CN109868261B

CN109868261B - 抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体制备及其应用

Info

Publication number: CN109868261B
Application number: CN201711256952.XA
Authority: CN
Inventors: 杨美华; 刘聪敏; 豆小文
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: CN109868261A

Abstract

本发明公开了一种抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过在1，3，5‑三嗪环上引入合适的活性手臂，制备免疫半抗原和包被半抗原，活性酯法分别偶联鸡卵白蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)制备免疫原和包被原，用免疫原免疫Balb/c鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，基于该抗体，以包被原作为检测抗原，建立了异源的间接竞争酶联免疫分析方法(ELISA)，可用于检测包括扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净在内的八种三嗪类农药，该方法的检测成本低，灵敏度高，操作简便，适用于该八种三嗪类农药的现场快速大量筛查。

Description

抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体制备及其应用

技术领域

本发明涉及抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体的制备方法及其在酶联免疫分析方法中的应用，适用于包括扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净在内的八种三嗪类农药的现场快速筛查，属于农药残留快速检测领域。

背景技术

我国农业生产持续、稳定增长，与此同时，化肥、化学农药、除草剂等农用化学品的长期、大量、不合理使用，对我国农业生态环境和农畜产品的安全生产及人体健康与生命构成了严重威胁，由农药残留引起人畜中毒死亡事件频繁发生。我国蔬菜、茶叶出口中每年因农药残留超标而被进口国拒收、扣留、索赔、终止合同、拒绝入关等事件时有发生，给国家带来巨大的经济损失并丢失了国际市场，有损国家形象。

三嗪类农药是一类传统的高选择性除草剂，早在上世纪50年代便开始在世界范围内登记使用，年销售额过亿。其主要通过抑制光合作用而控制杂草的生长，被广泛用于农业生产过程的化学除草。然而，该类除草剂有类似苯环的结构，化学性质稳定，半衰期长，不易降解，能长期存在并富集于被施用对象中，造成环境、土壤和农产品污染，对人类健康造成严重威胁，如损伤人体免疫、如损害人体免疫、干扰内分泌系统、引发癌症及先天性缺陷等。

传统的检测三嗪类农药的方法有液相色谱法、液质联用法等，虽然以上方法准确、灵敏度高，但需要的仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，且限于专业实验室内使用。近年来，酶联免疫分析方法(ELISA)因其特异性强、灵敏度高、操作简便、低成本且适用于现场大批量样品快速检测的特点，逐渐成为农药残留快速检测的热点。

虽然三嗪类农药抗体及相关免疫分析方法已有报道，但多数围绕莠去津及其他氯代的三嗪类农药进行研究，对硫代和氧代的三嗪农药研究较少，针对扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净的群选性单克隆抗体及酶联免疫分析方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于八种三嗪类农药(扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净)检测的群选性单克隆抗体，以及建立一种简单且具高灵敏度的检测三嗪类农药的异源间接竞争ELISA方法，该方法可用于环境及农产品中三嗪类农药残留的灵敏快速检测。其优点在于不需要昂贵的大型分析仪器，使用简便，通过阅读说明书，非专业人员即可进行操作，并且检测快速，大大增加了三嗪类农药检测的筛查效率和普及程度，具有广阔的开发前景。

本发明获得了能够产生特异性识别八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株TZ5E4，此细胞株已于2017年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.14732；此外，本发明通过合成包被抗原，建立了异源的间接竞争ELISA方法，是一种针对该八种三嗪类农药的高灵敏度及高通量的检测系统。

技术方案：

1.抗八种三嗪类农药的杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.14732。

2.抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体，有保藏号为CGMCC No.14732的杂交瘤细胞株所分泌，所述单克隆抗体命名为TZ5E4。

3.本发明所述的抗八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成人工半抗原

①在三嗪类农药扑草净结构上引入合适的连接臂，合成免疫半抗原(H1)，合成路线如下：

②在三嗪类农药的母核结构上进行结构修饰，合成包被半抗原(H2)，合成路线如下：

(2)人工抗原制备：

采用活化酯法将所述的人工免疫半抗原和包被半抗原分别偶联到载体蛋白卵清蛋白OVA和牛血清蛋白BSA上，分别得到免疫原H1-OVA和包被原H2-OVA；

(3)小鼠免疫：

将制备好的H1-OVA作为免疫原免疫Balb/c雌鼠，每次每只小鼠腹腔及背部皮下给予100μg免疫原，每两周免疫一次，共免疫四次，小鼠眼眶取血，用间接ELISA法检测血清效价及特异性；

