CN101429243B - 三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途。载体蛋白与三聚氰胺偶联产物作为人工抗原应用于三聚氰胺检测的免疫学方法；偶联产物免疫动物，制备用于三聚氰胺检测的抗体；偶联产物免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经阳性杂交瘤细胞筛选、细胞克隆获得能稳定传代并分泌抗三聚氰胺特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，并制备腹水单抗。利用制备的单抗建立了对三聚氰胺具有高度特异性、灵敏性和精确性的直接竞争ELISA方法及免疫胶体金试纸条。本发明提供的三聚氰胺与载体蛋白的偶联及三聚氰胺抗体的制备方法，为快速检测食品中三聚氰胺类物质残留提供服务。

Description

三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途

技术领域

本发明属于免疫化学生物技术领域，尤其是涉及一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途。

背景技术

三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3。分子量：126.12，是一种重要的氮杂环有机化工原料。三聚氰胺显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物。三聚氰胺与醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、厨房用具、防火纤维、商业滤膜、胶水和阻燃剂，部分亚洲国家，也被用来制造化肥。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，三聚氰胺作为一种结晶粉末，与奶粉一样同为白色，也没什么味道。三聚氰胺之所以被广泛的掺杂进入奶粉中，是因为目前凯氏(Kjeldahl)定氮法是检测奶粉中蛋白质含量的惟一方法。所谓凯氏定氮法，就是指通过测量氮元素的含量，并利用氮元素与蛋白质换算系数，来计算奶粉中所含蛋白质总量的方法。在分析过程中，所有含氮物质均被统计成蛋白质总量；也就是说，这一方法不能有效地辨别食品中的其他含氮物质。三聚氰胺是一种合成机含氮杂环化合物，含氮量很高(66％)，加之其生产工艺简单、成本很低，一旦被搀杂进奶粉中，在采用凯氏定氮法测定粗蛋白时，可提高表观粗蛋白含量。“三鹿牌婴幼儿奶粉事件”的发生，是不法分子在原料乳中掺水，以增加重量牟取非法利益。奶掺水后会造成原料乳中蛋白质含量下降，为掩盖非法行为，虚增牛奶中蛋白质检出量，不法分子人为在原料乳中加入三聚氰胺。临床调查发现，三聚氰胺对人体的影响是有可能在泌尿系统形成泥沙样结晶或结石。如果摄入的三聚氰胺量大、时间长，可能会在泌尿系统如膀胱和肾脏形成泥沙样结晶或结石，会造成生殖、泌尿系统的损害，并可进一步诱发膀胱癌。

三聚氰胺事件变成社会热点话题是在07年3月份，美国大量召回被三聚氰胺污染的宠物饲料，起因于宠物饲料致死猫狗的事件。据不完全统计，北美地区仅美国因食用有毒饲料而死亡的宠物就有上万只，相关投诉不计其数，美国食品药品管理局调查显示，在回收的宠物食品、死亡动物的尿液结晶和肾脏细胞中都发现有三聚氰胺，研究人员还发现，回收宠物食品所用的小麦谷蛋白添加物中有较高浓度的三聚氰胺存在。某些不法厂商添加三聚氰胺主要是为了增加产品的表观蛋白质含量，三聚氰胺被广泛的添加到淀粉、谷朊粉、蛋白粉中。2008年9月确定，石家庄的三鹿集团股份有限公司生产掺入三聚氰胺的“三鹿”婴幼儿配方奶粉导致婴幼儿泌尿系统结石。截至9月17日已有三例肾结石患儿死亡病例，中国各地共报告临床诊断患儿6244例。国内知名奶粉生产企业-伊利、蒙牛和光明等乳业巨头相继道歉，承诺召回其“问题奶粉”并赔偿损失。

2008年10月7日，国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T22388-2008)国家标准，规定了三聚氰胺的检测方法的检测定量限。目前我国对三聚氰胺检测规定了三种方法，分别是高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱—质谱法(GC-MS)和液相色谱—质谱/质谱法(LC-MS/MS)，其定量限(精确度)分别为2毫克/千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克。只要检验样品中三聚氰胺真实含量在检测方法定量限以上，检测方法就能准确检出。标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。卫生部等五部门联合发布公告，确定了乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值，即婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1毫克/千克，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5毫克/千克。

