JP3725164B2 - バクテリア検出方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
適切な培養媒体上において痰のような体液サンプルからのバクテリアを増殖させることにより、視覚によるかまたは試験試薬あるいはアッセイを用いて培養媒体上のバクテリアのコロニーの検出を可能にすることは、共通に実施されている。そのような技術は、広範囲の培養にわたって適用可能であり、標準のバクテリア検出並びに診断の方法として広く受け入れられつつある。しかしながら、検出可能な程にバクテリアの成長が生じるのに数日あるいは数週間さえ要するように、バクテリアが低成長タイプである場合の問題が生じる。これは、特に幾つかのミコバクテリウム(Mycobacterium)種またはレジオネラ(Legionella)種の場合であり、バクテリアの検出可能なコロニーの増殖に4週間以上を要しうる。これは、患者のバクテリアの感染を確証するのに受容不可能な遅延を強いるので、バクテリアの存在および同定のより迅速な評価を提供することが望まれる。
PCT出願番号WO92/02633には、生育可能なバクテリアのサンプルを用意して、そのバクテリアに特異的なウイルスの株を感染させることが提案されており、そのようなバクテリア感染ウイルスは、バクテリオファージまたはより一般にはファージと呼ばれる。ファージ粒子の幾つかは、バクテリアに感染してバクテリア細胞内で複製する。バクテリアにより吸収されないようなファージ粒子は、バクテリアのキャリアーの母液またはマトリックス、典型的には培養媒体中に残る。感染されたサンプルを次に例えば加熱および/または酸により処理して殺すかまたは洗浄剤で洗浄するならば、暴露された外側のファージ粒子、即ち、外部のファージ粒子は不活性化されるかまたは除去される。感染性の内部のファージ粒子は不活性化されないが、バクテリアの細胞内で保護されているからである。次に、処理された感染バクテリアは、ファージ粒子により感染されうるのに許容されるようなさらなる未感染バクテリアの存在下において培養できる。感染バクテリア内のファージ粒子は複製して、細胞壁が破壊されるかまたは溶解して複製したファージ粒子を放出させる。この子孫ファージ粒子の第1の世代が他のバクテリア細胞に感染して、感染、複製そして溶解の連続するサイクルを引き起こす。これは、培養媒体中でのファージ粒子の数の対数増加を提供する。初期の感染バクテリア細胞数が小さい場合であっても、バクテリア細胞の成長の低下あるいは多数の複製したファージ粒子のいずれかが測定されるかまたは観察できるので、即ち、評価されるサンプル中の初期のバクテリア細胞の存在の検出感度が高められる。
この修飾はバクテリア細胞の検出感度を高めて素早く成長するバクテリア、例えばサルモネラ(Salmonella)種の検出に首尾よく使用されてきた。しかしながら、ゆっくりと成長するバクテリア、例えばミコバクテリウム種に関しては、ファージ粒子の検出可能な集団を与えるためのこの方法に必要な時間は他の技術と実質同じままであり、該方法はそのようなバクテリアに伴う時間の問題を解決しないことを我々は見いだした。ゆっくりと成長するバクテリアの迅速且つ正確な検出を達成する方法における要求が、なお存在する。
我々は、ゆっくりと成長するバクテリアが迅速に検出されうるような方法を考案し、即ち、そのような検出に関して数日または数週間さえ要したことにおける問題を克服した。その方法は、与えられたバクテリアの抗生物質および他の薬剤に対する感度を測定すること、および与えられた抗生物質または薬剤が与えられたバクテリアに対して活性であるか否か、または与えられた殺ウイルス剤組成物が与えられたウイルスに対して効果を有するか否かを測定することにも使用できる。該方法は単純な装置を用いて熟練していない人にも実施できるので、該方法は、熟練した微生物学者並びに複雑な装置を得ることができない第3国における操作を容易にさせる。
発明の概要
したがって、一つの側面から、本発明はサンプル中の第1バクテリアの存在を検出するための方法に関するが、該方法は、以下の工程:
a.第1バクテリア細胞の生育可能なサンプルに該バクテリアに特異的なファージを感染させ、それにより少なくとも幾つかのバクテリア細胞各々にひとつまたはそれ以上のファージ粒子を吸着させ;
b.バクテリア細胞により吸着されなかったファージ粒子を不活性化するかまたは除去し;
c,第1バクテリア細胞の増殖速度よりも高い増殖速度を有する少なくとも一つの他の第2バクテリアを含む培養媒体中において感染第1細胞を培養し、それにより感染第1バクテリア細胞の溶解により放出されたファージ粒子により少なくとも幾つかの第2バクテリア細胞を感染させ、但し各々の感染バクテリア細胞は感染サイクルの次の世代のさらなる感染源として利用し;そして
d.工程cにおける複製したファージ粒子の数あるいは第2バクテリアの成長の低下の何れかを監視することにより試験されたサンプル中の第1バクテリア細胞の存在を測定すること
からなる。
好ましくは、第2バクテリアの培養および感染はさらなるバクテリア細胞の成長並びに溶解が実質上停止する定常状態またはそれに近い状態で実施する。この状態において、ファージ粒子の活性のために実質上一定の数のバクテリアの死細胞が培養媒体中に存在する。ファージの複製が生じる培養媒体の領域は、生育可能なバクテリアの成長のためにより濁っているか、不透明であるか、さもなくば視覚上異なる周囲の培養中で明白なスポットとして視覚により検出することができる。ファージの活性によりバクテリアの成長が低下したこれらの領域は、一般にプラークと呼ばれる。第2バクテリアは第1バクテリアよりも高い速度で増殖するから、最初に感染した第1バクテリア細胞が検出可能なプラークを形成するのに要する時間は大幅に低下する。プラーク形成におけるこの加速は、同じバクテリアを初期ファージ感染並びに続く培養工程に用いる場合には生じない。
別法として、工程cの終わりにおける培養媒体中の複製したファージ粒子の存在は、慣用のファージアッセイ技術を用いて評価することができる。これは、上記のプラークの存在の測定に加えて、または独立に実施することができる。
本発明の方法は、即ち、サンプル、例えばミコバクテリウムツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)に感染しているかまたはレジオナイレス(Legionnaires)の疾患の疑いのある患者であって、そのようなバクテリアが初期サンプルに存在したことについてあらゆる観察可能な示唆を与えるのに、慣用評価法では数日または数週間を要した患者からのサンプル中の、ゆっくりと成長するバクテリアの検出に適用することができる。そのような場合、初期サンプルの一部を予測されるバクテリアに特異的なファージで感染させて、不活性化工程bを通過させるが、ファージ粒子は感染した細胞により保護されるからである。これらの保護されたファージ粒子は、感染細胞の培養において各々の感染された第1バクテリア細胞の周辺においてファージまたはプラークの形成を引き起こす−工程c。疑われたバクテリアがサンプル中に存在しなかったなら、工程cにおいてファージまたはプラークは事実上形成されないはずであり、培養媒体は事実上均質な外観を呈するはずである。
