CN102864125B

CN102864125B - 一种单克隆杂交瘤的制备方法

Info

Publication number: CN102864125B
Application number: CN201210280494.4A
Authority: CN
Inventors: 殷志敏; 周军; 冯展波; 王玉燕; 潘杨斌
Original assignee: NANJING BAAODE BIO-TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Nanjing Biogot Biotechnology Co ltd; Yin Zhimin
Priority date: 2012-08-08
Filing date: 2012-08-08
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2032-08-08
Also published as: CN102864125A

Abstract

本发明提供了一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：步骤一，融合：使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤细胞与抗原免疫后的淋巴细胞，得融合细胞；步骤二，培养：将融合细胞接入HAT液体培养基中于二氧化碳培养箱中培养，得杂交瘤细胞；步骤三，筛选：将杂交瘤细胞上清液采用间接ELISA筛选，得阳性杂交瘤细胞；步骤四，亚克隆：将阳性杂交瘤细胞接入亚克隆半固体培养基中于二氧化碳培养箱培养，得单个杂交瘤细胞集落；步骤五，扩大培养：取单个杂交瘤细胞集落的细胞接入胎牛血清培养液中于二氧化碳培养箱中扩大培养，即得单克隆杂交瘤细胞。该制备方法培养周期短、成本低、筛得的阳性克隆细胞株全。

Description

一种单克隆杂交瘤的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种单克隆杂交瘤的制备方法。

背景技术

自从Kohler和Milstein发明单克隆抗体技术以来，该技术不断发展完善，在生物医药领域疾病的诊断、治疗以及科学研究中得到了广泛应用，市场需求越来越大。但制备单克隆抗体一个必不可少的环节而且也是最重要环节就是阳性杂交瘤的克隆建系。

融合后筛选出的杂交瘤细胞群系不完全是纯系，仍属于异质性的细胞群。因此，必须根据实验目的对杂交细胞群体进一步纯化，以便获得同质性的细胞群体。最常用的纯化方法就是杂交瘤细胞的克隆化培养。

克隆化培养是指单个杂交细胞在一个独立的空间增值，最终扩增为一群相对较纯的，且能够稳定表达某些特定性状的细胞群体的培养方式。用于这种方法的细胞群体由于均来源于同一个祖先细胞，故可认为其遗传特性较为一致。常见的克隆化培养方法有以下五种：

1：有限稀释法

这是一种比较传统的方法，即将ELISA检测出的阳性孔，稀释到4-8细胞/mL。取20mL放入96孔培养板中培养。这样约有36%的孔含有1个细胞，当细胞长到20~80%孔底时，用ELISA检测，将检测出的阳性孔按照上述方法再克隆，直到所有具有杂交瘤的孔中都呈阳性，即阳性率需达到100%。此亚克隆方法的缺点有：1、对细胞的计数要求非常高；2、由于阳性的克隆容易被阴性的克隆所排挤，导致阳性克隆容易丢失；3、由于需要反复克隆再克隆，细胞培养的工作量大、操作繁琐、克隆效率低。因此，它不能适应需要建立几十株以上杂交瘤的功能性抗体筛选的研究。但用甲基纤维素制成半固体培养基可以克服以上方法的局限性，直接进行克隆化的培养，提高了工作效率。

2：甲基纤维素半固体培养基一步法

国内外均有报道选用甲基纤维素半固体培养基法筛选杂交瘤细胞，此法是将细胞接种于半固体培养基里使细胞以分散的方式单个生长，增值后的细胞后代不能迁移，只是在祖先细胞邻近形成细胞集落，然后挑出这些细胞集落再进行扩大培养，获得较纯的杂交瘤细胞群体的方法。半固体培养基最常见的有软琼脂培养基和甲基纤维素培养基。但这个方法应用并不广泛，主要原因是在甲基纤维素半固体培养环境下，杂交瘤细胞生长受到限制，其生长状态不如液体培养基好，原因可能是因为甲基纤维素限制杂交瘤细胞葡萄糖的利用，增加了氨基酸的消耗。由于融合后的细胞膜较脆弱，其最适的培养基是液体培养基，因而不容易在半固体培养基中生长。因而用甲基纤维素半固体培养基一步法需要加入昂贵的细胞因子等来促进杂交瘤的存活，才有利于简化实验步骤，但是很多细胞因子的成份都是商业化的，因此其缺点就是增加了成本。软琼脂半固体培养基法，此方法由于琼脂粉中存在有对细胞有毒性的物质，容易导致细胞长出来的较少，同时由于琼脂在室温下操作容易凝固，故需要在较高的温度下加入细胞，由于温度控制不好，可能直接导致细胞死亡。