最近，澳大利亚、新西兰、欧盟、加拿大、香港等国家和地区对食品中三聚氰胺采取了相应的控制措施。如澳大利亚和新西兰规定，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的最高含量不超过1毫克/千克；乳制品和含有乳成分的食品中三聚氰胺的最高含量不超过2.5毫克/千克。欧盟规定从中国进口的乳含量超过15％的所有食品(如巧克力、糖果等)中三聚氰胺的最高含量为2.5毫克/千克。加拿大的规定是婴儿配方乳粉和其他作为唯一营养来源的食品，包括膳食替代食品三聚氰胺最高含量不超过1毫克/千克；其他乳和含有乳成分的食品三聚氰胺最高含量不超过2.5毫克/千克。香港规定了奶类以及供36个月以下婴幼儿和孕妇及哺乳妇女食用的食物中三聚氰胺最高含量为1毫克/千克，其他食物中三聚氰胺的最高含量为2.5毫克/千克。

目前三聚氰胺残留的检测主要有仪器分析和免疫分析两种方法，其中仪器分析法主要用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱(GC)，由于其存在仪器昂贵、操作烦琐、费时费力、费用高、不能大规模现场检测等问题，也要求技术人员具有一定的操作和分析技能，因而不能很好推广应用。酶联免疫吸附分析(ELISA)具有简便、快捷、能大规模检测、灵敏和成本低廉及现场检测的优点，尤其适合在生产和流通过程中对食品及水产品中三聚氰胺等抗生素残留进行检测。胶体金免疫层析试纸条应用广泛，已有多种可检测人、动物、植物病原、癌症抗原、激素、药物与农药残留的试纸条，该方法具有如下优点：操作简单、方便、快速，几乎人人都会使用；不需任何设备；结果准确可靠、特异性强、灵敏度高；低成本高效益；保存方便等。因此免疫层析试纸条目前已成为多种物质免疫学检测的发展方向之一。本专利应用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并制备具有高亲和力、高特异性、高灵敏度的三聚氰胺单抗，以该单抗为核心开发具有自主知识产权、廉价的三聚氰胺残留检测试剂盒及胶体金免疫层析试纸条，为我国动物源食品中三聚氰胺残留的快速检测服务。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途。

三聚氰胺与载体蛋白偶联产物的制备方法包括如下步骤：

a)三聚氰胺3-1000mg溶于1-10mL体积比为1:1:2的二甲基甲酰胺/1，4-二氧六环/0.1M pH7.2 PBS溶液中；

b)2-900mg载体蛋白溶于1-10mL 0.1M pH7.2 PBS中；

c)将上述三聚氰胺溶液缓慢加入载体蛋白溶液中，再逐滴加入10-1000uL25％戊二醛溶液，加毕在4-35℃搅拌反应1-36h，合成三聚氰胺-载体蛋白偶联产物；

d)三聚氰胺-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的三聚氰胺-载体蛋白偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分装后于-20℃冰箱保存备用。

所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。

三聚氰胺-载体蛋白偶联产物可免疫动物制备抗体及作为人工抗原应用于食品中三聚氰胺检测的免疫学方法。

抗三聚氰胺单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

1)三聚氰胺-载体蛋白偶联产物作为免疫原免疫BALB/C小鼠；

2)取免疫鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗三聚氰胺抗体的细胞；

3)采用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗三聚氰胺特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；杂交瘤细胞注射入BALB/C小鼠腹腔制备单抗腹水；

4)采用直接竞争ELISA方法测定抗三聚氰胺单抗与三聚氰酸、三嗪、三嗪二铵的交叉反应率：在优化的条件下，将三聚氰胺标准品、三聚氰酸、三嗪、三嗪二铵作系列稀释，分别与单抗进行直接竞争ELISA，制作标准曲线，并在曲线上找出三聚氰胺50％抑制率的浓度，以及上述其它几种物质50％抑制率的浓度，根据交叉反应率CR％＝三聚氰胺IC₅₀/其它物质IC₅₀×100计算出各种物质的交叉反应率，选择与三聚氰酸、三嗪二铵、三嗪的交叉反应率在3％以上，且检测灵敏度达到1.1ng/mL的单抗。

所述的免疫原是三聚氰胺-载体蛋白偶联产物。免疫原的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。

所述的免疫方法为：用三聚氰胺-载体蛋白偶联产物免疫四周龄体重18-20gBALB/C雌性小鼠：1mg/ml抗原0.5-0.7ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2-0.3m/只，间隔3-4周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml/只，共进行4-6次加强免疫，末免用不加佐剂的加倍剂量抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

所述的单抗腹水制备方法为：取6-10周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000-5000rpm离心3-5min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。

