CN111718412B - 一种广谱型微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种广谱型微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法，本发明中为了获得针对微囊藻毒素整个环肽结构具有高度特异性的抗体，分别在12种微囊藻毒素的第七位氨基酸(Mdha)上通过2‑巯基乙胺化学修饰引入一个氨基活性基团，然后与KLH偶联，分别得到12种微囊藻毒素与KLH的偶联物，采用“混合免疫原法”进行免疫，得到广谱型的微囊藻毒素单克隆抗体MCAB1、MCAB2、MCAB3、MCAB4和MCAB5。本发明的5株单克隆抗体对12种微囊藻毒素均具有较高的亲和力，可用于实际样品中的微囊藻毒素检测。

Description

一种广谱型微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种针对微囊藻毒素多种结构变异体的广谱型单克隆抗体及其制备方法。
背景技术
有毒蓝藻水华频繁地爆发，对生态环境和经济带来严重的影响，现已经成为一个全球性的重大环境问题。微囊藻是有毒蓝藻水华中最常见的蓝藻属，其产生的微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类具有共性环状七肽结构的小分子，由5个非蛋白原氨基酸(如脱氢丙氨酸衍生物和特殊的β-氨基酸Adda等)和2个蛋白原氨基酸(第2 位和第4位的可变氨基酸)组成，其化学结构式如式1所示。已报道有150种以上具有不同程度毒性的微囊藻毒素结构变异体，其中微囊藻毒素-LR(MC-LR)、MC-RR 和MC-YR是蓝藻水华水体中最常见也是毒性最强的微囊藻毒素类型，其引起的急性毒性会使细胞功能和结构丧失，导致肝出血甚至死亡。因此，开发可靠的水体中微囊藻毒素快速筛查技术，具有重要的现实意义。
Figure RE-GDA0002594259380000011
(式1)
基于“抗原-抗体”特异性识别和结合反应的免疫分析方法，具有灵敏度高、成本低、高通量等优势。针对微囊藻毒素的共性结构，通过制备具有广谱特异性的抗体，理论上可以识别所有的微囊藻毒素结构变异体，且只要每种结构变异体的交叉反应性无明显差异，则无需提供其所有的结构变异体标准品，便可直接定量检测水体中总微囊藻毒素，非常适合于微囊藻毒素的大规模样品快速筛查和预警监测。
建立微囊藻毒素总量免疫分析方法，获得高质量的广谱型抗体是建立微囊藻毒素免疫筛查技术的关键。微囊藻毒素属于半抗原小分子，需要先将其与载体蛋白偶联，改造成完全抗原(免疫原)，再免疫动物获得抗体。为了制备出高效价的广谱特异性抗体，半抗原分子设计是成功建立免疫分析方法的第一个关键点，而免疫方案是第二个关键点。
目前有关微囊藻毒素广谱型抗体制备的研究报道并不多，所获抗体的广谱性未能达到理想要求，测定的交叉反应性数据相对有限，而且结构变异体之间的交叉反应性差异显著。2014年Ingunn A.Samdal课题组采用在可变氨基酸位点存在差异的5种微囊藻毒素分子的混合物与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原，得到的羊多克隆抗体的广谱性和交叉反应性均提升了很多。然而，多克隆抗体在免疫分析批次间误差较大。针对上述问题，本发明提出了一种广谱型微囊藻毒素单克隆抗体的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于发明一种适用于水体中微囊藻毒素总量免疫分析的广谱型单克隆抗体并建立其制备方法。
本发明要求保护一种单克隆抗体，所述单克隆抗体为如下a、b、c、d或e：
a)由保藏号为CGMCC No.19194的杂交瘤细胞株MCAB1产生的单克隆抗体；
b)由保藏号为CGMCC No.19195的杂交瘤细胞株MCAB2产生的单克隆抗体；
c)由保藏号为CGMCC No.19196的杂交瘤细胞株MCAB3产生的单克隆抗体；
d)由保藏号为CGMCC No.19197的杂交瘤细胞株MCAB4产生的单克隆抗体；
e)由保藏号为CGMCC No.19198的杂交瘤细胞株MCAB5产生的单克隆抗体。
本发明还要求保护一种用于制备微囊藻毒素广谱型单克隆抗体的组合物，所述组合物包括MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA、MC-LF、MC-LW、MC-LY、MC-WR、 MC-HtyR、MC-HilR、[D-Asp3]MC-LR和[D-Asp3]MC-RR，上述化合物分别独立包装，分开使用。
本发明还要求保护一种用于制备微囊藻毒素广谱型单克隆抗体的组合物，所述组合物由以下12种完全抗原组成：NH2-MC-LR-KLH、NH2-MC-RR-KLH、 NH2-MC-YR-KLH、NH2-MC-LA-KLH,NH2-MC-LF-KLH、NH2-MC-LW-KLH,、 NH2-MC-LY-KLH、NH2-MC-WR-KLH、NH2-MC-HtyR-KLH、NH2-MC-HilR-KLH、 NH2-[D-Asp3]MC-LR-KLH和NH2-[D-Asp3]MC-RR-KLH；其中所述NH2-MC-LR-KLH 为氨基修饰的MC-LR与KLH偶联物；所述NH2-MC-RR-KLH为氨基修饰的MC-RR 与KLH偶联物；所述NH2-MC--YR-KLH为氨基修饰的MC--YR与KLH偶联物；所述NH2-MC-LA-KLH为氨基修饰的MC-LA与KLH偶联物；所述NH2-MC-LF-KLH 为氨基修饰的MC-LF与KLH偶联物；所述NH2-MC-LW-KLH为氨基修饰的MC-LW 与KLH偶联物；所述NH2-MC-LY-KLH为氨基修饰的MC-LY与KLH偶联物；所述NH2-MC-WR-KLH为氨基修饰的MC-WR与KLH偶联物；所述NH2-MC-HtyR-KLH 为氨基修饰的MC-HtyR与KLH偶联物；所述NH2-MC-HilR-KLH为氨基修饰的 MC-HilR与KLH偶联物；所述NH2-[D-Asp3]MC-LR-KLH为氨基修饰的 [D-Asp3]MC-LR与KLH偶联物；所述NH2-[D-Asp3]MC-RR-KLH为氨基修饰的 [D-Asp3]MC-RR与KLH偶联物；其中，KLH为血蓝蛋白。
