CN1680444A - 抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1680444A
CN1680444A CN 200510048953 CN200510048953A CN1680444A CN 1680444 A CN1680444 A CN 1680444A CN 200510048953 CN200510048953 CN 200510048953 CN 200510048953 A CN200510048953 A CN 200510048953A CN 1680444 A CN1680444 A CN 1680444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
elisa
carmv
monoclonal antibody
virus
hole
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200510048953
Other languages
English (en)
Inventor
吴建祥
周雪平
陈正贤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN 200510048953 priority Critical patent/CN1680444A/zh
Publication of CN1680444A publication Critical patent/CN1680444A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途。用提纯的香石竹斑驳病毒免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆，获得5株能稳定传代并分泌抗CarMV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞，并分别制备它们的单抗腹水。5株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10－6以上，3G1、1B9、2A9和2F8的单克隆抗体类型及亚类均为IgG1，2F2的单克隆抗体类型及亚类为IgG3。5株单抗与CarMV有特异反应，而与其他病毒无交叉反应。利用这些单抗建立了对检测CarMV有高度特异性、灵敏性和正确性的ACP－ELISA、DAS－ELISA、和TAS－ELISA方法。本发明提供的香石竹斑驳病毒的单克隆抗体为CarMV的快速检测诊断、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该植物病毒病的防治打下基础。