三聚氰胺单克隆抗体用于检测食品中三聚氰胺残留的免疫学方法。所述的用于检测食品中三聚氰胺残留的免疫学方法为竞争ELISA或免疫检测试纸条。

一种制备抗三聚氰胺多抗的制备方法包括如下步骤：

1)初次免疫采用0.1-5mg偶联产物抗原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射免疫；

2)每间隙2-4周，用弗氏不完全佐剂与偶联产物抗原充分乳化后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射，进行2-5加强免疫；

3)末免不加佐剂，加倍剂量肌肉注射免疫，末免后7-10天后采血，离心分离血清；

4)用蛋白A/G亲和柱纯化IgG，纯化的IgG冻干冰箱保存。

本发明的优点是：1)本发明提供一种能制备检测食品中三聚氰胺残留的抗体的三聚氰胺免疫原偶联方法，其操作简单方便；2)提供了一种能获得检测三聚氰胺残留的抗体的制备方法，其方法简单有效；3)利用本发明所制备的抗体，可有效地用于食品中三聚氰胺类物质残留的检测。

附图说明

图1偶联产物的紫外扫描结果。MEL为三聚氰胺水溶液；BSA为牛血清白蛋白溶液；MEL-BSA为三聚氰胺与BSA偶联产物。

具体实施方式

本发明提供了一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物和三聚氰胺抗体的制备方法及用途。用制备的免疫原制备三聚氰胺的特异性强、灵敏度高、稳定性好、能大量生产的单克隆抗体和多抗，并用这些抗体建立了检测食品中三聚氰胺残留具有高度特异性、灵敏性和正确性的快速诊断方法—竞争ELISA及免疫层析试纸条，可有效地用于食品中三聚氰胺残留的检测，为我国的食品安全服务。

1.一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物的制备方法包括如下步骤：

a)三聚氰胺3mg溶于1mL体积比为1:1:2的二甲基甲酰胺/1，4-二氧六环/0.1MpH7.2PBS溶液中；

b)2mg载体蛋白即牛血清白蛋白(BSA)溶于1mL0.1M pH7.2PBS中；

c)将上述三聚氰胺溶液缓慢加入BSA溶液中，再逐滴加入10uL25％戊二醛溶液，加毕在4-35℃搅拌反应1-36h，合成三聚氰胺-BSA偶联产物；

d)三聚氰胺-BSA偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的三聚氰胺-BSA偶联产物、三聚氰胺、BSA溶液进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分析发现偶联产物的紫外扫描图形与BSA及三聚氰胺的扫描图形明显不同(如图1)，说明三聚氰胺已与BSA偶联成功，偶联产物分装后于-20℃冰箱保存，用于免疫动物制备抗体及作为三聚氰胺人工抗原应用于食品中三聚氰胺检测的免疫学方法。

2.一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物的制备方法包括如下步骤：

a)三聚氰胺1000mg溶于10mL体积比为1:1:2的二甲基甲酰胺/1，4-二氧六环/0.1M pH7.2 PBS溶液中；

b)900mg载体蛋白即牛血清白蛋白(BSA)溶于10mL 0.1M pH7.2 PBS中；

c)将上述三聚氰胺溶液缓慢加入BSA溶液中，再逐滴加入1000uL 25％戊二醛溶液，加毕在4-35℃搅拌反应1-36h，合成三聚氰胺-BSA偶联产物；

d)三聚氰胺-BSA偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的三聚氰胺-BSA偶联产物、三聚氰胺、BSA溶液进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分析发现偶联产物的紫外扫描图形与BSA及三聚氰胺的扫描图形明显不同(如图1)，说明三聚氰胺已与BSA偶联成功，偶联产物分装后于-20℃冰箱保存，用于免疫动物制备抗体及作为三聚氰胺人工抗原应用于食品中三聚氰胺检测的免疫学方法。

3.三聚氰胺单克隆抗体的制备方法

1)免疫动物

用三聚氰胺与BSA偶联物免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠：1mg/ml提取三聚氰胺与BSA偶联物0.5-0.7ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2-0.3ml/只，间隔3-4周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml/只，共进行5次加强免疫，末免用不加佐剂的加倍剂量抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

2)细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(聚乙二醇，Sigma)作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT筛选培养基(Sigma)悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养器皿中培养。

3)杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞在培养器皿中培养5天后，用HAT筛选培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，用三聚氰胺偶联卵清蛋白(Mel-OVA)作为包被抗原进行间接ELISA方法筛选阳性孔，共获200多个对三聚氰胺有反应的阳性孔，阳性率为5％。选择180个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得2H1株能分泌抗三聚氰胺的特异性抗体的杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