所述氨基修饰的MC-LR为在MC-LR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为亮氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-RR为在MC-RR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为精氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-YR为在MC-YR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为酪氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-LA为在MC-LA的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为亮氨酸、R2为丙氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-LF为在MC-LF的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为亮氨酸、R2为苯丙氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-LW为在MC-LW的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为亮氨酸、R2为色氨酸和R3 为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-LY为在MC-LY的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为亮氨酸、R2为酪氨酸和R3 为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-WR为在MC-WR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为色氨酸、R2为精氨酸和R3 为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-HtyR为在MC-HtyR的第七位氨基酸残基N- 甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为高酪氨酸、R2为精氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的MC-HilR为在MC-HilR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为同异亮氨酸、R2 为精氨酸和R3为甲基的化合物；所述氨基修饰的[D-Asp3]MC-LR为在[D-Asp3]MC-LR 的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1 为亮氨酸、R2为精氨酸和R3为氢的化合物；所述氨基修饰的[D-Asp3]MC-RR为在 [D-Asp3]MC-RR的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基得到的化合物，即式2中R1为精氨酸、R2为精氨酸和R3为氢的化合物。
所述微囊藻毒素的结构通式如式(1)所示，所述氨基修饰的微囊藻毒素的结构通式如式(2)所示。
Figure RE-GDA0002594259380000041
所述组合物中，所述12种完全抗原中的每种抗原质量相同。
本发明还要求保护用于检测微囊藻毒素的试剂或含有所述试剂的试剂盒，所述试剂包括所述a)、b)、c)、d)和e)中所述的单克隆抗体中的至少一种。
其中，所述微囊藻毒素的分子结构变异体为MC-LR,MC-RR,MC-YR,MC-LA, MC-LF,MC-LW,MC-LY,MC-WR,MC-HtyR,MC-HilR,[D-Asp3]MC-LR, [D-Asp3]MC-RR中的至少一种。
本发明还要求保护一种制备微囊藻毒素广谱型单克隆抗体的方法，包括用所述完全抗原组合物免疫小鼠得到被免疫小鼠，取所述被免疫小鼠中血清效价最高的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株，再将所述阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水，得到可以与12种微囊藻毒素小分子高亲和力结合的广谱型单克隆抗体；
具体可以包括以下步骤：
1)分别在12种微囊藻毒素分子结构变异体的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基，得到12种经氨基修饰的微囊藻毒分子；再将该12种经氨基修饰的微囊藻毒素分子分别与载体蛋白偶联得到12种完全抗原；
2)将步骤1)的12种完全抗原等质量混合，得到混合免疫原，对小鼠进行免疫后取小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株，得到微囊藻毒素广谱型单克隆抗体；
所述步骤1)中的12种微囊藻毒素的分子结构变异体为MC-LR,MC-RR,MC-YR, MC-LA,MC-LF,MC-LW,MC-LY,MC-WR,MC-HtyR,MC-HilR,[D-Asp3]MC-LR,和 [D-Asp3]MC-RR。
所述步骤1)中的所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白。
所述步骤2)中的免疫原为12种微囊藻毒素分子结构变异体分别与KLH或BSA 偶联后的等质量混合物。
所述步骤2)中的免疫小鼠为Balb/c小鼠；免疫方法为：每次免疫的所述免疫原用量为30-50μg/小鼠，两次免疫的间隔时间为10-30天；免疫方式为皮下多点注射；所述小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。