(4)细胞融合：

通过效价及特异性测定，筛选出血清效价最高、特异性最好的免疫小鼠，细胞融合前三天腹腔注射100μg免疫原进行冲击免疫，取小鼠脾细胞，与对数生长期的Sp2/0-Ag14细胞通过PEG法进行融合制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养一周，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；

(5)杂交瘤细胞筛选：

用8000倍稀释的包被原H2-BSA包被酶标板，取杂交瘤细胞上清，采用非竞争ELISA法初步进行筛选，其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照，选取呈阳性的细胞孔，采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，对农药扑草净出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗三嗪类农药扑草净抗体的阳性杂交瘤细胞，阳性孔的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔的杂交瘤细胞送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.14732。将杂交瘤细胞株CGMCC No.14732.给小鼠腹腔注射制备腹水，纯化后即为所制备的单克隆抗体。

有益效果：

本发明通过合成的H1-OVA人工抗原免疫Balb/c鼠，制备了扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净和莠灭净八种三嗪类农药的群选性单克隆抗体，并基于该抗体，以H2-BSA人工抗原作为检测抗原，建立了异源间接竞争ELISA检测方法，能以较高的灵敏度同时检测以上八种三嗪类农药，该方法的检测成本低，灵敏度高，操作简单，可用于环境及农产品中三嗪类农药残留的高灵敏现场快速检测。

保藏说明：

参据的生物材料(株)：TZ5E4

科学描述：小鼠杂交瘤细胞株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2017年11月3日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14732

附图说明：

图1为免疫半抗原H1的¹H NMR谱图

图2为包被半抗原H2的¹H NMR谱图

图3为载体蛋白与人工抗原的紫外扫描图

图4为ELISA检测八种三嗪类农药的标准曲线图

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。

溶液配制：

1、包被缓冲液：NaHCO₃2.90g，Na₂CO₃1.60g，超纯水定容至1L；

2、洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.96g，吐温-20 1mL，超纯水定容至1L；

3、样品稀释液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.96g，明胶1g，吐温-201mL，超纯水定容至1L；

4、TMB显色液：TMB底物试剂盒(购买于BD Biosciences)，按说明书将A液和B液等体积混合；

5、终止液：浓度为1mol/L的盐酸水溶液。

实施例1：半抗原的制备

(1)免疫半抗原4-(4-异丙胺基-6甲硫基-1，3，5-三嗪-2-)氨基丁酸的合成

①50mL三口烧瓶，2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(2g)和异丙胺(644mg)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)中，氮气保护下，冷却至-30℃，将用二氯甲烷稀释的二异丙基乙胺(DIPEA)(2.1g)10mL缓慢滴加进烧瓶中，-20℃～-10℃反应2h，将反应液浓缩旋干，分散于50mL水中，过滤，收集滤饼，用乙醇重结晶得到2.1g中间体a(4，6-二氯-N-异丙基-1，3，5-三嗪-2-胺)，白色固体。

②225mL三口烧瓶，上述中间体a(1g)和4-氨基丁酸(400mg)以及DIPEA(939mg)溶于10mL无水乙醇中，氮气保护下，60℃反应12小时，将反应液浓缩旋干，反相制备纯化(C18柱，流动相：乙腈/水)，流动相为70％乙腈时出产品，浓缩至少量，冻干得到4-(4-氯-6-异丙胺-1，3，5-三嗪-2)氨基丁酸(中间体b)615mg，白色固体。

③25mL三口烧瓶，加入10mL干燥的无水乙醇，氮气保护下，加入甲硫醇钠(385mg)，室温下搅拌10分钟，形成淡黄色透明的甲硫醇钠乙醇溶液，搅拌下加入中间体b(500mg)，回流4小时，LC-MS监控，反应完全，产品为主峰，占60％，将反应液浓缩旋干，反相制备纯化(C18柱，流动相：乙腈/水)，流动相为75％乙腈时出产品，浓缩至少量冻干得到产物279mg，白色固体。

免疫半抗原(H1)的¹H NMR谱图如图1所示：¹H NMR(300 MHz，DMSO-d₆)δ12.02(s，1H)，7.15(ddq，J＝37.0，23.9，8.4，7.0 Hz，2H)，4.03(dq，J＝13.9，7.1 Hz，1H)，3.23(m，2H)，2.36(d，J＝4.8 Hz，3H)，2.23(t，J＝7.4 Hz，2H)，1.71(m，2H)，1.10(t，J＝5.8 Hz，6H)。