3：凝血素半固体培养基法

此种方法需要使用凝血因子使得培养基凝固，使得杂交瘤长出来的较少，因此不太常用。

4：单细胞显微技术

这一方法是通过显微操作分离单个杂交细胞，然后将其植入单个培养空间，最终获得单个杂交细胞的后代。但用于显微操作的杂交细胞应具备可辨认的独特形态学特征，并且需借助倒置显微镜。

5：荧光激活分选

此方法是采用激活分选仪进行的。方法是用荧光物质标记特选的杂交细胞，然后将细胞悬液通过分选以上的细胞喷嘴，可形成单个细胞液滴。此法的基本原理是被荧光标记的待选细胞在激光照射下能够发射荧光，再通过调整仪器参数使发射不同荧光的单个细胞液滴带不同电荷，这些具有不同电荷的细胞液滴在电场中的偏转角度不同，因此利用这一原理通过电脑处理，可分离不同杂交瘤。加入特定的荧光物质，这些荧光物质能够特异性的在阳性杂交瘤的周围形成激光激发下的明亮的荧光光环，从而使得阳性杂交瘤的筛选和亚克隆一步到位，大大节约了时间和劳力，但是由于其专利的技术和高昂的设备及试剂费用阻碍着其成为一种常规的单抗生产方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种成本低、效率高的单克隆杂交瘤的制备方法。

技术方案：本发明提供的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）融合：使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤细胞与抗原免疫后的淋巴细胞，得融合细胞；

（2）培养：将融合细胞接入次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶（HAT）液体培养基中于二氧化碳培养箱中培养，得杂交瘤细胞；

（3）筛选：将步骤（2）中含杂交瘤细胞的HAT液体培养基的上清液采用间接ELISA筛选，得阳性杂交瘤细胞；

（4）亚克隆：将阳性杂交瘤细胞接入亚克隆半固体培养基中于二氧化碳培养箱培养，得单个杂交瘤细胞集落；

（5）扩大培养：取单个杂交瘤细胞集落的细胞接入胎牛血清培养液中于二氧化碳培养箱中扩大培养，即得单克隆杂交瘤细胞。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的一种优选，步骤（1）中，所述淋巴细胞为小鼠脾细胞，所述骨髓瘤细胞包括sp2/0细胞或NS-1细胞。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的另一种优选，步骤（1）中，所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞的细胞数量比为（10-2）：1，所述聚乙二醇的分子量为1000-6000，所述聚乙二醇水溶液的体积分数为40-60%。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的另一种优选，步骤（1）中，将融合细胞接入含胎牛血清培养液中于二氧化碳培养箱中培养；从而使融合细胞生长更好，获得更多的融合细胞，有利于步骤（2）的进一步培养。作为进一步优选，所述胎牛血清培养液的胎牛血清体积百分比为10％-20%，所述培养箱中二氧化碳浓度为5-7%，培养温度为25-37℃，培养时间为16-24h。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的另一种优选，步骤（2）中，HAT液体培养基为HAT水溶液，其中HAT的体积百分比为2-5%，培养箱中二氧化碳浓度为5-7%，培养温度为25-37℃，培养时间8-12d。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的另一种优选，步骤（4）中所述亚克隆半固体培养基的配方为：