所述步骤2)中的筛选阳性杂交瘤细胞株的方法为：先用包被抗原筛选，再用制备免疫原以及包被抗原所用的蛋白单体筛选；所述包被抗原为将所述步骤1)中的经氨基修饰的微囊藻毒素分子与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到；所述包被抗原与所述免疫原中的载体蛋白不相同。
所述的单克隆抗体、所述的组合物、所述的免疫原、所述的试剂盒或者所述的方法在检测微囊藻毒素和/或纯化微囊藻毒素中的而应用也应在本发明的保护范围之内。
所述应用为检测环境样品或者食品中的微囊藻毒素；所述应用中的微囊藻毒素的分子结构变异体为MC-LR,MC-RR,MC-YR,MC-LA,MC-LF,MC-LW,MC-LY, MC-WR,MC-HtyR,MC-HilR,[D-Asp3]MC-LR,[D-Asp3]MC-RR中的至少一种。
所述应用为非疾病诊断目的的应用。
本发明中为了获得针对微囊藻毒素整个环肽结构具有高度特异性的抗体，分别在12种微囊藻毒素(MC-LR,MC-RR,MC-YR,MC-LA,MC-LF,MC-LW,MC-LY,MC-WR, MC-HtyR,MC-HilR,[D-Asp3]MC-LR,[D-Asp3]MC-RR)的第七位氨基酸(Mdha)上通过2-巯基乙胺化学修饰引入一个氨基活性基团，然后与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，分别得到12种微囊藻毒素与KLH的偶联物，采用“混合免疫原法”进行免疫，即分别将上述12种微囊藻毒素与KLH的偶联物(12种完全抗原)等质量混合后作为免疫原来免疫小鼠；再将上述12种小分子分别与或牛血清白蛋白(BSA)偶联并等量混合后作为包被抗原，采用间接ELISA法测定血清效价；选取血清效价满足要求的免疫小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株；培养阳性杂交瘤细胞株并进行亚型鉴定；将获得的IgG1亚型阳性杂交瘤细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水，得到广谱型的微囊藻毒素单克隆抗体MCAB1、MCAB2、MCAB3、MCAB4和MCAB5。抗体MCAB1与12种微囊藻毒素的平均亲和力常数为4.10×108L/mol，抗体 MCAB2与12种微囊藻毒素的平均亲和力常数为1.12×109L/mol，抗体MCAB3与12 种微囊藻毒素的平均亲和力常数为5.35×108L/mol，抗体MCAB4与12种微囊藻毒素的平均亲和力常数为6.64×108L/mol，抗体MCAB5与12种微囊藻毒素的平均亲和力常数为3.92×108L/mol，上述结果表明5株单克隆抗体对12种微囊藻毒素均具有较高的亲和力，可用于实际样品(如环境样品或者食品)中的微囊藻毒素检测。
生物材料保藏说明
1、生物材料的的分类命名：分泌微囊藻毒素广谱型抗体的阳性小鼠杂交瘤细胞株。
生物材料的编号：MCAB1。
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏单位简称：CGMCC。
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2019年12月10日。
保藏编号：CGMCC No.19194。
2、生物材料的的分类命名：分泌微囊藻毒素广谱型抗体的阳性小鼠杂交瘤细胞株。
生物材料的编号：MCAB2。
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏单位简称：CGMCC。
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2019年12月10日。
保藏编号：CGMCC No.19195。
3、生物材料的的分类命名：分泌微囊藻毒素广谱型抗体的阳性小鼠杂交瘤细胞株。
生物材料的编号：MCAB3。
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏单位简称：CGMCC。
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2019年12月10日。
保藏编号：CGMCC No.19196。
4、生物材料的的分类命名：分泌微囊藻毒素广谱型抗体的阳性小鼠杂交瘤细胞株。
生物材料的编号：MCAB4。
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏单位简称：CGMCC。
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2019年12月10日。
保藏编号：CGMCC No.19197。
5、生物材料的的分类命名：分泌微囊藻毒素广谱型抗体的阳性小鼠杂交瘤细胞株。
生物材料的编号：MCAB5。
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏单位简称：CGMCC。
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2019年12月10日。
保藏编号：CGMCC No.19198。
附图说明
图1为本发明筛选出的阳性杂交瘤细胞株MCAB2分泌的单克隆抗体与不同浓度的包被抗原BSA-MC-LR的结合曲线。
图2为本发明筛选出的阳性杂交瘤细胞株MCAB5分泌的单克隆抗体分别检测水样中的MC-LR、MC-RR和MC-YR的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
