中水浴20min，冰上冷却。取上述处理液10000rpm离心5min，取上清液50 μL滴加于灿烂弧菌核酸检测试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加10mM PBS缓冲液（pH7.0）20μL至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
对照组2：取经PCR检测为灿烂弧菌阳性的刺参体壁样品的组织0.5 g，采用实施例2中的方法利用B型核酸吸附柱处理后再进行灿烂弧菌核酸试纸条的检测。
实验结果表明对照组1和对照组2中的检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。但对照组2中的检测试纸条的检测线呈现阳性，而对照组1中的检测试纸条检测线呈现阴性，说明采用本发明对样品前处理的方法能提高核酸试纸条对样品的检测效果，有效避免对水产品组织样品检测出现假阴性的现象，防止产生误判。
对比例3
对照组1：取经PCR检测为灿烂弧菌阳性的养殖水体样品100 mL，100℃水浴10 min，室温冷却。取上述处理液8500rpm离心5min。取上清液50 μL滴加于灿烂弧菌核酸检测试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，37℃ 孵育5 min之后再加10mM PBS缓冲液（pH7.0）20μL至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色。
对照组2：取经PCR检测为灿烂弧菌阳性的养殖水体样品100 mL，采用实施例3中的方法利用C型核酸吸附柱处理后再进行灿烂弧菌核酸试纸条的检测。
实验结果表明对照组1和对照组2中的检测试纸条的质控线均显示清晰条带，说明检测试纸条有效。但对照组2中的检测试纸条的检测线呈现阳性，而对照组1中的检测试纸条检测线呈现阴性，说明采用本发明对样品前处理的方法能提高核酸试纸条对样品的检测效果，有效避免对养殖水体样品检测出现假阴性的现象，防止产生误判。
从上述对比例可以看出，本发明提供的技术可以有效避免核酸检测试纸条在检测动物样本、水样等难检样本过程中出现假阴性的情况，极大提高了核酸检测试纸条的检测效果，为其推广和应用奠定了基础。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于包括以下步骤：
（1）对样品进行细胞破碎，释放核酸，得到含有核酸的处理液；
（2）通过核酸吸附柱吸附步骤（1）所释放的核酸，使核酸附着并富集于核酸吸附柱的核酸吸附膜上；
（3）去除核酸吸附膜上的杂质；
（4）洗脱核酸吸附膜上的核酸，得到核酸洗脱液；
（5）将核酸洗脱液滴加于核酸试纸条上进行检测。
2.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（1）中的样品为供试分离菌，具体步骤如下：
将供试分离菌培养至对数增长期，取培养液0.5~10 mL，5000~12000 r/min离心1~10min，弃上清，加入裂解液1~10 mL，50~100 ℃水浴5~30 min，得处理液；
所述裂解液包含1~100 mM Tris-HCl、 1~20 mM EDTA、1~20 mM NaCl、0.5~5 %SDS、0.05~5mg/L蛋白酶K。
3.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（1）中的样品为供试海洋生物组织，具体步骤如下：
选取海洋生物组织0.1~2 g，剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入1~10 mL匀浆液，匀浆至无组织块，将研磨好的匀浆液转入离心管，加入蛋白酶K 10~100 μL，颠倒混匀，50~100℃ 恒温水浴锅中水浴5~30 min，冰上冷却，得处理液；
所述匀浆液包含50~500 mM Tris-HCl、100~1000 mM EDTA、5~50 mM NaCl、5~20 %SDS；
所述蛋白酶K的浓度为1~50 mg/mL。
4.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（1）中的样品为养殖水体，具体步骤如下：
取养殖水体样品50~500 mL, 50~100℃水浴5~30 min，室温冷却，得处理液。
5.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（2）的具体步骤为：
取步骤（1）的处理液5000~15000 rpm离心1~10 min，取上清加入核酸吸附柱中，放置2-5min，5000~15000 rpm离心1~10 min，倒掉核酸吸附柱收集套管中的液体，本步骤重复1-2次。
6.按照权利要求5所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述核酸吸附柱包括由热塑性聚合物材质制成的具盖中空管及外部收集套管，中空管的底部由核酸吸附膜封底，所述核酸吸附膜为二氧化硅吸附膜、硅胶吸附膜、正硅酸乙酯吸附膜、纤维素吸附膜中的任意一种。
7.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（3）的具体步骤为：
向核酸吸附柱的核酸吸附膜上加入1~20 mL 50~100 %乙醇，pH值为 3.0~7.0，50000~15000 rpm 离心0.5~5 min，倒掉核酸吸附柱收集套管中液体，本步骤重复1~2次。
8.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（4）的具体步骤为：
将吸附有核酸的核酸吸附柱敞口放置1~5 min，在核酸吸附柱的吸附膜中央加入5~100μl 去离子水，放置0.5~5 min，50000~15000 rpm离心0.5~5 min，得到核酸洗脱液。
9.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（5）的具体步骤为：
加样：取核酸洗脱液5~100 μL滴加于核酸试纸条的样品垫上，将试纸条置于湿盒中，30~80 ℃ 孵育1~10 min之后再加1~100 mM PBS或TE缓冲液(pH 5.0~8.0)，至试纸条的样品垫冲洗试纸条，继续显色；
判读：根据试纸条上检测线和质控线的显色情况对结果进行判读，若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；
若质控线不显色，则检测无效。
10.按照权利要求1所述的一种适用于水产病害核酸检测试纸条的样品前处理工艺，其特征在于所述步骤（2）与步骤（1）之间还设有核酸吸附膜的活化步骤，具体步骤如下：
利用结合液将核酸吸附柱的核酸特异性吸附膜充分润湿，并在洁净环境下干燥；
所述结合液包含1~5 M异硫氰酸胍、20~500 mM Tris-HCl、10~100 mM EDTA，结合液的pH3.0~7.0。
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