本発明は、抗生物質または他の薬剤が何らかの殺バクテリア作用を有するか否かを測定する試験において、抗生物質または他の薬剤で処理された公知のバクテリアを用いて実施してもよい。この場合、工程cにおけるファージまたはプラークの数は、最初のバクテリアを殺すことにおける抗生物質または薬剤の効果またはその反対を示す。慣用の試験方法においては、抗生物質または薬剤はバクテリアに適用されるはずであり、死細胞の数は抗生物質または薬剤の効果の直接の指標となるはずである。しかしながら、顕微鏡を用いなければ、個々の死細胞を観察することは難しい。本発明のこの応用において、第1バクテリアへの該細胞を殺すかもしれない抗生物質または薬剤の処理は、ファージ粒子による残りの生育可能な第1バクテリアの感染と組合わされて、どれくらいの第1バクテリアが抗生物質または薬剤による殺傷から逃れたかを測定する。
本発明の他の応用において、ウイルスまたはファージのサンプルは殺ウイルス作用またはウイルス成長制御作用を有する組成物で処理される。処理されたファージを用いて、次にその特異的なファージに許容性の生育可能な第1バクテリア、即ちそのファージにより感染され得るバクテリアに感染させる。感染したバクテリアは、次にバクテリア細胞に感染せずに外部に暴露されたままのファージまたは細胞に対して外側のファージ粒子は不活性化するように処理される。次に、不活性化された感染第1バクテリア細胞物質を第2の早く増殖するバクテリアの存在下で培養して、プラークを生成させるが、感染第1細胞中のファージ粒子は複製して溶解した。ファージ粒子の最初の処理が完全に効果的であるなら、第1バクテリア物質が感染された際に生育可能なファージ粒子は存在せず、したがって、第2バクテリアの存在下での培養液に生育可能なファージ粒子は持ち込まれない。したがって、第2バクテリアは増殖して、培養媒体に実質的に均一な発色または不透明性を付与する。しかしながら、もしファージ粒子の最初の処理が完全に効果的でなかったなら、ファージ粒子は第2バクテリアの培養液に生育可能なファージ粒子が持ち込まれ、そして視覚により検出可能なプラークを生じる。
便宜上、本発明は、以後、ゆっくりと生育するミコバクテリウム種の存在の評価に関して記載される。本発明は、広範囲の動物または植物宿主からのバクテリアに適用できるが、哺乳類宿主からのバクテリアの検出に特に有用であり、便宜上、本発明は、バクテリアに感染していると疑われたヒトからの体液の初期サンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの評価に特に言及して記載される。
用語、ゆっくりと生育するバクテリアは、本明細書においては、7H9として公知の培地90%v/vおよびOADCとして公知の栄養10%v/vを含む培養媒体中での37℃における普通の増殖条件下で10時間を超えるバクテリア細胞集団が2倍になることにより評価されるとおりの有効な増殖サイクル(有効倍増速度)を有するものを意味する。そのようなバクテリアは、検出可能なファージ集団またはプラークを生ずるのに、普通は慣用培養技術を用いて72時間以上を要するはずであるか、または培養が難しい。本発明の方法を用いれば、ファージまたはプラークは、そのようなバクテリアの場合、通常は16時間以内で検出できる。
典型的なゆっくりと生育するバクテリアは、ミコバクテリウム種、特にミコバクテリウムツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ミコバクテリウムパラツベルクロシス(Mycobacterium paratuberculosis)およびミコバクテリウムエビウム(Mycobacterium avium);レジオネラ(Legionella)種、特にレジオネラニューモフィラ(Legionella pneumophila);ヘリコバクター(Helicobacter)種、特にヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori);ストレプトコッカス(Streptococcus)種、特にストレプトコッカスアジャセンス(Streptococcus adjacens);およびリッケチア(Rikettsia)種、特にリッケチアプロワゼキ(Rikettsia prowazekii)を含む。本発明は、10時間より長い瞬間倍増速度を有するが、例えばストレプトコッカスデフェクテンス(Streptococcus defectens)およびエクストリモービルズ(Extremoobiles)種を最初に増殖させる困難ゆえに、これよりも大きい平均有効倍増速度を有するバクテリアに適用してもよい。ゆっくりと生育するバクテリアなる用語は、したがって、本明細書および請求の範囲にて用いられて、遺伝的に遅いプロパゲーターであるバクテリア、およびそれらの増殖サイクルにおける間欠性の減衰または干渉ゆえに、10時間より長い遅い平均増殖速度を有するバクテリアを指す。
本発明はそのようなゆっくりと生育するバクテリアを検出することにおける特別の利益を有するが、本発明は、検出可能なファージ集団またはプラークの形成のスピードを増加させることが望まれる場合のあらゆるバクテリアに適用でき、例えば、ヒトサンプル、食品生成物またはキッチン等のバクテリアの汚染を測定するための採取されたサンプル中の10時間より短い倍増速度、例えば4から10時間の範囲を有するバクテリアの検出において、慣用のバクテリア培養技術を用いて達成されるはずの速度より迅速なバクテリアのための試験を提供する。便宜上、本発明は、以下において、第1バクテリアとしてミコバクテリウムツベルクロシスを用いる場合について記載される。
第1バクテリアは、患者からのあらゆる適切な形態において、例えば、痰または他の粘膜分泌物中に存在しうる。しかしながら、本発明は、ヒト、他の哺乳類例えばウマ、ウシ、ヒツジおよびブタの他の体液サンプル、例えば血液、尿または糞便サンプル、および植物体例えば葉または根菜類または実からのサンプルに適用することができる。便宜上、本発明は、ヒト患者の痰サンプルの試験に関して以下に記載される。
典型的には、サンプルは、バクテリアがまだ生育可能な新たな採取された液体として存在する。しかしながら、試験前の保存および/または輸送のためにサンプルが凍結または乾燥している場合は、サンプルを適切な培養媒体中において約20から55℃、好ましくは37℃において保持して、本発明の方法の工程bにおいてバクテリアが生育可能であってファージ粒子により感染を受けることができることを保証することが望ましい。所望であれば、初期サンプルは処理することができ、例えばN−アセチルシステインで希釈し、および/またはアルカリ、界面活性剤または酸で処理して、評価されるバクテリアの検出を干渉するかもしれない他のバクテリア集団を減少させることができる。そのような前処理は、評価のためのバクテリアサンプルの調製において共通に使用される条件および技術を用いて実施することができる。しかしながら、本発明の方法は慣用試験法より迅速であり、他のバクテリアの作用がほとんど顕著ではないから、他のバクテリアからの初期サンプルを浄化する(decontaminate)必要性は、ゆっくりと生育するバクテリアを評価する慣用法に比較して減じられる。
初期サンプルは生育可能な状態において評価されるバクテリアを含む。これは通常液体またはゲル中、例えばカンテン、培養媒体中にある。しかしながら、キャリアー媒体は、粒子状固形物又は小孔(foraminous)材料の孔、例えばセラミックのフリットまたは気泡(foamed)プラスチックまたはフィルターペーパーまたは網状物質中のメッシュ孔であって適切な栄養組成物中に浸されたものでありうる。便宜上、本発明は以下において、続いてゲルキャリアー媒体に適用される初期バクテリアサンプルのための液体キャリアー媒体の使用に関して記載される。