骨髓瘤细胞SP2/0种子(北京华大蛋白质研发中心)；SPF级Balb/c纯系雌性小鼠(斯贝福北京生物技术有限公司)；新生牛血清(南京维森特生物技术有限公司)；酶标二抗(羊抗小鼠IgG/HRP)(北京中杉金桥生物技术有限公司)；PEG 1500(Roche 公司)；HAT储液、HT储液、石蜡油、BSA、血蓝蛋白(KLH)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、2.2％甲基纤维素、2-巯基乙胺、戊二醛、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸盐缓冲液、四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢合尿素(CO(NH2)2·H2O2)、吐温-20、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich 公司)；IMDM培养基(Invitrogen公司)；二甲基亚砜(DMSO)(Amresco公司)； BupH PBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)；赖氨酸(上海源叶生物科技有限公司)；无水乙醚、乙酸、异丙醇、甲醇、盐酸、硫酸、氢氧化钠(北京化工厂)；MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA、MC-LF、MC-LW、MC-LY、MC-WR、MC-HtyR、 MC-HilR、[D-Asp3]MC-LR、[D-Asp3]MC-RR(Enzo Life Sciences公司)。
实施例1、阳性杂交瘤细胞株的获得、鉴定以及广谱型微囊藻毒素单克隆抗体的制备
1、免疫原KLH-MCs的合成
上述12种微囊藻毒素小分子结构变异体，分别在其第七位氨基酸(Mdha)上通过2-巯基乙胺化学修饰引入一个氨基活性基团，经固相萃取纯化后采用戊二醛两步法分别将修饰后的微囊藻毒素分子与KLH偶联，再经凝胶过滤层析后得到12种完全抗原，等量混合后得到免疫原KLH-MCs。具体方法如下：
步骤1氨基修饰的微囊藻毒素分子与KLH偶联物的制备
1.1、氨基修饰的MC-LR与KLH偶联物的制备
将摩尔比3000:1的2-巯基乙胺和微囊藻毒素小分子MC-LR溶于碱性碳酸盐缓冲液中(pH＝8.0)，50℃水浴中反应1-3小时；降至室温后加入乙酸使反应停止得到中间产物；将中间产物采用固相萃取技术在SPE固相萃取C18小柱(500mg/6ml)(Agela Technologies)上进行纯化，得到氨基修饰的MC-LR，具体纯化步骤为：
活化：先用甲醇活化柱子，15分钟后将超纯水以一定的流速流过柱子；
上样：将样品以一定的流速流过柱子进行富集浓缩，重力过滤；
淋洗：上样完毕后，用5％体积比的甲醇水溶液淋洗以净化样品；
洗脱：用甲醇洗脱样品并收集，得到经氨基修饰的MC-LR。
20mg载体蛋白KLH，先用少量PBS充分溶解，再加入2mL 1.25％的戊二醛溶液，室温反应12h以上，活化产物经Sephadex G-25PD-10Desalting Column(GE Healthcare)进行层析，其中流动相为超纯水，得到活化后的KLH，并用PBS溶液稀释；0.5mg活化后的KLH与30μg氨基修饰的MC-LR充分混合，室温下反应24h，得到氨基修饰的MC-LR与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-LR-KLH，将 NH2-MC-LR-KLH放置于-20℃冰箱中备用。
1.2、氨基修饰的MC-RR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-RR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-RR与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-RR-KLH，将NH2-MC-RR-KLH放置于 -20℃冰箱中备用。
1.3、氨基修饰的MC-YR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-YR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的MC-YR与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-YR-KLH，将NH2-MC-YR-KLH放置于 -20℃冰箱中备用。
1.4、氨基修饰的MC-LA与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-LA，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-LA与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-LA-KLH，将NH2-MC-LA-KLH放置于 -20℃冰箱中备用。
1.5、氨基修饰的MC-LF与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-LF，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-LF与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-LF-KLH，将NH2-MC-LF-KLH放置于 -20℃冰箱中备用。
1.6、氨基修饰的MC-LW与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-LW，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-LW与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-LW-KLH，将NH2-MC-LW-KLH放置于 -20℃冰箱中备用。
1.7、氨基修饰的MC-LY与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-LY，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-LY与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-LY-KLH，将NH2-MC-LY-KLH放置于 -20℃冰箱中备用。