Description

抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途。
背景技术
香石竹，又称康乃馨，是世界上四大鲜切花之一，也是我国主要的鲜切花(我国香石竹栽培发展很快，年产鲜切花达10亿枝以上)。但香石竹病毒广泛发生于世界香石竹栽培地区，引起香石竹品种退化，长势衰弱，植株畸形，花叶、花条变小，花碎色，叶茎和花出现枯斑，产量和品质下降，降低观赏价值和经济价值。发现感染香石竹的病毒有10多种，其中香石竹斑驳病毒(CarMV)是最主要的病毒之一。香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus，CarMV)是属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，麝香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)的典型成员，病毒粒子呈正二十面体，直径28-33nm。Guilley等(1985)和Carrington等(1984)报道表明，CarMV基因组为单组分单链正义RNA，含4003nt，包括4个ORF，其中ORF2和ORF3与ORF1具有共同的起始位点，分别为一次通读区和双重通读区，ORF4编码38KD的外壳蛋白。CarMV依靠汁液摩擦传播，能侵染香石竹、中国石竹、甜石竹、苋色藜、菠菜、千日红等多种植物。CaMV在我国上海、北京、昆明等香石竹产地广泛流行，发病严重，因而迫切需要建立快速、准确、简单方便的检测方法，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产提供技术支撑和物质支持。目前，已报道的CarMV的检测方法有电镜观测和多抗组合成的血清学检测方法两种，但电镜观测法需要昂贵的电子显微镜而不能普及，多抗组合成的血清学检测方法由于多抗存在非特异性高、准确性和均质性差、产量有限等缺陷而使这些血清学方法存在不足，本研究运用我们研制的CarMV特异性单克隆抗体具有特异性强、均质性好、可无限量生产等优点从而使用该单抗建立的ELISA血清学方法具有准确性强、易标准化和大规模生等特点。此方法已有效地用于CarMV在田间作物上的检测，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产服务。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途。
抗香石竹斑驳病毒(CarMV)的单克隆抗体是：3G1、1B9、2A9、2F8、2F25株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-6以上；3G1、1B9、2A9、2F8的单克隆抗体类型及亚类均为IgG1，2F2的单克隆抗体类型及亚类为IgG3；5株单抗分别识别CarMV病毒上5个不同的位点；5株单抗均与CarMV有特异反应，而与其他病毒无交叉反应。
所述单克隆抗体建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法检测抗香石竹斑驳病毒。
本发明的优点是：1)提供的CarMV病毒特异性单克隆抗体，运用ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA能够高度特异、准确、灵敏的检测CarMV；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测CarMV，不需要昂贵的电子显微镜设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物CarMV的检测。
具体实施方式
本发明制备了CarMV的特异性强、效价高、稳定性好、能大量生产的单克隆抗体，并用这些单抗建立了检测CarMV具有高度特异性、灵敏性和正确性的快速诊断方法-ELISA，可为香石竹种苗脱毒鉴定和抗病育种提供有力的技术和产品支持，对该病毒病的综合防治及增产保收提供直接的理论依据和技术保障，同时，可应用于进出口检验，检疫及CarMV疫情调查分析等方面。
单克隆抗体的制备
1.免疫原的制备
将CarMV分离物接种于中国石竹，15d后采集病叶，用10％PEG离心沉淀和蔗糖不连续密度梯度方法提取CarMV。病毒提纯液经2％磷钨酸(pH6.7)染色后置JEOL，JEM-1200EX电镜下观察粒子形态。
2.免疫动物
用提取CarMV病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠：1mg/ml提取CarMV病毒0.5ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma)作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养器皿中培养。
4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获150多个对CarMV有反应的阳性孔，阳性率为31％。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得3G1、1B9、2F2、2A9和2F8 5株能分泌抗CarMV的特异性抗体的杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，5株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体的特异性检测
用提纯的香石竹斑驳病毒(CarMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒1(BBWV-1)、蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)、香石竹环斑病毒(CaRSC)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)1ug/ml包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，用间接ELISA法，分别测定5株单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒分别用包被液稀释成1ug/mL后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入单抗100ul/孔，37℃ 1-2小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，5株单抗对CarMV有特异性反应，而与TMV、ToMV、CMV、SCMV、PVY、PVX、BBWV1、BBWV2、TuMV、CaRSC其他病毒均无特异性反应。
6.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。
7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b、IgG3，IgM抗体，作双向琼脂扩散试验，结果为，3G1、1B9、2A9和2F8亚类均为IgG1，2F2为IgG3。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述5株腹水效价均在10-6以上。
8.AP-抗CarMV单克隆抗体结合物的制备
将30mg AP和1.0mg纯化的单克隆抗体混匀于0.5ml PBS(0.01mol/l、PH7.2)，加入戊二醛至终浓度为0.2％，于室温下温和搅拌2小时。反应物中加入10MMTris-HCL(pH8.0，0.15M NaCl，1MM MgCl2)至1ml，然后用上述Tris-HCL缓冲液于4C流动透析24小时。透析以后的产物即为AP-单克隆抗体结合物，结合物中加入灭菌甘油至50％(V/V)，于-20℃保存备用。
9.单克隆抗体识别位点分析
3ug/ml抗原(提纯CarMV)100ul/孔于96孔ELISA板中，4℃包被过夜；用PBST洗涤三次，2％ BSA 150ul/孔37℃，封闭1小时，加一种单抗腹水50ul及AP标记的另一种单抗50ul，37℃ 1小时；PBST洗涤三次后加硝基苯磷酸盐底物100ul/孔，37℃20分钟，OD405测定吸收值。以单抗腹水对同一AP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照值OD)X100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关，结果表明5株抗CarMV单抗识别5个不相关的抗原结合位点。
10.用单抗建立间接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法检测病毒
ACP-ELISA方法的操作步骤
(1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)30倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，CarMV病叶为阳性对照，相应健叶为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；
(2)PBST洗涤后用5％脱脂奶粉封闭30min；
(3)单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；
(4)PBST洗涤后加入5000倍稀释的AP标记的羊抗鼠IgG结合物(Sigma)，
100ul/孔，37℃，1h；
(5)用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；
(6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用酶联免疫检测仪测
OD405值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
ACP-ELISA方法检测灵敏度检测
单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1∶5至5120作倍比稀释，提纯病毒(5mg/l)从1∶1000至1∶1024000作倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1∶5～800倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶800，ACP-ELISA方法对纯病毒的检测灵敏度可达1ng/ml，每孔的病毒绝对量检测为0.1ng。表现ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
11.CarMV的单抗DAS-ELISA检测方法
1)抗CarMV的一株单抗2F2 5000倍稀释100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；
2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min
3)加入检测样品100ul/孔。以CarMV为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃ 1-2h；
4)BST洗涤后加入10000倍稀释碱性磷酸脂酶(AP)标记另一单抗3G1结合物100ul/孔，37℃ 1-2h
5)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性或用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
DAS-ELISA方法检测灵敏度检测
对病叶从1∶5至5120作倍比稀释，提纯病毒(5mg/l)从1∶1000至1∶1024000作倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述DAS-ELISA方法检测。结果表明DAS-ELISA方法对1∶5～1000倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶1000，DAS-ELISA对纯病毒的检测灵敏度可达0.1ng/ml，每孔的病毒绝对量检测为0.01ng。表现DAS-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
12.CarMV的TAS-ELISA检测方法
12.1.TAS-ELISA方法的操作流程：
1)抗CarMV的兔抗血清(本所自制)100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；
2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min
3)加入检测样品100ul/孔。以CarMV为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃ 1-2h；
4)洗涤后用封闭液稀释的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h
5)PBST洗涤后加入10000倍稀释碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗结合物(Sigma)100ul/孔，37℃ 1-2h
6)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性或用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
12.2.TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：
采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向加兔抗CarMV血清(本所自制)用包被缓冲液从1∶100至1∶102400倍比稀释；CarMV 1ug/ml；纵向加用PBST缓冲液从1∶5至1∶2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1∶10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为CarMV的兔抗血清最适稀释度均为1∶5000；3G1、1B9、2A9、2F2和2F8的最适稀释度分别为1∶5000，1∶8000，1∶8000，1∶10000，1∶5000。
12.3.TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定
在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将1ug/ml的CarMV用含1-3％ BSAPBST倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA检测5株单抗的灵敏度均在0.01ng以上，说明本方法具有很好的灵敏度。
13.上述ELISA方法的田间检测CarMV的应用
利用制备的CarMV单抗建立的上述ELISA方法对田间香石竹进行检测。在杭州市区花卉市场和云南地区香石竹上采收呈病毒症状的病样，作1∶30倍稀释，然后进行上述ELISA检测，用健株汁液作阴性对照，接种CarMV的汁液作阳性对照。检测结果表明，香石竹上CarMV的带毒率很高，81％样品呈阳性，与电镜观察检测结果一致，这表明所制备的单克隆抗体和建立的上述ELISA方法能很好的用于田间CarMV的检测，同时，明确了香石竹斑驳病毒是田间香石竹流行的主要病毒种类。