4)单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000-5000rpm离心3-5min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M pH 4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000-5000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

5)单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体，作双向琼脂扩散试验，结果为，2H1的抗体类型及亚类为IgG₁，单克隆抗体的轻链为κ链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述腹水效价均在10^-6以上。

4.检测三聚氰胺残留的直接竞争ELISA方法的建立

1)辣根过氧化物酶(HRP)-三聚氰胺结合物的制备：

a)三聚氰胺10mg溶于1mL体积比为1:1:2的二甲基甲酰胺/1，4-二氧六环/0.1MpH7.2 PBS溶液中；

b)20mg HRP溶于1mL0.1M pH7.2 PBS中；

c)将上述三聚氰胺溶液缓慢加入HRP溶液中，再逐滴加入10uL 25％戊二醛溶液，加毕在4-35℃搅拌反应1-36h，合成三聚氰胺-HRP偶联产物；

d)三聚氰胺-HRP偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的偶联产物、三聚氰胺、HRP溶液进行紫外扫描，鉴定偶联产物，分析发现偶联产物的紫外扫描图形与HRP及三聚氰胺的扫描图形明显不同，说明三聚氰胺已与HRP(酶标三聚氰胺半抗原)偶联成功，偶联产物分装后于-20℃冰箱保存，用于检测三聚氰胺的直接竞争ELISA方法。

2)直接竞争ELISA方法条件优化：

用方阵试验法对抗体和酶标三聚氰胺半抗原的进行一系列浓度的稀释，确定直接竞争ELISA法抗体和酶标半抗原的最适工作浓度。OD₄₅₀值约为1.0，抗体抗原用量较少的浓度组合，即为抗体-抗原的最佳工作浓度。首先，将单抗用PBS(0.01M，pH 7.4)稀释成一系列浓度，分别依次加入96孔酶标板(100μL/well)，37℃下温育2h，PBST洗涤3次；用含2.0％脱脂奶的PBS封闭，每孔300μL，37℃温育0.5h，后用PBST洗涤3次；加入预先以PBS稀释成不同浓度的酶标半抗原，在微量震荡器上混匀，37℃下温育1h，PBST洗涤3次；加入底物溶液(100μL/well)，37℃温育15min，加入终止液(50μL/well)，用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

3)抗体亲和性及检测灵敏度

在优化的条件下，在预先包被好单抗的酶标板上，加入系列浓度的三聚氰胺标样，每浓度3孔重复，设不加三聚氰胺对照和溶剂空白对照，50μL/well，再加入0.89μg/ml酶标半抗原50μL，震荡1min后37℃下温育1h，PBST洗涤4次；加入TMB底物溶液(100μL/well)，37℃温育15min，加入2M硫酸终止液(50μL/well)，用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。以抑制率与三聚氰胺浓度的半对数绘制标准曲线。抑制率I计算公式如下：

$I\%=\frac{(\mathrm{OD}\max -\mathrm{OD}\min )-(\mathrm{ODx}-\mathrm{OD}\min )}{(\mathrm{OD}\max -\mathrm{OD}\min )}\×100$

式中：OD_max-不加三聚氰胺时的吸光值；OD_x-三聚氰胺浓度为x时的吸光值；OD_min-空白对照孔的吸光值。

以抑制率达到50％的三聚氰胺浓度(IC₅₀)来表示抗体对三聚氰胺的亲和性，以IC₁₀作为ELISA方法的检测灵敏度。在优化的ELISA分析条件下，对三聚氰胺建立标准曲线，以考察其在最优化的反应体系中的检测灵敏度。根据竞争ELISA反应标准曲线计算得2H1单抗的IC₅₀为20.5ng/ml，IC₁₀为1.1ng/ml。

4)三聚氰胺单抗的特异性

采用直接竞争ELISA方法测定抗三聚氰胺单抗与三聚氰酸、三嗪、三嗪二铵的交叉反应率。在优化的条件下，将三聚氰胺标准品、三聚氰酸、三嗪、三嗪二铵作系列稀释，分别与2H1单抗进行直接竞争ELISA，制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的浓度，以及上述几种物质50％抑制率的浓度，然后计算出各类抗生素的交叉反应率。交叉反应率CR计算方法为CR％＝三聚氰胺IC₅₀/其它物质IC₅₀×100。结果表明，2H1单抗与三聚氰酸、三嗪二铵、三嗪的交叉反应率分别为71％、310％和5％。说明该单抗可以用于食品中三聚氰胺类物质的检测

5.三聚氰胺多抗的制备

用三聚氰胺与载体蛋白偶联产物免疫鼠、兔子、羊、驴、牛、禽等动物制备多抗。初次免疫采用偶联产物人工抗原(0.1-5mg)与等体积弗氏完全佐剂(complete freund’s adjvant，CFA)充分乳化，然后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射；间隙2-4周后，再用弗氏不完全佐剂(incomplete freund’s adjvant，IFA)与抗原充分乳化，然后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射进行加强免疫；间隙2-4周，进行2-5加强免疫；末免不加佐剂，直接肌肉注射，末免后7-10天后采血。每次免疫后4-8采少量血，进行ELISA效价的测定，效价满意后大量采血，离心分离血清。用蛋白A/G亲和柱纯化IgG，纯化的IgG用于食品中三聚氰胺检测的免疫学方法。

6.免疫层析试纸条的制备

胶体金的制备及单抗的金标记：

胶体金颗粒制备在100ml去离子水中加入1％柠檬酸三钠1ml，煮沸后迅速加入1％氯金酸1ml，继续煮沸15min，冷却后，4℃下保存备用。通常情况下，制备好的胶体金颗粒的大小平均为30nm。

单抗的金标记：

取已制备好的胶体金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入单抗2mg，搅拌15min，再逐滴加入2.5ml 25mg/ml聚乙二醇20000(PEG20000)，搅拌20min。20000r/min离心20min，弃上清液，加入10ml pH7.4PBS缓冲液(含0.4mg/ml PEG)清洗2次。将沉淀用5ml含2％BSA的PBS缓冲液(pH7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

免疫层析试纸条的组装：

用点膜机把适当浓度的三聚氰胺-BSA抗原及羊抗鼠IgG喷在NC膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记三聚氰胺单抗包被在胶体金结合垫上。将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫依次粘贴在底板上，从而组成一个连续的微滤体系。将贴好的板切割成4mm宽的条，装入模板中制成检测试剂板，避光、密闭、常温保存备用。

用滴管吸取待检样品溶液，滴加3滴(约100ul)于上述试剂板的加样孔中，加样后开始计时；结果应在3-5分钟内读取，其他时间判读无效；根据观察区的T、C线的颜色比对来确定结果，T线显色比C线深或者相等时，结果判定为阴性。当T线颜色显色比C线浅时，检测结果为阳性。

将三聚氰胺标准品配置成不同浓度的分析试样溶液：0、1、3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/ml，用检测试纸条进行测定，每个试样做3个重复，5min后观察结果，检测结果表明，当样品中三聚氰胺残留药物的含量达到或超过1ng/ml，由于大多数单克隆抗体被样品中的三聚氰胺残留竞争结合，T线的包被抗原结合到的三聚氰胺单克隆抗体就很少或者没有，T线的显色明显比C线浅或不显色，结果为阳性；当样品中三聚氰胺残留的含量低于3ng/ml时，T线呈色与C线一致或比C线浅，结果为阴性；无论是阳性还是阴性结果，胶体金-三聚氰胺单抗结合物总能与C线处的羊抗鼠IgG结合，形成一条紫红色的条带。如果，C线不显色，无论是T线有无，这时的结果均无效。

检测试剂板的稳定性试验：

用同一批次不同检测试剂板检测同一样品，及用不同批次检测试剂板测定同一样品，其质控线、检测线的显色时间及颜色深浅和最终结果判读基本相同。将相同批次的试剂板置于37℃、室温、4℃密闭保存3个月，每2周各检测阳性和阴性奶样各20份，结果显示随着时间和温度的变化，检测结果未发生大的变化。根据37℃下一天相当于1周估算，本试剂板可以在室温下保存12个月。

Claims (2)

1.一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a)三聚氰胺3-1000mg溶于1-10mL体积比为1∶1∶2的二甲基甲酰胺/1，4-二氧六环/0.1M pH7.2PBS溶液中；

b)2-900mg载体蛋白溶于1-10mL 0.1M pH7.2PBS中；

c)将上述三聚氰胺溶液缓慢加入载体蛋白溶液中，再逐滴加入10-1000uL25％戊二醛溶液，加毕在4-35℃搅拌反应1-36h，合成三聚氰胺-载体蛋白偶联产物；

d)三聚氰胺-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；

e)透析后的三聚氰胺-载体蛋白偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分装后于-20℃冰箱保存备用。

2.根据权利要求1所述一种三聚氰胺与载体蛋白偶联产物的制备方法，其特征在于所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。