初期サンプルは、評価される第1バクテリア種に特異的なファージであって且つ感染した第1バクテリアが本発明の方法の工程cにおいて培養される際第1バクテリアに特異的な、適切なファージに感染させる。ファージはバクテリア種に属特異的であってよく、そのためファージは属中の範囲のバクテリアに感染する。しかしながら、特定のバクテリアを評価する場合には、狭い特異性のファージを用いることが好ましいかもしれない。所望であれば、ファージはファージ特異性を増大させるように修飾してよく、それにより、評価されるサンプル中の他のバクテリアの感染を減じる。適切なファージの修飾は、公知の技術例えば感染される特定のバクテリアに関する遺伝上の修飾により達成でき、例えばPCT出願番号WO92/02633に記載されているとおりである。本発明の使用のための典型的なファージは、AG1,B1,BG,BK,C3,D29,D34,D56A,GS4E,HP1,L1,I3およびTM4を含む。本発明の使用のための最適なファージは使用される第1および第2バクテリアに依存するが、このファージまたはバクテリア細胞から溶解により生成したその複製物は用いられるバクテリアに供される必要があるからである。即ち、ミコバクテリウムツベルクロシスの存在を評価する際にミコバクテリウムスメグマティスを第2バクテリアとして用いる場合、ファージD29が適切であり、そしてミコバクテリウムエビウムを用いるならファージTM4が適切である。
ファージは例えば液体媒体中の培養物(cultivar)の形態で提供することができ、あるいは、凍結乾燥またはスプレー乾燥粒子の形態で提供することができる。ファージは、任意の適切な技術を用いて且つ任意の適切な条件下で生育可能なバクテリアサンプルと混合する。典型的には、バクテリアサンプルは液体の形態であって、ファージ感染は液体キャリアー中でバクテリアサンプルに適用される。
ファージ感染は、55℃まで特に約37℃の温度において10分から4時間進行させて、大多数のバクテリア細胞を各々少なくとも一つのファージ粒子で感染させることが好ましい。しかしながら、過剰の感染は、以下に記載される酸を用いた非吸着ファージ粒子の不活性化にて残存しないほどにバクテリアを弱めるかもしれない。与えられたバクテリアの最適な感染時間は、単純な試行錯誤およびエラーの試験によるか、または感染バクテリアの顕微鏡試験により決定することができ、本発明の方法の次の段階にて経験される条件に関連する。
次に、感染したバクテリアサンプルを処理して、バクテリア細胞中に吸収されずにバクテリア細胞外に残ったあらゆる外部ファージ粒子を除去するかまたは不活性化して、不活性化段階の間に導入される条件に暴露される−工程b。便宜上、不活性化なる用語は、本明細書において、非吸着ファージ粒子を、本発明の方法の次の工程において実質上複製不可能にするあらゆる方法を集合して指す。即ち、この用語は、サンプルからのファージ粒子の物理的な分離または除去あるいは粒子の脱活性化を含む。この不活性化は、あらゆる適切な技術、例えばPCT出願番号WO92/0233に記載された技術を用いて実施することができる。好ましい技術は、感染バクテリア細胞から物理的に外部ファージ粒子を分離するために感染サンプルを洗浄することおよび濾過を含み;感染サンプルを酸、界面活性剤または化学薬品により処理して外部ファージ粒子をを殺すかまたは不活性化するか;またはのちにバクテリア細胞から分離可能な適切な基質上に、感染サンプルからの外部ファージ粒子を選択的に吸着させることによる。
便宜上、本発明は、以下に感染バクテリア細胞と外部ファージ粒子の混合物の化学薬品または酸処理に関して記載される。そのような処理は、無機酸またはその鉄塩を用いて実施することが好ましく、例えば硫酸アンモニウム鉄またはリン酸または硫酸;C1-4脂肪族カルボキシル酸、特に酢酸であり希釈した氷酢酸あるいは酢であってよく;または酸のバッファー媒体である。処理は、用いられたファージを不活性化するが感染第1細胞を殺さないバクテリアキャリアー媒体中でpH値を得る。最適な洗浄およびpH条件は評価されるバクテリアに依存し、単純な試行錯誤およびエラー試験により決定できる。典型的には、感染バクテリア材料は酸性にされて、上昇温度、典型的には37℃にて十分な時間、典型的には約15分間インキュベートされて、次にアルカリまたは塩基の添加によりpHをほぼ中性に調節する。
別の技術において、外部ファージは殺ウイルス剤を感染バクテリア材料に添加することにより殺される。最適な殺ウイルス剤は殺されるファージおよび第1バクテリアの性質に依存し、単純な試行錯誤およびエラー試験により容易に決定できる。即ち、第1バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスである場合の本発明の使用のための適切な殺ウイルス剤は無機酸の鉄塩および不飽和脂肪酸および12から24の炭素原子を含むアルコールを含み、任意に化学線または他の照射、特に約400から600nmの波長のUV照射を伴う。
不活性化後、バクテリア材料は少なくとも幾つかの生育可能なファージ粒子を内部に有する生育可能な第1バクテリア細胞を含む。この混合物は、第2バクテリアを含む培養混合物またはバクテリア混合物と混合される。これらの第2バクテリアは、第1バクテリアの細胞内でファージ粒子により感染可能であること、ファージに対して許容性であること、および評価される第1バクテリアの増殖速度よりも大きい速度で増殖することを特徴とする。第2バクテリアは第1バクテリアの倍増速度の少なくとも2倍の倍増速度を有することが好ましい。最適な相対増殖速度は第1バクテリアの実際の増殖速度に依存し、検出可能なファージ集団および/または減じられた第2バクテリアの成長エリアまたはプラークを生じるのにかかる時間が過剰でないならば、極めてゆっくりと生育する第1バクテリアに関して高い相対増殖速度が望まれる。典型的には、第2バクテリアは第1バクテリアの4から20倍の倍増速度を有する。即ち、初期サンプル中のミコバクテリウムツベルクロシスの評価のためには、ミコバクテリウムスメグマティスを第2バクテリアとして用いた場合に特に迅速な結果を与えることを我々は見いだした。本発明の使用のための他の適切な第2バクテリアは、他のミコバクテリア、例えばミコバクテリウムアウルム(Mycobacterium aurum)を含む。
所望であれば、感染した第1バクテリアを、第2バクテリアと混合する前に、不活性化工程bの後に放置して少なくとも1世代の複製を達成して感染細胞からファージ粒子を放出させることができる。そのような放置は複製したファージ粒子が感染バクテリア細胞から放出されるのを可能にして、第2バクテリア細胞内の潜在的な感染のための多くの部位を提供して、初期サンプル中の少量の生育可能な第1バクテリアの検出を助ける。
本発明の方法の工程cにおいて、感染第1バクテリアは第2のより早く増殖するバクテリアの存在下で培養される。ファージ粒子が感染第1バクテリア細胞中で複製するとき、細胞が溶解する際に感染細胞から放出されるより多数のファージ粒子を形成する。放出された各々のファージ粒子は隣のバクテリア細胞に感染することができ、それは第1バクテリア細胞でも第2バクテリア細胞でもよい。それらの新たに感染したバクテリア細胞中の各々のファージ粒子は複製することができて放出されることによりさらにバクテリア細胞等に感染する。