谷氨酰胺I水溶液 0.1-1.0mL，体积分数0.25％-2.5%；

非必需氨基酸水溶液(MEM) 0.1-1.0mL，体积分数0.25％-2.5%；

β－巯基乙醇 0.1-1.0mL，体积分数0.25％-2.5%；

次黄嘌呤-胸腺嘧啶（HT）水溶液 0.1-1.0mL，体积分数0.25％-2.5%；

青霉素及链霉素水溶液 0.1-1.0mL，体积分数0.25%—2.5%；

胎牛血清水溶液 5-10mL，体积分数12.5%—25%；

甲基纤维素 0.1-1g，2.5mg/ml—25mg/ml；

DMEM高糖水溶液 25-35mL，体积分数62.5%—87.5%。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的另一种优选，步骤（4）中，所述培养箱中二氧化碳浓度为5-7%，培养温度为25-37℃，培养时间为7-14天。

作为本发明单克隆杂交瘤细胞的制备方法的另一种优选，步骤（5）中，所述培养液为体积百分比的10%-20%胎牛血清培养液，所述培养箱中二氧化碳浓度为1-5%，培养温度为25-37℃，培养时间为3-5天。

有益效果：本发明提供的单克隆杂交瘤细胞的制备方法培养周期短、成本低、筛得的阳性克隆细胞株全。

该方法首先采用液体培养基培养融合细胞，并通过HAT液体培养基筛选得阳性杂交瘤细胞，最后用未添加细胞因子的亚克隆半固体培养基对阳性杂交瘤细胞培养制备得到单克隆杂交瘤细胞。

该方法通过控制亚克隆半固体培养基中甲基纤维素的含量，在二氧化碳培养箱中培养，得到大量肉眼可见的单个杂交瘤细胞集落，该方法与现有技术相比，其显著优点是：

一是，采用液体培养基培养融合细胞可以使刚融合的细胞处于好的生长状态，从而保证筛到所有的阳性克隆细胞株，有效避免了融合细胞在半固体培养基中成活率低的问题；

二是，亚克隆半固体培养基采用甲基纤维素培养基，一方面该培养基制备方法简单，粘度易控制，细胞在其中可呈现单克隆集落生长，另一方面基纤维素对细胞的毒性小，甲基纤维素半固体培养基适合于杂交瘤细胞的生长；因此只需一次亚克隆即可得到单克隆，大大缩短了亚克隆过程中的时间和减轻了亚克隆的工作量。

三是，亚克隆在液体培养基培养之后进行，此时杂交瘤细胞达到较好状态，因此半固体培养基中不添加细胞因子也能使得单个杂交瘤细胞长出来，大大的降低了生产成本。

附图说明

图1a为在甲基纤维素半固体培养基中生长的杂交瘤细胞群。

图1b为在显微镜下甲基纤维素半固体培养基中生长的单个杂交瘤细胞群（放大10倍）。

图2为单克隆抗体亚型鉴定结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，大家可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

所用试剂：

1、甲基纤维素（Methyl cellulose） (Sigma,CAT:9004-67-5)

2、DMEM高糖水溶液（Hyclone,CAT:SH30022.01B）

3、β－巯基乙醇(2-ME) (Sigma,CAT:M3148)

4、0.22μm滤膜 (Millipore,CAT:SLGU33RB)

5、次黄嘌呤-胸腺嘧啶（HT）水溶液（Gibco,CAT:21060-017）

6、胎牛血清水溶液（Hyclone,CAT;SV30087.02）

7、谷氨酰胺I水溶液 (Invitrogen,CAT:35050061)

8、非必需氨基酸（MEM)水溶液 (Gibco,CAT:11140-050)

9、青霉素及链霉素水溶液（Hyclone,CAT:SV30010）

所用溶液及培养基配制方法：

（1）甲基纤维素母液：

称取甲基纤维素固体于三角烧瓶中，加入干净的转子。使用铝箔纸密封后，高温高压灭菌。在无菌的条件下加入冰冷的DMEM高糖溶液后，4℃快速搅拌12-24小时，直至甲基纤维素全部溶解。