1.8、氨基修饰的MC-WR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-WR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-WR与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-WR-KLH，将NH2-MC-WR-KLH放置于-20℃冰箱中备用。
1.9、氨基修饰的MC-HtyR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-HtyR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的MC-HtyR与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-HtyR-KLH，将NH2-MC-HtyR-KLH 放置于-20℃冰箱中备用。
1.10、氨基修饰的MC-HilR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为MC-HilR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的 MC-HilR与KLH偶联物，以下简称为NH2-MC-HilR-KLH，将NH2-MC-HilR-KLH放置于-20℃冰箱中备用。
1.11、氨基修饰的[D-Asp3]MC-LR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为[D-Asp3]MC-LR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的[D-Asp3]MC-LR与KLH偶联物，以下简称为NH2-[D-Asp3]MC-LR-KLH，将 NH2-[D-Asp3]MC-LR-KLH放置于-20℃冰箱中备用。
1.12、氨基修饰的[D-Asp3]MC-RR与KLH偶联物的制备
将步骤1.1中的MC-LR替换为[D-Asp3]MC-RR，其它操作完全相同，得到氨基修饰的[D-Asp3]MC-RR与KLH偶联物，以下简称为NH2-[D-Asp3]MC-RR-KLH，将 NH2-[D-Asp3]MC-RR-KLH放置于-20℃冰箱中备用。
上述步骤中，12种微囊藻毒素小分子结构变异体的结构通式如式(1)所示，修饰后的12种微囊藻毒素小分子结构变异体的结构通式如式(2)所示，12种微囊藻毒素小分子结构变异体的R1、R2和R3的具体基团分别如表1所示。
Figure RE-GDA0002594259380000101
表1、12种微囊藻毒素小分子结构变异体在可变位点的特定基团
Figure RE-GDA0002594259380000102
Figure RE-GDA0002594259380000111
2免疫原的制备
将步骤1.1-1.12中制备的偶联物NH2-MC-LR-KLH,NH2-MC-RR-KLH, NH2-MC-YR-KLH,NH2-MC-LA-KLH,NH2-MC-LF-KLH,NH2-MC-LW-KLH, NH2-MC-LY-KLH,NH2-MC-WR-KLH,NH2-MC-HtyR-KLH,NH2-MC-HilR-KLH, NH2-[D-Asp3]MC-LR-KLH和NH2-[D-Asp3]MC-RR-KLH等质量混合后，得到免疫原 KLH-MCs溶液。
(2)动物免疫与效价测定
将步骤2的免疫原KLH-MCs溶液与免疫佐剂等体积混合后免疫小鼠。
选取适龄的SPF级Balb/c雌性小鼠，采用低剂量长程免疫法进行免疫，方法为：皮下多点注射，按照50μg KLH-MCs/只小鼠的剂量，对5只小鼠(编号为：1、2、3、 4、5)进行初次免疫，每次每只小鼠注射0.1mL液体，其中，该0.1mL液体由0.05mL 免疫原KLH-MCs溶液和0.05mL弗氏完全佐剂组成；之后按照30μg KLH-MCs/只小鼠的量对5只小鼠进行加强免疫，免疫间隔时间为2周，共免疫6次，每次每只小鼠注射0.06mL液体，其中，该0.06mL液体由0.03mL免疫原KLH-MCs溶液和0.03mL 弗氏不完全佐剂组成。在第6次加强免疫1周后，对小鼠进行眼眶取血，用间接ELISA 法测定效价，其中，包被抗原为12种BSA-MC的等量混合物，包被浓度为2μg/mL。对抗血清效价达到要求的小鼠，按照50μg免疫原/只小鼠的量进行一次腹腔注射冲击免疫，此次所用免疫原为12种BSA-MC的等量混合物(BSA-MCs)，3天后再次测定效价，选取血清效价最高的小鼠脾细胞进行细胞融合。
上述实验中，包被抗原BSA-MC的合成方法具体为：包被抗原的合成方法同步骤 1中所述的步骤，将步骤1的中的KLH替换为BSA，最后再加入20μL浓度为0.2M 的赖氨酸溶液于室温下反应1～4h，以阻断未反应的醛基，得到的包被抗原放置于-20℃冰箱中备用。对12种BSA-MC分别用MALDI-TOF/MS进行质谱鉴定，测定的12种微囊藻毒素小分子与BSA的偶联比均为1:1。
(2)细胞融合
1)将状态良好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞轻轻地从培养瓶壁上吹打下来，转移至50mL离心管中；小鼠摘眼球取血后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min；
2)在平皿中倒入少量不含血清的IMDM培养基，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中；
3)在无菌状态下取出小鼠脾脏，置于细胞筛上，用注射器内芯轻轻地将脾脏充分碾碎，再将碾好的细胞吸入到装有SP2/0细胞的离心管中，室温1500r/min下离心5 min；
4)取小鼠的胸腺并碾碎，转移至15mL离心管中，再加入1mL HAT培养液，于孵箱中(37℃，5％CO2)进行培养。
5)将离心好的细胞弃上清液，用不含血清的IMDM培养基将细胞小心轻柔地吹匀，再次于室温1500r/min下离心5min。