免疫半抗原H1的¹H NMR谱图见图1

(2)包被半抗原3-(4-氨基-6-环丙氨基-1，3，5-三嗪-2-)硫基丙酸的合成

①100mL三口烧瓶，2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(3g)和环丙胺(934mg)溶于干燥的无水乙醚(40mL)中，氮气保护下，冷却至-30℃，将用无水乙醚稀释的DIPEA(3.2g)20mL缓慢滴加进烧瓶中，-30℃～-20℃反应2h，将反应液浓缩旋干，分散于50mL水中，过滤，收集滤饼，用乙醇重结晶2次得到中间体c(4，6-二氯-N-环丙基-1，3，5-三嗪-2-胺)，白色固体，2.4g。

②50mL三口烧瓶，中间体c(1g)溶于20mL四氢呋喃中，加入3mL36％的氨水，60℃反应16小时，将反应液浓缩旋干，加入10mL水加热至完全溶解，冷却结晶得到700mg中间体d(6-氯N²-环丙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)，白色固体。

③25mL封管，中间体d(700mg)和3-巯基丙酸(401mg)溶于10mL乙腈中，加入5mL溶有氢氧化钾(636mg)的水溶液，120℃反应12小时，LC-MS监控反应已完全，产物占65％，将反应液浓缩旋干，加入5mL水溶解，用1M的稀盐酸调节pH值为5～6，反相制备纯化(C18柱，流动相：乙腈/水)，流动相为52％乙腈时出产品，浓缩至少量，冻干得到产物265mg，白色固体。

包被半抗原(H2)的¹H NMR谱图如图2所示：¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)δ12.27(s，1H)，7.39-7.29(m，1H)，6.75(d，J＝85.0 Hz，2H)，3.18-3.07(m，2H)，2.75-2.57(m，3H)，0.72-0.54(m，2H)，0.47(s，2H)。

包被半抗原H2的¹H NMR谱图见图2

实施例2：人工抗原的制备

(1)免疫抗原的制备

称取免疫半抗原H10.015mmol，NHS 0.03mmol，DCC 0.03mmol，溶解于200μL二甲基甲酰胺(DMF)，磁力搅拌下室温密封反应过夜，10000rpm离心5分钟，取上清液缓慢加入到1mL 10mg/mL的OVA-PBS溶液中，4℃搅拌反应12h。反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液中4℃下透析72h，每6小时换一次透析液。透析结束后将透析袋中的白色乳浊液(H1-OVA)取出分装保存于-20℃冰箱中。

(2)包被抗原的制备

将包被半抗原H2偶联BSA制备包被抗原，方法同免疫抗原的偶联。

(3)人工抗原鉴定

对载体蛋白BSA、OVA，免疫抗原和包被抗原进行紫外扫描测定(200～400nm)，结果见图3，免疫抗原和包被抗原与载体蛋白相比，吸收曲线有明显改变，说明人工抗原合成成功。

载体蛋白与人工抗原的紫外扫描图见图3

实施例3：动物免疫

H1-OVA作为免疫原免疫6-8周龄Balb/c雌鼠，每次每只小鼠腹腔及背部皮下给予100μg免疫原，每两周免疫一次，共免疫四次。第一次免疫时，等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，以后免疫均采用等体积的免疫原和弗氏不完全佐剂乳化。第三次免疫后一周，小鼠眼眶取血，用间接ELISA法检测血清效价及特异性。

实施例4：杂交瘤细胞的构建

通过效价及特异性测定，筛选出血清效价最高、特异性最好的免疫小鼠，细胞融合前三天腹腔注射100μg免疫原进行冲击免疫。取小鼠脾细胞，与对数生长期的Sp2/0-Ag14细胞通过PEG法进行融合制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养一周，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞。

实施例5：单克隆抗体的制备

(1)单克隆抗体的筛选

采用间接非竞争ELISA法对融合孔上清进行筛选，用8000倍稀释的包被原H2-BSA包被酶标板，取杂交瘤细胞的培养上清作为一抗，免疫小鼠的血清为阳性对照，骨髓瘤细胞上清为阴性对照，选取呈阳性的细胞孔，采用间接竞争ELISA进行确认，基本操作流程如下：

1)包被：用包被缓冲液将包被抗原H2-BSA稀释成125ng/mL，在96孔酶标板中每孔加入100μL，37℃包被3小时，用洗涤液洗涤4次；

2)加样品：抑制孔加入50μL浓度为10ng/mL的扑草净标准品(样品稀释液稀释)，空白孔加入50μL样品稀释液；

3)加抗体：将50μL杂交瘤细胞培养液加至酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次；

4)加酶标二抗：用样品稀释液将羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP稀释成400ng/mL，每孔加100μL，37℃孵育30min，洗板4次；

5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的TMB显色液，避光显色10min；

6)终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪450nm处测定各孔的OD值，抑制率(％)＝[(空白孔OD值-抑制孔OD值)/空白孔OD值]×100％

对农药扑草净出现明显的竞争性抑制的孔即为产生抗三嗪类农药扑草净抗体的阳性孔，阳性孔的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆。阳性孔的杂交瘤细胞株TZ5E4于2017年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCCNo.14732。

(2)单克隆抗体的大量制备及纯化

Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.3mL/只)，7天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞株CGMCC No.14732(约10⁶个/只)，7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，透析后冻干，于-20℃保存。

(3)单克隆抗体亚型鉴定

小鼠杂交瘤细胞株CGMCC No.14732分泌的单克隆抗体采用单克隆抗体类型检测试剂盒(购自Sigma，产品编号为IS02-1KT)检测单克隆抗体的亚型，具体操作参见试剂盒说明书。结果显示，小鼠杂交瘤细胞株CGMCC No.14732分泌的单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1型。

实施例6：ELISA检测扑草净等三嗪类农药方法的建立

2)加样品：实验孔每孔加入50μL待测化合物溶液，对照孔加入50μL样品稀释液；

其中，待测化合物溶液为扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净溶液，分别用样品稀释液稀释成浓度为1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL，每个浓度设置三个复孔；

3)加抗体：用样品稀释液将制备得到的单克隆抗体稀释成125ng/mL，每孔加入50μL，37℃孵育30min，洗板4次；

5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的TMB显色液，避光显色10min；

6)终止：每孔加入50μL终止液，用酶标仪450nm处测定各孔的OD值。

以待测化合物溶液浓度为横坐标，OD/OD₀(OD值表示实验孔的吸光值，OD₀表示对照孔的吸光值)为纵坐标，运用OriginPro9软件分别计算扑草净、扑灭通、叠氮津、仲丁通、莠去通、敌草净、西草净、莠灭净的IC50值，结果如表1所示。结果表明，制备的单克隆抗体能较好地识别上述八种三嗪类农药，并且有较高的灵敏度。

ELISA检测八种三嗪类农药的标准曲线图见图4

表1 单克隆抗体对八种三嗪类农药的检测灵敏度

Claims

1.一种适用于三嗪类农药多残留检测的包被半抗原，其特征在于结构如下所示：

2.权利要求1所述的半抗原在三嗪类农药多残留检测免疫分析方法中的应用。

3.根据权利要求1所述的包被半抗原，其特征在于所述的包被半抗原通过以下方法制备：

100mL三口烧瓶，2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(3g)和环丙胺(934mg)溶于干燥的无水乙醚(40mL)中，氮气保护下，冷却至-30℃，将用无水乙醚稀释的DIPEA(3.2g)20mL缓慢滴加进烧瓶中，-30℃～-20℃反应2h，将反应液浓缩旋干，分散于50mL水中，过滤，收集滤饼，用乙醇重结晶2次得到中间体c(4，6-二氯-N-环丙基-1，3，5-三嗪-2-胺)，白色固体，2.4g；50mL三口烧瓶，中间体c(1g)溶于20mL四氢呋喃中，加入3mL36％的氨水，60℃反应16小时，将反应液浓缩旋干，加入10mL水加热至完全溶解，冷却结晶得到700mg中间体d(6-氯-N₂-环丙基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)，白色固体；25mL封管，中间体d(700mg)和3-巯基丙酸(401mg)溶于10mL乙腈中，加入5mL溶有氢氧化钾(636mg)的水溶液，120℃反应12小时，LC-MS监控反应已完全，产物占65％，将反应液浓缩旋干，加入5mL水溶解，用1M的稀盐酸调节pH值为5～6，反相制备纯化(C18柱，流动相：乙腈/水)，流动相为52％乙腈时出产品，浓缩至少量，冻干得到产物265mg，白色固体。