（2）β－巯基乙醇母液：

取β－巯基乙醇加入DMEM高糖溶液中,使用0.22μm的滤膜过滤除菌。

（3）亚克隆半固体培养基：

在在灭好菌的50mL离心管中依次加入以下配方并上下颠倒剧烈混匀6-10次。

谷氨酰胺I水溶液市售 0.1-1.0mL，在培养基中体积分数0.25％-2.5%；

非必需氨基酸水溶液市售 0.1-1.0mL，在培养基中体积分数0.25％-2.5%；

β－巯基乙醇市售 0.1-1.0mL，在培养基中体积分数0.25％-2.5%；

次黄嘌呤-胸腺嘧啶水溶液市售 0.1-1.0mL，在培养基中体积分数0.25%—2.5%；

青霉素及链霉素水溶液市售 0.1-1.0mL，在培养基中体积分数0.25%—2.5%；

胎牛血清水溶液市售 5-10mL，在培养基中体积分数12.5%—25%；

甲基纤维素市售 0.1-1g，在培养基中浓度为2.5mg/ml—25mg/ml；

DMEM高糖水溶液市售 25-35mL，在培养基中体积分数62.5%—87.5%。

实施例1克隆杂交瘤细胞的制备。

1.融合：

取常规免疫后的小鼠的脾细胞与状态好的sp2/0细胞，控制脾细胞和sp2/0细胞数量比在5：1，使用体积分数为50%的PEG 4000融合；可选地，也可以控制脾细胞和sp2/0细胞数量比在（10-2）：1之间，也可以选择分子量范围在1000-6000的PEG。

将融合后的细胞使用20%的胎牛血清培养液在37度5-7%的二氧化碳培养箱中培养16小时。

2.培养：

轻轻吹下杂交瘤细胞并离心沉淀后使用5-10mL常规的HAT的体积百分比为2%的HAT液体培养基重悬后再用上述培养基定容至120mL，分装到6块96孔板中，200μL/孔；37℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养7天后使用HAT培养基全量换液。

3.筛选：

继续培养3天后开始吸上清液整板进行ELISA检测。

其中，ELISA检测方法如下：

3.1抗原包被：

用包被缓冲液将完全抗原进行稀释，以100μl/孔加入酶标板，4℃过夜，一般稀释浓度为2μg/ml；

3.2封闭：

取出酶标板，不用弃去孔内液体，配制75%的脱脂奶粉，每孔200ul，37℃温育1.5h；

3.3洗涤：

弃去孔内液体，用自来水洗12遍，然后拍干；

3.4加样：

吸取上清抗体检测加入各个孔的上清，同时做阳性对照（小鼠血清），阴性对照（PBST），100μl/孔，37℃1h；

3.5洗板：

弃去孔内液体，用自来水洗12遍，拍干；

3.6加入酶标二抗：

每孔加入1：5000—1：10000倍稀释的合适的酶标二抗（IgG-HRP）现配，100μl/孔，37℃1h；

3.7洗涤：

弃去孔内液体，洗板12次，拍干；

3.8显色反应：

加入新配的底物液（TMB使用液），100μl/孔，37℃避光反应15-20min；3.9终止：

每孔加终止液50μl，（2M H₂SO₄）振荡混匀；

3.10测定：

静置10-15min后于酶标仪上读取450nm处的OD值；

3.11结果判定：

若OD₄₅₀>0.5，则判断为阳性孔。

4.亚克隆：

选择ELISA检测阳性孔进行亚克隆；

用200μL/孔的DMEM重悬细胞后，计数细胞，取400-500个细胞放入40mL的亚克隆半固体培养基中，上下颠倒10-20次混匀后，静置5min；

将其中20mL分装到10个6孔培养皿中，使每个6孔培养皿中细胞数在40-50个，这样做的目的是争取在一次亚克隆即可达到单克隆；

再向剩下的20mL亚克隆半固体培养基中再次加入200个左右的细胞，重复上述操作，分装于5个中型培养皿中，每个中型培养皿细胞数在80-100，这样做目的是确保能够得到杂交瘤；