第1および第2バクテリアの混合物の培養は、あらゆる適切な技術および条件を用いて実施することができる。典型的には、第2バクテリアは、感染第1バクテリアと混合された液体またはゲル媒体中で培養物の形態で用いられる。しかしながら、第2バクテリアは凍結またはスプレー乾燥粉末の形態で、あるいはその上に含浸またはコートされたバクテリアを有する固形粒子として用いてよい。便宜上、本発明は、以下においてカンテンゲルキャリアー中の第2バクテリアを感染第1バクテリアに適用することに関して記載される。処理された第1バクテリアサンプルに添加される第2バクテリアの量は、サンプル中の第1バクテリア細胞の予測される量に依存して広範囲に変更でき、本発明の方法からの結果の範囲で所望の時間が必要とされる。一般に、大量の、典型的には第1バクテリア細胞の数の2から50倍の第2バクテリア細胞を提供することにより、感染第1バクテリア細胞からの溶解によるファージ粒子が他の第1バクテリア細胞よりも第2バクテリア細胞に感染する可能性を高める。第2バクテリア細胞に対する第1バクテリア細胞の最適な比率は、単純な試行錯誤およびエラーの試験により容易に確立することができる。
培養プロセスの間、培養媒体は、複製したファージ粒子、生育可能な第2バクテリアまたはファージ粒子の作用のために死んだバクテリア細胞のプラークの存在を反映する幾つかの検出可能な方法において変化する。典型的には、第2バクテリアの成長はカンテン培養媒体中の曇りまたは発色を起こし、そしてファージ粒子およびそれらが放出される関連のバクテリア死細胞は発色または曇った媒体中にわずかに曇ったかまたは明瞭なスポット、プラークをもたらし、その結果プラークが視覚により検出および評価できる。別法として、異なった生育をするエリアは、慣用染色技術を用いて差別的染色により検出できる。培養媒体が適切な成分を含む場合、バクテリア細胞は溶解した際に発光体(lumiphores)を放出して、それらはUV照射下で検出でき、例えばPCT出願WO92/02633に記載されているとおりである。増大した数の複製ファージ粒子も、免疫技術例えばELISAまたは他の酵素技術により検出できる。
ファージ粒子および/またはプラークの数は存在する第1バクテリア細胞の数の指標を与え、よって、初期サンプル中のそのような細胞の存在またはその反対が評価される。
上記に示すとおり、本発明の方法は、患者からの初期サンプル中の予測されるバクテリア株の存在の迅速な試験を提供する。第1バクテリアに感染するために使用されるファージ粒子の適切な選択により、試験は特定のバクテリアに特異的にできる。別法として、試験は初期サンプル中に存在するバクテリアの種類に関する広い指標を提供することができる。本発明の方法は、即ち、必要とされる結果にあつらえることができる。結果は今まで必要とされた数日どころか、ものの数時間で得ることができるから、初期の一般的なスクリーンを実施して、初期サンプル中に存在するバクテリアの一般種が同定されれば、特定の試験を実施するのに実用的である。本発明の方法は単純な細胞培養技術を用いて実施することができて、その結果は視覚により評価できるから、本発明の方法は、熟練した労力および複雑な実験室の設備が利用できない第3国において容易に使用することができる。
本発明は、サンプル中の第1バクテリアの存在または不在を検出するための本発明の方法において使用される診断キットも提供するが、該キットは、第1バクテリアのための公知のファージ感染源;第1バクテリアよりも早い倍増速度を有し且つ上記ファージ感染により感染した第1バクテリアから放出されるファージ粒子に許容性の生育可能な第2のバクテリアの源を含む。好ましくは、該キットは、ファージ感染の上記源により完成した第1バクテリアからの外部ファージ粒子の不活性化および/または除去のための手段を含む。
本発明は以下の実施例により今例示されるが、すべての部(parts)は、他に述べない限り重量により与えられる。
実施例1
本発明の原理は、少なくとも10時間の典型的倍増速度を有する第1バクテリアおよび約2時間の倍増速度を有する第2バクテリアとしての早く生育するミコバクテリウムスメグマティスを表す、ゆっくりと生育するワクチン株BCGを用いた安全なモデル中で試験された。この実施例は、液体および固体カンテン工程を組み合わせて、外部ファージは酸で不活性化した。
工程1. カンテンを基材とする媒体からのBCGのコロニーを7H9プラス10%(v/v)OADC付加物(ディフコ)(以後、7H9、OADCと呼ぶ)中の液体培地中にて37℃において生育させて、検出アッセイにおいて使用できる細胞のストックを生じた。臨床の場において、これらの細胞は臨床サンプルを直接の起源とし、この前培養工程を必要としないはずである。臨床の場において、ゆっくりと生育する細胞はミコバクテリウムツベルクロシスである。
工程2. BCG細胞を含む液体培地を連続希釈して、各々の希釈駅10μlを105のD29バクテリオファージ(ファージ)を含む10μlの7H9、OADCと混合した。対照サンプルも、
a)BCGを含まず、但しあらゆるBCGを含まない媒体10μlをファージと混合し;そして
b)ファージと混合する前にBCGを80℃において30分間加熱することにより加熱殺菌した対照
を含むように設定した。
工程3. 37℃において90分間インキュベーションした後、20μlの1.2%(v/v)HClを添加して、外部ファージ粒子を不活性化した。
工程4. 次に、20μlの22.2mM NaOHを加えて酸性を中和した。
工程5. 次に、10μlのこの溶液を、7H9、OADC、定常期のミコバクテリウムスメグマティスの培養液を5%(v/v)および1.5%のバクトアガー(ディフコ)を含むカンテンプレートにスポットした。
工程6. 次に、プレートを37℃においてインキュベートした保護された内部ファージ粒子がBCG細胞中で複製できるようにした。複製したファージ粒子はBCG細胞の溶解を起こさせて放出された。少なくとも幾つかの放出されたファージ粒子はミコバクテリウムスメグマティスに感染してこれらの早く成長する細胞中の感染サイクルを確立した。
工程7. 16時間後、次にプレートは、非感染のミコバクテリウムスメグマティスインディケーター細胞の曇った生育の間のファージの溶解またはプラークの透明なエリアについて観察した。結果を記録して以下に示す:
+ 個々のプラークが観察される計数するには多すぎる
− プラークなし
熱殺菌したBCGおよびファージのみの対照は陰性のままであり、酸による不活性化からファージが保護されるためには、生きた細胞が必要であることを示した。生きたBCGはファージを保護することができて、感染してBCG細胞内で複製した。BCG細胞の溶解に際して、複製したファージ粒子は放出されて少なくとも幾つかのファージは早く生育するミコバクテリウムスメグマティス中で複製サイクルを始め、16時間後にプラークを生じた。溶解を示したBCGの最も高い希釈液は10-2であったが、用いた元のBCG培養液がまだ初期対数期にあったので、約103BCGコロニー形成ユニットを表す。このアッセイは、したがって、与えられたサンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの生存数ほんの103の存在を検出する能力を有する。この感度は顕微鏡に関して記載された感度より高く、慣用法をミコバクテリアの検出に適用した場合の培養物の感度とほぼ同じである。しかしながら、観察可能なプラークを作らせるのに要する時間は、慣用の培養技術に要する4−6週に比して24時間より短かった。
実施例2
実施例1の方法を繰り返したが、固体カンテン培地中でアッセイ実施した点、並びに酸処理によらずに洗浄により外部ファージを除去した点が異なる。