6)将离心好的细胞弃上清液，轻拍离心管底使细胞充分悬浮，再将离心管置于 37℃温水浴中，并在1min内缓慢加入1mL聚乙二醇(PEG)，静置1min后，在2 min内缓慢加入2mL不含血清的IMDM培养基，接着在2min内缓慢加入8mL不含血清的IMDM培养基，室温1000r/min下离心5min。
7)弃上清，加入10mL血清，并小心将细胞吹匀，加入步骤4)备好的胸腺细胞，再加入25mL无菌的半固体培养基，充分混匀后均匀倒入30个细胞培养皿中并置于湿盒中，于孵箱中(37℃，5％CO2)培养。
8)在第11天左右，开始挑克隆，此时细胞团大小肉眼可见，在显微镜下能够很好的分辩(注意防止培养基颜色变黄，导致营养不够，细胞团出现死亡；若细胞融合团较多，可提前挑克隆)。挑10板×93个细胞单克隆于96孔细胞培养板中培养(事先用含小鼠胸腺细胞的20％IMDM+2％HT培养液铺板，120μL/孔)，第3天换液一次，第5天细胞已铺满96孔板，此时采用间接ELISA检测培养基上清液中的抗体。
(5)阳性克隆株筛选
1)用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释“BSA-MC”使其终浓度为2μg/mL，100μL/孔加入到96孔酶联板中进行包被，于4℃包被过夜后用PBS-T(0.05％吐温 -20-PBS)洗液洗涤3次。
2)用封闭液(2％脱脂牛奶-PBS)封闭，200μL/孔，37℃孵育2h后用洗液洗涤 3次。
3)分别于相应孔中加入一抗(96孔板中的细胞培养上清液)、阴性对照(SP2/0 培养上清液)、空白对照(PBS溶液)、阳性对照(PBS稀释1000倍阳性血清)，均为100μL/孔，37℃孵育1h后用洗液洗涤3次。
4)加入PBS稀释20000倍的酶标二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h后用洗液洗涤3次。
5)加显色液(1％A液+10％B液+超纯水(A液：1％TMB-DMSO；B液：0.1％H2O2- 柠檬酸缓冲液))，100μL/孔，显色时间为5min左右。
6)加终止液(2M浓硫酸)，50μL/孔，终止反应。
7)酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
A450值为阴性对照2.1倍的为阳性杂交瘤细胞株。对于一筛呈阳性的31株克隆株，进一步培养后，按照同样方法进行第二次筛选，得到23株阳性杂交瘤细胞株。
(6)阳性克隆株亚类鉴定
1)用100mM PBS(pH7.4)溶液稀释包被抗体(各亚类抗体混合物)至0.5μg/mL,0.1mL/孔，4℃孵育过夜。
2)PBS-T洗2次，加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育2h。
3)PBS-T洗3次，加入阳性杂交瘤上清液，100μL/孔，37℃孵育1h。
4)PBS-T洗3次，相应孔中分别加入封闭液(2％BSA+3％蔗糖于PBS中)1：1000 (轻链：κ，λ)或1：2000(重链：M,G1,G2a,G2b,G3,A)稀释的各亚类酶标二抗， 0.1mL/孔，37℃孵育1h。
5)PBS-T洗3次，加入显色溶液，100μL/孔，5min后加终止液，50μL/孔，10-20 min内用酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
23株阳性细胞株进行亚类鉴定后，确认其中5株为IgG1型阳性杂交瘤细胞株。分别用12种BSA-MC单体和BSA再次包板，采用间接ELISA方法做筛选，确认5 株IgG1型阳性杂交瘤细胞株对12种微囊藻毒素均具有特异性响应。5株阳性杂交瘤细胞株，名称分别为MCAB1，MCAB2，MCAB3，MCAB4，MCAB5，于2019年12 月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，杂交瘤细胞株MCAB1的保藏编号分别为CGMCC No.19194，杂交瘤细胞株MCAB2的保藏编号分别为CGMCC No.19195，杂交瘤细胞株MCAB3的保藏编号分别为CGMCC No.19196，杂交瘤细胞株MCAB4的保藏编号分别为CGMCC No.19197，杂交瘤细胞株MCAB5的保藏编号分别为CGMCCNo.19198。
分别取上述5种杂交瘤细胞株按照步骤(7)和步骤(8)的方法制备单克隆抗体，并将杂交瘤细胞株MCAB1分泌的单克隆抗体命名为抗体MCAB1；杂交瘤细胞株 MCAB2分泌的单克隆抗体命名为抗体MCAB2；杂交瘤细胞株MCAB3分泌的单克隆抗体命名为抗体MCAB3；杂交瘤细胞株MCAB4分泌的单克隆抗体命名为抗体 MCAB4；杂交瘤细胞株MCAB5分泌的单克隆抗体命名为抗体MCAB5。
(7)腹水制备
1)将恒温水浴箱温度调节至37℃-40℃。
2)从液氮罐中取出冻存的细胞株，立即放入37℃-40℃温水中迅速晃动，直至完全溶解。
3)将细胞冻存悬浮液转移到离心管中，加入5mL完全培养基(IMDM+15％新生牛血清)，轻轻吹打混匀。
4)将细胞悬浮液于室温1000r/min下离心5min，弃上清液。
5)向细胞沉淀内加入完全培养基，轻轻吹打混匀后，转移到细胞培养皿内，置于37℃细胞培养箱中培养。
6)将细胞培养到对数生长期，PBS溶液洗涤并对细胞计数。
7)小鼠腹腔在接种一周前采用腹腔注射方式打石蜡油，500μL/Balb/c小鼠。
8)采用腹腔注射方式接种细胞，每只小鼠注射1mL(细胞量5×105-9×105个/mL)。
9)一周后取腹水，5000r/min下离心10min，取上清液，于-20℃保存。
(8)抗体纯化
1)腹水样本预处理：用偶联缓冲液(20mM磷酸钠溶液，pH 7.0)将解冻后的腹水上清液稀释3倍，12000r/min，4℃下离心10min，再用0.22μm滤膜过滤，以除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。
2)平衡：用10倍抗体亲和预装柱(HiTrap rProteinAFF)体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速为1mL/min。
3)上样：柱中加入样品，收集流出液，保持流速为1mL/min。