最后封好封口膜后置于37℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养7天后，使用封口膜可防止培养皿变干。

5.扩大培养：

长出肉眼可见的细胞集落后，使用微量移液器挑取培养皿中较分散的细胞集落到96孔细胞培养板中置于37℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养3天后扩大培养，即得单克隆杂交瘤细胞。

采用有限稀释法、甲基纤维素半固体培养基法和本发明方法相比，各自所需时间见表1。

表1不同方法制备方法所需时间

实施例2克隆杂交瘤细胞的制备。

1.融合：

取常规免疫后的小鼠的脾细胞与状态好的NS-1细胞，控制脾细胞和NS-1细胞数量比在10：1，使用体积分数为60%的PEG 1000融合；可选地，也可以控制脾细胞和NS-1细胞数量比在（10-2）：1之间，也可以选择分子量范围在1000-6000的PEG。将融合后的细胞使用15%的胎牛血清培养液在25度5-7%的二氧化碳培养箱中培养24小时。

2.培养：

轻轻吹下杂交瘤细胞并离心沉淀后使用5-10mL常规的HAT的体积百分比为5%的HAT液体培养基重悬后再用上述培养基定容至120mL，分装到6块96孔板中，200μL/孔；25℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养7天后使用HAT培养基全量换液。

继续培养5天后开始吸上清液整板进行ELISA检测，方法同实施例1。

3.亚克隆：

选择ELISA检测阳性孔进行亚克隆；

最后封好封口膜后置于25℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养14天后，使用封口膜可防止培养皿变干。

4.扩大培养：

长出肉眼可见的细胞集落后，使用微量移液器挑取培养皿中较分散的细胞集落到96孔细胞培养板中置于25℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养5天后扩大培养，即得单克隆杂交瘤细胞。

实施例3克隆杂交瘤细胞的制备。

1.融合：

取常规免疫后的小鼠的脾细胞与状态好的sp2/0细胞，控制脾细胞和sp2/0细胞数量比在2：1，使用体积分数为40%的PEG 6000融合；可选地，也可以控制脾细胞和sp2/0细胞数量比在（10-2）：1之间，也可以选择分子量范围在1000-6000的PEG。将融合后的细胞使用10%的胎牛血清培养液在30度5-7%的二氧化碳培养箱中培养20小时。

2.培养：

轻轻吹下杂交瘤细胞并离心沉淀后使用5-10mL常规的HAT的体积百分比为4%的HAT液体培养基重悬后再用上述培养基定容至120mL，分装到6块96孔板中，200μL/孔；30℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养5天后使用HAT培养基全量换液。

3.筛选：

继续培养3天后开始吸上清液整板进行ELISA检测。

4.亚克隆：

选择ELISA检测阳性孔进行亚克隆；

最后封好封口膜后置于30℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养10天后，使用封口膜可防止培养皿变干。

5.扩大培养：

长出肉眼可见的细胞集落后，使用微量移液器挑取培养皿中较分散的细胞集落到96孔细胞培养板中置于30℃5-7%的二氧化碳培养箱中培养4天后扩大培养，即得单克隆杂交瘤细胞。

实施例4单克隆抗体制备及亚型鉴定。

1.单克隆抗体的制备

提前7-10天接种液体石蜡于8-12周龄Balb/c小鼠腹腔中，0.5-0.6mL/只；再用不完全培养基即DMEM培养基稀释的实施例1的单克隆杂交瘤细胞接种于每只已注射液体石蜡的Balb/c小鼠腹腔，计数板计数，约1.0×10^6个/mL，即大约0.5mL/只；

注射杂交瘤后大约5-7天后，每天观察记录Babl/c小鼠产生腹水状况，如果小鼠腹腔明显膨大即可用针头抽取腹水（针头标准为7号针头），一般可连续收集3-4次，通常每只小鼠收集5-10mL。