工程1. 工程1は実施例1に記載された通りに実施した。
工程2. BCG培養物の連続10倍希釈を7H9,OADC中で実施した。各希釈物10μlをカンテンプレート(7H9,OADC,1.5%バクトアガー)上にスポットした。加熱殺菌したBCG培養物10μlも同様のプレート上にスポットして対照プレートを提供した。プレートは37℃に保った。
工程3. 1片のフィルターペーパーを7H9,OADC,3%ミルクパウダー,ミリリットルあたり106のD29バクテリオファージで湿潤した。
工程4. 5片のフィルターペーパーの堆積物をファージに浸したフィルターペーパー上におき、そしてフィルターペーパーの堆積物を通した毛管作用により感染細胞の周囲から外部ファージを除去した。
工程5. フィルターペーパーの堆積物を完全に湿潤させた場合、すべてのフィルターペーパーをカンテン表面から除去して捨てた。
工程6. 次に、ニトロセルロースフィルターを用いてカンテン表面から感染細胞を取り除いた(stripped)。ニトロセルロースフィルターをカンテン上におき、湿潤させてはがした。次に、このフィルターを、より早く生育するミコバクテリウムメグマティスのインディケーター細胞(7H9,OADC,定常期のミコバクテリウムスメグマティス培養液5%(v/v)、1.5%バクトアガー)を含むカンテンプレート上の下方の細胞側においた。
工程7.プラークが視覚により観察できるまで、工程6のプレートを37℃においてインキュベートし、結果を記録した。
+++ インディケーター細胞の完全な溶解(細胞生育なし)
++ プラーク間にインディケーター細胞の幾らかの生育を伴うプラーク
+ 個々のプラークは観察される計数するには多すぎる
− プラークなし
加熱細菌された対照は再び陰性のままであったことから、洗浄による除去からのファージの保護には、生きた細胞が必要であったことが示された。生きたBCGは再び、感染してBCG細胞内で複製したファージを保護することができた。BCG細胞の溶解時に、複製したファージは放出されて少なくとも幾つかのファージは早く生育するミコバクテリウムスメグマティス中で複製サイクルを始め、16時間後にプラークを生じた。溶解を示したBCGの最も高い希釈液は10-3であったが、用いた元のBCG培養液がまだ初期対数期にあったので、約103BCGコロニー形成ユニットを表す。このフォーマット中のこのアッセイは、したがって、与えられたサンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの生存数ほんの103の存在を検出する能力を有する。
実施例3
この実施例は、バクテリアアッセイを実施するための別の方法を例示する。
ファージ感染工程のための痰サンプルの加工:
完全痰サンプルを滅菌20mlスクリューキャップしたガラスボトル中に入れる。
1. 等量の「浄化剤」をサンプルに添加してサンプルを浄化して液体化する。
2. 希釈サンプルを数回倒置することにより混合して、混合物を10分間放置して痰を液体化する。
3. 次に、サンプルを4000×gにて10分間遠心分離して、細菌を沈殿させる。
4. その結果の上清液体を、希釈しないハイコリン(Hycolin)殺菌剤に注ぎ、捨てる。
5. 細菌沈殿物を再び20mlの滅菌蒸留水に懸濁する。
6. 懸濁した細菌混合物を工程4と同じように遠心分離して細菌を沈殿させる。
7. 細菌沈殿物を次に1.0mlの「生育媒体」中に再懸濁して35−37℃において24時間放置してサンプルをアッセイ試験に提供する。
8. 対照サンプルは、1.0mlの「生育媒体」を新しいチューブに加えて不活性化対照を提供して;そして「ヘルパー細胞」1滴を新しいチューブ中の1.0mlの「生育媒体」に添加して、内部ファージの保護に関する陽性対照を提供する。
細菌へのバクテリオファージの感染
9. 滅菌パステット(pastette)を用いて、1滴(50μl)の「バクテリオファージ」を、各試験サンプル並びに不活性化対照サンプルに添加する。振盪により混合して、3.0時間、35−37℃において振盪せずにインキュベートする。内部ファージの保護に関する陽性対照はこの時間を進行させない。
10. サンプルにバクテリオファージを添加して2.5時間後に、ミコバクテリウムスメグマティスの沈殿を陽性対照チューブに添加する。
11. すべての試験サンプルおよび対照サンプルを各々全部で3時間インキュベートする。2滴(100μl)の「不活性化試薬」を滅菌パステットとともに各サンプル並びに対照サンプルに添加する。サンプルを完全に混合して5分間放置する。
12. 滅菌プラスチックパステットを用いて、「生育媒体」を各サンプル中の5mlの目盛線まで添加して、含有物を混合して、4時間、35−37℃において振盪せずにインキュベートする。
バクテリオファージのプラークの視覚化
13. 滅菌プラスチックパステットを用いて、1.0mlの「ヘルパー細胞」を各試験サンプルおよび対照サンプルに添加する。
14. 5mlの溶解基材カンテンを各サンプルに添加して、サンプルとカンテンをゆっくりとした渦巻きにより混合する。
15. 各チューブの含有物を冷却した対応の標識した「インディケータープレート」に添加する。
16. 「インディケータープレート」はベンチ上に30分間放置してカンテンを固化させる。
17. 「インディケータープレート」を37℃において15時間おく。
18. 各「インディケータープレート」上のプレート数を、暗いバックグラウンドに対してプレートを観察することにより視覚により数える。プレート上において、「ヘルパー細胞」の生育は、バクテリオファージがこの濁りの中で明瞭または透明なエリアとして観察されるので(プラーク)溶解エリアと共に不透明なエリアとして観察される。
対照チューブの検査
試験サンプル中の結果を分析する前に、不活性化対照サンプルについて、不活性化処理後も生きているファージによる溶解の発生に関して試験する。このプレート上には10未満のプラークが存在するべきである。10プラークより多ければ、外部ファージの化学不活性化が不安全であって、アッセイを繰り返さねばならない。陽性対照プレートをプラークに関して試練する。広範囲な溶解が生じるべきであり、このプレート上には多数のプラークが存在するべきである。幾つかの状況においては、プレートがバクテリアの芝生を有さないかもしれない結果を伴う細胞の完全な溶解のために、「ヘルパー細胞」の生育がまったくないかもしれない。
試験サンプルプレートの各々を試験して、プラークまたは溶解の存在を以下の基準に従い評価する:
+++ 完全な溶解、バクテリアの残渣なし
++ 完全な溶解であるが、幾つかのバクテリア残渣
+ プラークが重なり合うが幾つかのプラークは独立している
プラークの数を数えることができるならば、この数を記録する
− プラークが観察されない
溶解を示すそれらのプレートは、それらの痰サンプルが、ミコバクテリオファージの複製の宿主となる生存ミコバクテリアを含むことを示す。
肺結核患者からの8つの浄化された痰サンプルを上記ファージアッセイ技術により試験したところ、5つのサンプルが生存ミコバクテリウムツベルクロシスを含み、3つのサンプルが含まなかった。これらの結果を慣用のバクテリアサンプルの培養と比較すると、培養によると陽性であった5つのサンプルはファージアッセイでも陽性であり、即ち、バクテリオファージの生存および複製が支持され、一方培養によると陰性であった3つのサンプルもファージアッセイにより陰性であり、バクテリオファージの生存および複製を支持しなかった。
上記試験法において用いた試薬は以下のとおりである:
浄化剤:2グラムのNaOH,0.5%のN-アセチルL-システインを滅菌蒸留水中に含む100ml
生育媒体:0.1%グリセロールを付加された7H9,OADC
基材カンテン:1.5%バクトアガーを添加した生育媒体
バクテリオファージ:プレート溶解物から調製したバクテリオファージD29。コンフルエントな溶解を示す90mmトリ皿を10mlの7H9,OADC,0.1%のグリセロール、1mMのCaCl2で浸して冷蔵庫の中に一晩(16時間)放置した。パステットを用いて液体をプレートから回収して4000×gにて15分間遠心分離した。上清の液体を0.4μフィルターでフィルター滅菌して、分注して4℃において保存した。
ヘルパー細胞:定常期まで生育させて4℃に保存したミコバクテリウムスメグマティス。
不活性化剤:100mMの硫酸アンモニウム鉄、フィルター滅菌した。
実施例4:
本発明の原理は、安全モデル系中のミコバクテリアの薬剤感受性試験について試験した。BCGを感受性ミコバクテリア(低濃度のイソニアジドおよびリファンピシンに感受性)のモデルとして使用し、遺伝学上イソニアジドには耐性であってリファンピシンに一部耐性のミコバクテリウムスメグマティスを耐性または半耐性ミコバクテリアのモデルとして用いた。
工程1. カンテンを基材とする媒体からのBCGコロニーを、7H9,OADC中の液体培地中において37℃にて2週間生育させて、検出アッセイにおいて使用できる薬剤感受性細胞のストックを生成した。同様に、ミコバクテリウムスメグマティスのストックを、24時間、7H9,OADC中にて生育させて、薬剤耐性細胞のストックを生成した。臨床において、これらの細胞は臨床サンプルから直接起こせるはずであり、この前培養工程を必要としない。臨床においては、薬剤感受性細胞はミコバクテリウムツベルクロシスのさまざまな株であるかまたは単離物である。
工程2. 各培養物100μlを72時間イソニアジドおよびリファンピシンと共にさまざまな濃度にて3mlの体積の7H9,OADC中でインキュベートした。この工程は、細胞が抗生物質薬剤により影響を受けるのに必要である。薬剤を含まない対照も用意した。
工程3. 各培養物100μlを次の試験のために取り出した。
工程4. 5×106のD29ファージを含む800μlの7H9,OADCを添加して37℃において、BCGの培養に関しては4.5時間あるいはミコバクテリウムスメグマティスの培養に関しては40分間のいずれかでインキュベートした。加熱殺菌したBCGおよびミコバクテリウムスメグマティスおよびファージのみのサンプルも対照実験として含んだ。
工程5. 次に、外部ファージは100μlの酸バッファー(32.2mlの0.1Mクエン酸2ナトリウムおよび67.8mlの0.1M HCl)の添加により不活性化した。
工程6. 5分後、84μlの1.0M NaOHを添加して酸性を中和した。
工程7. さらに4mlの7H9,OADCを添加してミコバクテリウムスメグマティス培養物を直接プレートした。BCG培養物は、しかしながら、37℃において3時間インキュベートして内部の保護されたファージがあらゆる生存細胞中で複製するのを可能にさせた。
工程8. 次に、100μlの各培養物を、定常期のミコバクテリウムスメグマティス5%(v/v)および0.7%のバクトアガー(ディフコ)を含む5mlの液体7H9,OADCと混合して50mmのペトリ皿に注いだ。
工程9. カンテンが固まった後に、プレートを37℃において16時間インキュベートした。この時間の間、生育可能なミコバクテリア中での酸処理後に生存していたあらゆる内部ファージが複製して最初の標的細胞を溶解して、少なくとも幾つかのこれらファージはより早く生育するミコバクテリウムスメグマティスインディケーター細胞中で新たな複製サイクルを確立した。
工程10. 次に、非感染インディケーター細胞の濁った生育の間のファージ溶解またはプラークの明瞭なエリアに関して、プレートを観察した。結果は記録されて以下に示される:
この表は、さまざまな抗生物質の存在下で生育させた異なるミコバクテリアに関して観察されたプラークの数を示す。
++ プラークが重なり合っており、プラークの間でインディケーター
細胞が幾らか成長している
+ 個々のプラークが観察されるが、計数するは多すぎる
ゆっくりと生育するミコバクテリウムツベルクロシスは、イソアニジドおよびリファンピシンに感受性である。リファンピシンの存在下で生育させると、細胞は殺されて、その結果、不活性化から保護されてそれらの生育を支持する生存細胞がなくなる。全濃度のリファンピシン存在下で観察されたプラークの数はバックグラウンドレベルを優位に越えず;バックグラウンドは加熱殺菌されたサンプルにおいて観察されたプラークの数であった。早く生育するミコバクテリウムスメグマティスは、しかしながら、低濃度のリファンピシンに耐性であり、これは最も低いリファンピシン濃度においては多数のプラークが観察されうる。リファンピシン濃度が増加するにつれて、細胞は影響されてプラーク数が次第に低下する。
ミコバクテリアにおけるリファンピシンの作用は迅速であることが知られているが、イソアニジドはその作用を及ぼすのに幾らか時間がかかる。結果として、もっとも低濃度のイソニアジドにおいて、BCGは影響を受けなかったし、これは観察されたプラーク数に反映されており、薬剤を含まない対照において観察されたプラーク数の近辺であった。高い濃度のイソニアジドにおいては、しかしながら、これらの細胞の死を反映する顕著なプラーク数の低下があった。対照的に、ミコバクテリウムスメグマティスはイソニアジドによりほとんど影響されず、最も高い濃度においてプラーク数のわずかな低下があったにすぎない。
この実験は、本発明がゆっくりと生育する細胞、例えばミコバクテリウムツベルクロシスの薬剤感受性を評価するのに使用できることを示す。このアッセイは簡単に実施することができ、少ない細胞数に実施でき、そして薬剤が細胞に影響を及ぼすのに必要な時間を含めて結果を4日以内に得ることができる。培養技術を必要とする慣用の薬剤感受性アッセイは多数の細胞を必要とし、そして結果を得るのに4週以上もかかる。慣用技術よりも早いバクテック(Bactec)システムは高価な器具の大きな完成品を必要とするが、本発明の方法は最小の器具しか必要とせず、安価であり、結核がより普通な第三世界の環境により適している。
したがって、本発明は、バクテリアに対する処理技術を評価する方法も提供し、該方法は、
i.バクテリアを処理にさらして、次に、
ii.a 処理されたバクテリアサンプルをバクテリアが許容するファージにより感染させ;
b 感染サンプル中の外部ファージ粒子を不活性化し;
c 第1バクテリアよりも早い速度で倍増する第2バクテリアの存在下で不活性化サンプルを培養し;そして
d プラーク形成の程度および/または第2バクテリアの成長の程度を評価する
ことによりバクテリアのサンプル中に残った生存バクテリア細胞の数を評価することからなる。
本発明の方法は、ファージに対する組成物の効果を評価するために使用することもでき、
a.ファージ粒子を組成物で処理し;
b.生きたファージを許容する第1バクテリアに、処理されたファージ粒子を感染させ;
c.感染第1バクテリア細胞にとって外部のファージ粒子を不活性化し;
d.第1バクテリアよりも早い速度、好ましくは2倍、典型的には4から10倍で倍増する第2バクテリアの存在下で不活性化細胞を培養し;そして
e.培養した第2バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および/または第2バクテリアの成長の程度を評価する