4)洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为1mL/min。
5)洗脱：用5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠溶液，pH 3.5)洗脱抗体，收集于离心管中，保持流速为1mL/min，之后立即用1M pH 9.0的Tris-HCl缓冲液将收集液的pH调整至7.0。
6)透析：使用0.01M PBS缓冲液将抗体透析过夜，换液3次。
得到的抗体采用SDS-PAGE(12％分离胶浓度)检测纯度，采用紫外分光光度计检测浓度。确认得到的5株抗体纯度都在90％以上，满足下游分析需求。
实施例2、分别检测5株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与12种微囊藻毒素的亲和力
采用间接ELISA方法检测，具体操作步骤如下：
1)用包被液分别稀释12种“BSA-MC”，使其终浓度分别为4，2，1，0.5，0.25μg/mL，共5个梯度，100μL/孔加入到96孔酶联板中进行包被，于4℃包被过夜后用PBS-T 洗液洗涤3次。
2)用封闭液(2％脱脂牛奶-PBS)封闭，200μL/孔，37℃孵育2～4h后用洗液洗涤3次。
3)将纯化后的5株抗体(抗体MCAB1、抗体MCAB2、抗体MCAB3、抗体MCAB4 和抗体MCAB5)，用PBS分别稀释成1：250，再作一系列2倍梯度稀释，分别为1： 500，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000，1： 128000，1：256000，1：512000，共12个梯度；分别于相应孔中加入一抗(上述浓度梯度抗体)、空白对照(PBS溶液)，均为100μL/孔，37℃孵育1～4h后用洗液洗涤 3次。
4)加入PBS稀释20000倍的酶标二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)，100μL/孔，37℃孵育1～4h后用洗液洗涤3次。
5)加显色液，100μL/孔，显色时间为5～10min左右。
6)加终止液(2M浓硫酸)，50μL/孔，终止反应。
7)酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
以阳性杂交瘤克隆株MCAB2分泌的抗体MCAB2与MC-LR的反应为例，取包被抗原浓度分别为2，1，0.5，0.25μg/mL测定抗原抗体反应曲线，结果如图1所示。以包被抗原浓度为2μg/mL的抗原抗体反应曲线为例，计算方法如下：
1)通过对反应曲线进行Logistic模型拟合，得到2μg/mL包被抗原浓度对应最大吸光度一半(即1/2Amax)时，抗体的稀释倍数。
2)根据经过纯化的抗体MCAB2的浓度，可计算出在上述稀释倍数下对应的抗体总浓度Abt，其中抗体分子量按150,000(IgG分子量)计算。
3)按照同样方法计算出包被抗原浓度为1μg/mL条件下，对应最大吸光度的一半时抗体的稀释倍数，由此计算出抗体总浓度Abt’。
4)根据以下抗体亲和力常数计算公式(n为两个包被抗原的浓度倍数关系，即n＝2)，即可计算出一个亲和常数K1。
Figure RE-GDA0002594259380000151
5)以此类推，可得出三个亲和常数K1，K2及K3，计算平均值即得抗体MCAB2 与MC-LR的亲和常数。相同方法计算抗体MCAB2与其他11种微囊藻毒素的亲和力常数，12个亲和常数取平均值得到抗体MCAB2与12种微囊藻毒素的平均亲和力常数，具体结果见表2。
按照上述相同的方法将抗体MCAB2替换为抗体MCAB1，得到抗体MCAB1与 12种微囊藻毒素的亲和力常数及其平均亲和力常数，结果如表2所示。
按照上述相同的方法将抗体MCAB2替换为抗体MCAB3，得到抗体MCAB3与 12种微囊藻毒素的亲和力常数及其平均亲和力常数，结果如表2所示。
按照上述相同的方法将抗体MCAB2替换为抗体MCAB4，得到抗体MCAB4与 12种微囊藻毒素的亲和力常数及其平均亲和力常数，结果如表2所示。
按照上述相同的方法将抗体MCAB2替换为抗体MCAB5，得到抗体MCAB5与 12种微囊藻毒素的亲和力常数及其平均亲和力常数，结果如表2所示。
表2、5株单克隆抗体分别与12种微囊藻毒素的亲和力常数及其平均亲和力常数
Figure RE-GDA0002594259380000161
从表2中可以看出，抗体MCAB1平均亲和力常数为4.10×108L/mol，抗体MCAB2 与12种微囊藻毒素的平均亲和力常数为1.12×109L/mol，抗体MCAB3平均亲和力常数为5.35×108L/mol，抗体MCAB4平均亲和力常数为6.64×108L/mol，抗体MCAB5 平均亲和力常数为3.92×108L/mol。上述结果表明5株单克隆抗体对12种微囊藻毒素均具有较高的亲和力，兼备广谱特异性和高亲和力的优势，通过合理设计免疫传感分析方法，以期可以直接定量检测水体中总微囊藻毒素，从而实现微囊藻毒素的大规模样品快速筛查和预警监测。
实施例3、采用杂交瘤细胞株CGMCC No.19198分泌的单克隆抗体MCAB5分别检测水样中的MC-LR、MC-RR和MC-YR
采用间接ELISA方法检测，具体操作步骤如下：
1)将MC-LR、MC-RR和MC-YR标准品采用超纯水分别作一系列3倍梯度稀释，浓度分别为：1000、333、111、37、12.34、4.12、1.37、0.46、0.15、0.05μg/L，作为水样。
2)采用NH2-MC-LR-BSA作为包被抗原(所述NH2-MC-LR-BSA为将实施例1 中步骤1.1中的KLH替换为BSA，得到的氨基修饰的MC-LR与BSA偶联物)，用包被液将其稀释为2μg/mL，100μL/孔加入到96孔酶联板中进行包被，于4℃包被过夜后用PBS-T洗液洗涤3次。
3)用封闭液(2％脱脂牛奶-PBS)封闭，200μL/孔，37℃孵育2～4h后用洗液洗涤3次，将步骤1)的标准水样溶液、空白对照(标准液用PBS溶液代替)，分别加入酶标板相应孔中，均为100μL/孔。
4)加入纯化后的抗体MCAB5(用PBS稀释成1：1000)，均为100μL/孔，37℃孵育1～4h后用洗液洗涤3次。