将腹水纯化后，即制得单克隆抗体。

2.单克隆抗体制备及亚型鉴定

将制得得单克隆抗体采用Sigma的亚型鉴定试剂盒（Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Reagents、Stock No.ISO-2）鉴定单克隆抗体亚型。细胞上清可采用抗原介导ELISA法和捕获ELISA法两种方法进行亚型鉴定。用抗原介导ELISA法基本步骤如下：

（1）抗原包被：用包被缓冲液将完全抗原进行稀释，以100μL每孔加入酶标板，37度温育1h，一般稀释浓度为2μg/mL；

（2）封闭：配制75%的脱脂奶粉，不需弃掉孔内液体，直接加入酶标板孔中，每孔200μL，37度温育1h；

（3）洗板：弃去孔内液体，用自来水洗12遍，拍干；

（4）加样：加入每个与包被原对应的亚克隆上清，同时以每个亚克隆上清按六个亚型做对应的六个孔，剩余两个孔做阴性对照（PBST），每孔100μL,室温反应2h；

（5）洗板：弃去孔内液体，用自来水洗12遍，拍干；

（6）加入六个亚型：按1:1000用PBST稀释个个亚型，以每孔100ul按顺序加入对应的亚型加入酶标板，记清楚对应加入的亚型顺序，室温反应30min；

（7）洗板：弃去孔内液体，自来水洗12遍，拍干；

（8）加入酶标记二抗：用PBST稀释1:5000，加入酶标板，每孔100μL，室温反应15min；

（9）洗板：弃去孔内液体，自来水12遍，拍干；

（10）显色：以每孔100μL计算所需的量，配制显色液（Na₂HPO₄.12H₂O+柠檬酸+双蒸水+TMB+H₂O₂）每孔100μL，37度温育15min；

（11）终止：每孔加终止液2mol/L H₂SO₄100μL震荡混匀；

（12）测OD值：在酶标仪450nm处检测OD值，记录数据（表2）；

（13）结果显示在C行IgG1处，数值最高；可以判定该细胞亚型为IgG1亚型。

图2显示了抗原介导ELISA法基本步骤后的最终显色情况；其中，第三行有明显显色，说明该检测的杂交瘤细胞株的亚型为IgG1。

表2单克隆亚型鉴定结果

Claims

1.一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)融合：使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤细胞与抗原免疫后的淋巴细胞，得融合细胞；

(2)培养：将融合细胞接入有HAT液体培养基的96孔板中，于二氧化碳培养箱中培养，得杂交瘤细胞；

(3)筛选：将杂交瘤细胞上清液采用间接ELISA筛选，得阳性杂交瘤细胞；

(4)亚克隆：将阳性杂交瘤细胞接入亚克隆半固体培养基中于二氧化碳培养箱培养，得单个杂交瘤细胞集落；

其中，所述亚克隆半固体培养基的配方为：

(5)扩大培养：取单个杂交瘤细胞集落的细胞接入胎牛血清培养液中于二氧化碳培养箱中扩大培养，即得单克隆杂交瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述淋巴细胞为小鼠脾细胞，所述骨髓瘤细胞包括sp2/0细胞或NS-1细胞。

3.根据权利要求1所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞的细胞数量比为(10-2)：1，所述聚乙二醇的分子量为1000-6000，所述聚乙二醇水溶液的体积分数为40-60％。

4.根据权利要求1所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，将融合细胞接入含胎牛血清培养液中于二氧化碳培养箱中培养。

5.根据权利要求4所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：所述胎牛血清培养液的胎牛血清体积百分比为10％-20％，所述培养箱中二氧化碳浓度为5-7％，培养温度为25-37℃，培养时间为16-24h。

6.根据权利要求1所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，HAT液体培养基的HAT的体积分数为2-5％，培养箱中二氧化碳浓度为5-7％，培养温度为25-37℃，培养时间8-12天。

7.根据权利要求1所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述培养箱中二氧化碳浓度为5-7％，培养温度为25-37℃，培养时间为7-14天。

8.根据权利要求1所述的一种单克隆杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述培养液为体积百分比的10％-20％胎牛血清培养液，所述培养箱中二氧化碳浓度为5-7％，培养温度为25-37℃，培养时间为3-5天。