ことからなる。
本発明の方法のこの応用において、バクテリアの成長の程度はファージ粒子の最初の処理の効果またはその反対を示す。プラークが形成されないならば、最初の処理はファージ粒子を殺すかまたは不活性化して、即ち第1バクテリア細胞へのそれらの感染を妨害した。第2バクテリアの培養段階におけるこれらの細胞の複製は、第2バクテリア細胞を殺すかまたはその複製を妨害するファージ粒子を放出しなかった。培養した第2細胞は、即ち、バクテリア細胞の均一な成長を示す実質的に均一な発色または不透明さを示す。ファージ粒子を殺すかまたは不活性化するのに組成物が効果的でなかった場合、ファージ粒子は第1バクテリアに感染して、感染第1バクテリアの不活性化処理に対して保護される。感染細胞が第2バクテリアの存在下で培養された場合、ファージ粒子は複製して感染第1細胞を溶解して、第2バクテリア細胞に感染して、プラークまたは第2バクテリアの視覚上不均一な成長を与える。プラークまたは不均一な成長の程度は、存在するファージ粒子の数の指数を与え、そして即ち、ファージ粒子への初期処理の効率の範囲の指標を与える。本発明の方法のこの応用は、定量結果を与えないかもしれないが、組成物の定量効果を決定するために他の試験に供されうる、潜在性候補組成物同志を識別するために使用できる迅速な初期スクリーニング技術を提供する。
したがって、その最も広い側面において、本発明は第1バクテリアに関するアッセイの応答時間を高める方法を提供するが、
a.第1バクテリアが許容するファージ粒子による感染に第1バクテリアをさらす;
b.外部ファージ粒子を不活性化するように、感染したバクテリアを処理する;
c.処理されたバクテリアを、上記ファージまたはその複製物に許容性であって、第1バクテリアよりも早い速度、好ましくは2倍、典型的には4から10倍で倍増する第2バクテリアの存在下で培養する;そして
d.培養した第2バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および/または第2バクテリアの成長の程度を評価する
ことからなる。
Claims (47)
- 第1バクテリアに関するアッセイの応答の時間を減少させるための方法であって、以下:
a)第1バクテリアが許容するファージによる感染に、第1バクテリアをさらすこと;
b)外部ファージ粒子を不活性化するように感染バクテリアを処理すること;
c)上記ファージ粒子またはその複製体に許容性であって、第1バクテリアの倍増速度よりも早い速度で倍増する第2のバクテリアの存在下で、処理されたバクテリアを培養すること;および
d)プラーク形成の程度および/または培養した第2バクテリアの成長の程度を評価すること
による方法。 - 以下の工程:
a)第1バクテリアの生育可能なサンプルに該バクテリアに特異的なファージを感染させて、少なくとも幾つかのバクテリア細胞各々にひとつまたはそれ以上のファージ粒子を吸着させ;
b)バクテリア細胞により吸着されなかったファージ粒子を不活性化または除去し;
c)第1バクテリアの倍増速度より大きい倍増速度を有する少なくとも一つの他の第2バクテリアを含む媒体中で、感染第1バクテリアを培養して、少なくとも幾つかの第2バクテリア細胞が感染第1バクテリア細胞の溶解に際して放出されたファージ粒子により感染することとなり、上記感染細胞各々を感染サイクルの次の世代のさらなる感染源として作用させ;そして
d)工程c)のファージ粒子の集団および/または第2バクテリアの成長の低下を監視することにより、試験されるサンプル中の第1バクテリア細胞の存在を測定すること
からなる、サンプル中の第1バクテリアの存在を検出する方法を提供する、請求項1記載の方法。 - バクテリア細胞中で複製するファージ粒子の能力を評価することによりファージ粒子に対するウイルス制御組成物または殺ウイルス剤の効果を評価する方法を提供する請求項1記載の方法であって、
ファージ粒子を組成物で処理し、そして
a)生きたファージを許容する第1バクテリアに、処理されたファージ粒子を感染させ;
b)感染第1バクテリア細胞にとって外部のファージ粒子を不活性化し;
c)第1バクテリアよりも早い速度で倍増する第2バクテリアの存在下で感染した第1バクテリア細胞を培養し;
d)培養した第2バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および/または第2バクテリアの成長の程度を評価し;そして
e)(i)プラークの形成の程度および/または第2バクテリアの生育の程度と、(ii)ウイルス制御組成物または殺ウイルス剤の不在下でのプラークの形成の程度および/または第2バクテリアの生育の程度を、相関させることより、ファージ粒子上のウイルス制御組成物または殺ウイルス剤を評価すること
からなる方法。 - バクテリアに対する処理効果を評価する請求項1記載の方法であって、
i)バクテリアを処理にさらし、そして次に、
ii)a)処理されたバクテリアサンプルを、バクテリアが許容するファージにより感染させ;
b)感染サンプル中の外部ファージ粒子を不活性化し;
c)第1バクテリアよりも早い速度で倍増する第2バクテリアの存在下で不活性化サンプルを培養し;
d)プラーク形成の程度および/または第2バクテリアの成長の程度を評価し;そして
e)(i)プラークの形成の程度および/または第2バクテリアの生育の程度と、(ii)工程i)のバクテリアの処理の不在下でのプラークの形成の程度および/または第2バクテリアの生育の程度を、相関させることにより、バクテリアの処理の効果を評価すること
からなる方法。 - 第1バクテリアが、7H9として知られる培地を90%(v/v)およびOADCとして知られる栄養を10%(v/v)含む培養媒体中で37℃において10時間より高い倍増速度を有する、請求項1ないし4の何れか1項記載の方法。
- 第2バクテリアが第1バクテリアの倍増速度より少なくとも2倍高い倍増速度を有する、請求項1ないし4の何れか1項記載の方法。
- 第2バクテリアが第1バクテリアの倍増速度より4から10倍高い倍増速度を有する、請求項6記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウム種またはレジオネラ種である、請求項7記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスである、請求項8記載の方法。
- 第2バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスである、請求項8記載の方法。
- 第1バクテリアが2から10時間の倍増速度を有する、請求項1ないし4の何れか1項記載の方法。
- 第1バクテリアのファージ感染が55℃までの温度並びに10分間から10時間に間実施される、請求項1記載の方法。
- ファージが、AG1,B1,BG1,BK1,C3,D29,D34,D56A,GS4E,HP1,L1,I3またはTM4である、請求項1記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスであり、第2バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスであり、そしてファージがD29またはTM4である、請求項1記載の方法。
- i)感染第1バクテリア細胞から外部ファージ粒子を分離するために感染バクテリア材料を洗浄および濾過するか;または
ii)外部ファージ粒子を殺すかまたは不活性化するために感染第1バクテリア材料を殺ウイルス剤、酸または界面活性剤により処理するか;および/または
iii)バクテリア細胞から分離した基質上に、第1バクテリア材料からの外部ファージ粒子を選択的に吸着させる
ことにより、工程b)において外部ファージ粒子を不活性化する、請求項1記載の方法。 - 第2バクテリアが初期量にて工程c)において提供されて、感染第1バクテリアと培養される第2バクテリアの混合物中の2から50倍の数の第1バクテリア細胞を提供する、請求項1記載の方法。
- さらにバクテリア細胞の成長および溶解が停止する実質的な定常状態に到達するまで上記方法の培養工程c)を実施する、請求項1記載の方法。
- i)第1バクテリアのための公知のファージ感染源;
ii)第1バクテリアの倍増速度より高い速度を有して且つファージ感染により感染した第1バクテリアから放出されるファージ粒子に許容性の生育可能な第2バクテリア源
を含む、サンプル中の第1バクテリアの在否を検出するための、請求項1記載の方法において使用するための診断キット。 - ファージ感染源により感染した第1バクテリアからの外部ファージ粒子を不活性かおよび/または除去する手段も含むことを特徴とする、請求項18記載の診断キット。
- 第1バクテリアがミコバクテリウムエビウムである、請求項8記載の方法。
- 第2バクテリアがミコバクテリウムアウルムである、請求項8記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウムエビウムであり、第2バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスであり、そしてファージがD29またはTM4である、請求項1記載の方法。
- 哺乳類から得たサンプルにおいて細菌感染を検出する方法であって、
a)第1バクテリアに感染した疑いのある哺乳類から得たサンプルを用意するが、但し、当該サンプル又はその一部は第1バクテリアを含む疑いがあり;
b)サンプルまたはその一部をファージ粒子に暴露するが、第1バクテリアは上記ファージによる第1バクテリアの感染に適した条件下で許容性であり;
c)工程b)において生じさせたサンプル又はその一部を処理することにより外部ファージ粒子を不活性化し;
d)工程c)において生じさせたサンプルまたはその一部を、上記ファージまたはその複製体に対して許容性であって、第1バクテリアの倍増速度よりも早い速度で倍増する第2のバクテリアの存在下で培養すること;および
e)プラーク形成および/または第2バクテリアの成長を評価するが、その際、適切な対照に対してのプラーク形成および/または成長の増加が、上記哺乳類が第1バクテリアに感染したことの指標であること
からなる方法。 - サンプルがヒトから得たサンプルである、請求項23記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウム種またはレジオネラ種である、請求項23記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスである、請求項25記載の方法。
- 第1バクテリアがミコバクテリウムパラツベルクロシスまたはミコバクテリウムエビウムである、請求項25記載の方法。
- 第2バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスである、請求項23記載の方法。
- 第2バクテリアがミコバクテリウムアウルムである、請求項23記載の方法。
- 第1バクテリアがレジオネラニューモフィラである、請求項25記載の方法。
- 第1バクテリアがヘリコバクター種、ストレプトコッカス種、リッケチア種、およびエクストリモービルズ種からなる群から選択される、請求項23記載の方法。
- 第1バクテリアがヘリコバクターピロリ、ストレプトコッカスアジャセンス、ストレプトコッカスデフェクテンス、およびリッケチアプロワゼキからなる群から選択される、請求項31記載の方法。
- ファージが、AG1,B1,BG1,BK1,C3,D29,D34,D56A,GS4E,HP1,L1,I3またはTM4である、請求項23記載の方法。
- サンプルが粘膜分泌物である、請求項23記載の方法。
- 粘膜分泌物が痰である、請求項34記載の方法。
- 哺乳類から得たサンプルにおいて結核菌を検出する方法であって、
a)ミコバクテリウム種に感染した疑いのある哺乳類から得たサンプルを用意するが、但し、当該サンプルはミコバクテリウム種を含む疑いがあり;
b)サンプルまたはその一部をファージ粒子に暴露するが、ミコバクテリウム種は上記ファージによるミコバクテリウム種の感染に適した条件下で許容性であり;
c)工程b)において生じさせたサンプル又はその一部を処理することにより外部ファージ粒子を不活性化し;
d)工程c)において生じさせたサンプルまたはその一部を、上記ファージまたはその複製体に対して許容性であって、ミコバクテリウム種の倍増速度よりも早い速度で倍増する第2のバクテリアの存在下で培養すること;および
e)プラーク形成および/または第2バクテリアの成長を評価するが、その際、適切な対照に対してのプラーク形成および/または成長の増加が、上記哺乳類が結核菌を有することの指標であること
からなる方法。 - ミコバクテリウム種がミコバクテリウムツベルクロシスである、請求項36記載の方法。
- ミコバクテリウム種がミコバクテリウムパラツベルクロシスまたはミコバクテリウムエビウムである、請求項36記載の方法。
- 第2バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスである、請求項36記載の方法。
- 第2バクテリアがミコバクテリウムアウルムである、請求項36記載の方法。
- ミコバクテリウム種がミコバクテリウムツベルクロシスであり、第2バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスであり、そしてファージがD29またはTM4である、請求項36記載の方法。
- サンプルが粘膜分泌物である、請求項36記載の方法。
- 粘膜分泌物が痰である、請求項42記載の方法。
- 哺乳類から得たサンプルにおいてレジオネラ種を検出する方法であって、
a)レジオネラ種に感染した疑いのある哺乳類から得たサンプルを用意するが、但し、当該サンプルはレジオネラ種を含む疑いがあり;
b)サンプルまたはその一部をファージ粒子に暴露するが、ミコバクテリウム種は上記ファージによるレジオネラ種の感染に適した条件下で許容性であり;
c)工程b)において生じさせたサンプル又はその一部を処理することにより外部ファージ粒子を不活性化し;
d)工程c)において生じさせたサンプルまたはその一部を、上記ファージまたはその複製体に対して許容性であって、レジオネラ種の倍増速度よりも早い速度で倍増する第2のバクテリアの存在下で培養すること;および
e)プラーク形成および/または第2バクテリアの成長を評価するが、その際、適切な対照に対してのプラーク形成および/または成長の増加が、上記哺乳類がレジオネラ種を有することの指標であること
からなる方法。 - レジオネラ種がレジオネラニューモフィラである、請求項44記載の方法。
- サンプルが粘膜分泌物である、請求項44記載の方法。
- 粘膜分泌物が痰である、請求項46記載の方法。
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