5)加入PBS稀释20000倍的酶标二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)，100μL/孔，37℃孵育1～4h后用洗液洗涤3次。
6)加显色液，100μL/孔，显色时间为5～10min左右。
7)加终止液(2M浓硫酸)，50μL/孔，终止反应。
8)酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
结果如图2所示。表明3条标准曲线均具有完整的反S形状，具有上平台和下平台，误差线为n＝3次平行实验的标准偏差，相对标准偏差(变异系数)均在20％以内，表明检测精密度良好。
采用4参数Logistic模型作为间接竞争ELISA检测的数据分析和评价基础，模型如下：
Figure RE-GDA0002594259380000181
其中：
x：目标物浓度，自变量；
A：x对应的吸光度(Absorbance)，因变量；
A1：上端渐近线值(x＝0)，即最大吸光度；
A2：下端渐近线值(x→∞)，即最小吸光度；
p：线性区间斜率；
x0：曲线的中点，即拐点。
在竞争ELISA中，半抑制浓度IC50＝x0；依据上述Logistic模型，结合率Y计算公式如下，标准曲线的最低检测限为Y＝90％时对应的目标物质的浓度，定量检测区间为Y＝80％～20％对应的目标物浓度区间。
Figure RE-GDA0002594259380000182
分别对图2中的3条标准曲线采用四参数Logistic模型拟合，分析结果表明单克隆抗体MCAB5对MC-LR的半抑制浓度为IC50＝2.44μg/L，最低检测限为0.25μg/L，定量区间为0.58μg/L-10.33μg/L；对MC-RR的半抑制浓度为IC50＝6.66μg/L，最低检测限为0.36μg/L，定量区间为1.06μg/L-41.67μg/L；对MC-YR的半抑制浓度为IC50＝ 5.47μg/L，最低检测限为0.40μg/L，定量区间为1.05μg/L-28.62μg/L。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (7)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为如下a、b、c、d或e：
a)由保藏号为CGMCC No.19194的杂交瘤细胞株MCAB1产生的单克隆抗体；
b)由保藏号为CGMCC No.19195的杂交瘤细胞株MCAB2产生的单克隆抗体；
c)由保藏号为CGMCC No.19196的杂交瘤细胞株MCAB3产生的单克隆抗体；
d)由保藏号为CGMCC No.19197的杂交瘤细胞株MCAB4产生的单克隆抗体；
e)由保藏号为CGMCC No.19198的杂交瘤细胞株MCAB5产生的单克隆抗体；
所述单克隆抗体为可与 12 种微囊藻毒素小分子高亲和力结合的广谱型单克隆抗
体；所述12种微囊藻毒素为MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LA, MC-LF, MC-LW, MC-LY,
MC-WR, MC-HtyR, MC-HilR, [D-Asp3]MC-LR 和[D-Asp3]MC-RR。
2.用于检测微囊藻毒素的试剂或含有所述试剂的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括权利要求1中a）、b）、c）、d）和e）中所述的单克隆抗体中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述微囊藻毒素为MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LA, MC-LF, MC-LW, MC-LY, MC-WR, MC-HtyR, MC-HilR, [D-Asp3]MC-LR, [D-Asp3]MC-RR中的至少一种。
4.一种制备微囊藻毒素广谱型单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）分别在12种微囊藻毒素分子结构变异体的第七位氨基酸残基N-甲基脱氢丙氨酸上引入一个氨基，得到12种经氨基修饰的微囊藻毒分子；再将该12种经氨基修饰的微囊藻毒素分子分别与载体蛋白偶联得到12种完全抗原；
2）将步骤1）的12种完全抗原等质量混合，得到混合免疫原，对小鼠进行免疫后取血清效价最高的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞株，将其注入同系小鼠腹腔诱生腹水，得到可与12种微囊藻毒素小分子高亲和力结合的广谱型单克隆抗体；
所述12种微囊藻毒素为MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LA, MC-LF, MC-LW, MC-LY, MC-WR, MC-HtyR, MC-HilR, [D-Asp3]MC-LR和[D-Asp3]MC-RR。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中的所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白。
6.权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求2或3所述的试剂盒或者权利要求4或5所述的方法在检测微囊藻毒素和/或纯化微囊藻毒素中的应用；所述应用为非疾病诊断目的的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用为检测环境样品或者食品中的微囊藻毒素；所述微囊藻毒素为MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LA, MC-LF, MC-LW, MC-LY, MC-WR, MC-HtyR, MC-HilR, [D-Asp3]MC-LR, [D-Asp3]MC-RR中的至少一种。
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