Claims (2)

1.一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体，其特征是，3G1、1B9、2A9、2F8、2F2 5株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-6以上；3G1、1B9、2A9、2F8的单克隆抗体类型及亚类均为IgG1，2F2的单克隆抗体类型及亚类为IgG3；5株单抗分别识别抗香石竹斑驳病毒上5个不同的位点；5株单抗均与抗香石竹斑驳病毒有特异反应，而与其他病毒无交叉反应。
2.一种如权利要求1所述的抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体的用途，其特征是，所述单克隆抗体建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法检测抗香石竹斑驳病毒。
CN 200510048953 2005-01-12 2005-01-12 抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途 Pending CN1680444A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510048953 CN1680444A (zh) 2005-01-12 2005-01-12 抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510048953 CN1680444A (zh) 2005-01-12 2005-01-12 抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1680444A true CN1680444A (zh) 2005-10-12

Family

ID=35067232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200510048953 Pending CN1680444A (zh) 2005-01-12 2005-01-12 抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1680444A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140541A (zh) * 2011-02-15 2011-08-03 北京林业大学 一种香石竹四种病毒的同步检测方法
CN101429562B (zh) * 2008-11-10 2011-09-07 宁波检验检疫科学技术研究院 菜豆荚斑驳病毒荧光定量rt-pcr检测试剂及制备方法和应用
CN101429243B (zh) * 2008-12-04 2011-09-07 浙江大学 三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101429562B (zh) * 2008-11-10 2011-09-07 宁波检验检疫科学技术研究院 菜豆荚斑驳病毒荧光定量rt-pcr检测试剂及制备方法和应用
CN101429243B (zh) * 2008-12-04 2011-09-07 浙江大学 三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途
CN102140541A (zh) * 2011-02-15 2011-08-03 北京林业大学 一种香石竹四种病毒的同步检测方法
CN102140541B (zh) * 2011-02-15 2012-11-21 北京林业大学 一种香石竹四种病毒的同步检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104327186B (zh) 抗联苯菊酯单克隆抗体及其用途
CN110361542A (zh) 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒
CN1680444A (zh) 抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途
CN105087498B (zh) 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN1424326A (zh) 八种植物病毒的单克隆抗体及其检测方法
CN102559603B (zh) 分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN104560886B (zh) 一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN105671001B (zh) 分泌抗南方菜豆花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN109280646A (zh) 一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN105543176A (zh) 分泌抗马铃薯y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN104404000A (zh) 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN104513810B (zh) 分泌抗黄瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN102229915B (zh) Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用
CN108165533B (zh) 分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN105624121B (zh) 分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN102533664A (zh) 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN105567646B (zh) 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN113683685B (zh) 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用
CN114316037B (zh) 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用
Xia et al. Development of monoclonal antibodies specific for Pyricularia grisea, the rice blast pathogen
CN110904053B (zh) 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN101215331A (zh) 马铃薯a病毒浙江分离物单克隆抗体的制备方法及其用途
CN102559602B (zh) 分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN1683412A (zh) 抗百合无症病毒的单克隆抗体及其用途
CN104513811B (zh) 分泌抗西瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication