CN108918851B - 一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，包括金标垫与样品垫的预处理、胶体金喷点到金标垫、抗原喷点到NC膜。本发明制得的拉莫三嗪胶体金试纸条具有检测灵敏度高的优点。

Description

一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法
技术领域
本发明涉及一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
拉莫三嗪为苯三嗪类抗癫痫药，具有广谱、安全、高效的特点，对多种癫痫发作和癫痫综合征均有良好疗效。
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。
1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法，用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。
胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
发明内容
有鉴于此，本发明提出一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，包括：
样品垫的制备：将玻璃纤维或聚酯纤维用样品垫处理液浸泡，然后取出脱水，接着将样品垫放入干燥箱内，烘干至湿度为19~21%得到样品垫；
金标垫的制备：将玻璃纤维或聚酯纤维用金标垫处理液浸泡，然后取出脱水，接着将金标垫放入干燥箱内，烘干至湿度为19~21%，再在相对湿度为20-40％，室温条件下，用BIODOT仪器的AIRJET喷头将拉莫三嗪单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在所述金标垫上，喷点参数为4~6ul/cm2；然后置于37℃条件下干燥, 至湿度为19~21%；
反应膜的制备：用磷酸缓冲液将拉莫三嗪半抗原-卵清蛋白偶联物稀释，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线C，将包被好的反应膜置于37 ℃条件下干燥2 h；
将样品垫、金标垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC背板上；金标垫从起始端有一定区域被样品垫覆盖，金标垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品垫的始端与PVC背板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC背板的末端对齐；所述反应膜的检测线和质控线均呈与所述试纸条的长度相垂直的条状带；检测线位于金标垫的末端的一侧；质控线位于远离金标垫的末端的一侧。
优选的技术方案为：所述样品垫处理液由质量分数为0.4~0.7%的牛血清蛋白溶液和pH值为7 .2的0 .1mol/L的磷酸盐缓冲液混合后构成。
优选的技术方案为：所述金标垫处理液由质量分数为0.4~0.7%的牛血清蛋白溶液和pH值为7 .2的0 .1mol/L的磷酸盐缓冲液混合后构成。
优选的技术方案为：所述拉莫三嗪单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法包括：取1ml胶体金溶液于试管中，加入0.2M的K2CO3溶液1.5-3.0μl，搅拌均匀后得到胶体金溶液，然后向胶体金溶液中加入20-50μg拉莫三嗪单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置，加入质量分数为10%的牛血清蛋白溶液，混匀后静置10 min，然后在4℃条件下，以12000r/min离心5分钟，沉淀用复溶缓冲液洗涤，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬。
附图说明
图1为 pH的优化结果。
图2为Ab标记量的优化。
图3为赛多利斯140膜检测不同稀释倍数标品的结果。
图4为NC95膜检测不同稀释倍数标品的结果。
图5为MDI70膜检测不同稀释倍数标品的结果。
图6为灵敏度试验（高检）。
图7灵敏度试验（低检）。
图8为A批次检测结果。
图9为B批次检测结果。
图10为标准品稀释液点样结果（高检）。
图11为高检（15ppm）。
图12为低检（2.5ppm）。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明制得的拉莫三嗪胶体金试纸条具有检测灵敏度高的优点。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
参见图1~12所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法
在NC膜检测线上包被拉莫三嗪抗原，利用金颗粒标记拉莫三嗪抗体，样本中的拉莫三嗪在层析的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线（T线）上的拉莫三嗪抗原偶联物的结合，从而导致检测线（T线）显示一条浅色条带或不显色；若样本中无对应被检测物则在T线位置显示红色条带。以此来判断所测样本中被检测物是否超出该产品检测限。
二、胶体金垫与样品垫的预处理
1、配置缓冲液，处理液配方根据具体产品准备，基本元素：缓冲液+表面活性剂+蛋白（BSA,Casein）+其他。
2、将空白金标垫及样品垫放入各自对应的缓冲液中完全浸透，浸泡5min，后取出脱水2min，平置在筛网上。
3、放入37℃干燥箱（湿度小于20%），烘干至湿度恒定在20%左右。
4、将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，放入干燥剂，贴标签并记录批号。
三、点样
1、胶体金喷点到胶体金垫
1）标记完成胶体金浓度可自行调节。
2)在湿度20-40％, 室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10 PSI，喷点参数为5ul/cm。
3)将喷好的胶体金条带置于37℃干燥, 湿度恒定在20%后，收起并密封贮存。
2、抗原喷点到NC膜
1)取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡0.5小时。
2)用缓冲溶液将抗原1:10稀释。
3)使用BIODOT仪器，设定喷点量为1ul/cm，并点样。
4)烘箱干燥，37度过夜烘干，后密封包装待用。
四、项目调试
1、原材料反应体系的初步建立
1.1胶体金试纸条的组成与前期准备
根据胶体金试纸条调试、制作方法与工艺，准备相应的辅料，其中主要有：NC膜，背板，金标垫，样品垫，吸水纸（以上辅助材料，均按照北京勤邦生物技术有限公司现有小分子检测工艺进行采购与配置）。
1.2抗原的包被
用包被液将抗原稀释，用划膜仪划线（划膜仪参数设置为1.0/1.0）。具体如下：
C线：PC-4-C-CT（羊抗鼠）80倍
T线：10倍（2.5ppm检测限）；5倍（15ppm检测限）
注：在膜面上标记出划线不实的地方，然后置于37℃干燥并过夜，过夜后收于密封袋内备用。
1.3抗体的标记
用红色金颗粒标记（1. 5%金标记，1. 5表示金与还原剂的比例），抗体按1µl/ml加入，具体标记方法与步骤如下：
1）取1ml胶体金溶液于2mL试管中，加入0.2M K2CO3 2.0µl/ml，混匀。
2）标记Ab量为1µl /ml，混匀后静置5min。
3）加入封闭液40µl/ml（10%BSA），混匀后静置5min。
4）4℃、12000r/min离心，5min；1/10体积的复溶液CS复溶。
1.4试剂条的准备
把抗原用包被液5倍稀释后用移液器点1µl于空白NC膜上，背板一端贴上吸水纸，另一端贴上处理后的金标垫与样品垫，辅料之间相互连接，两端均压NC膜1-2mm，切成3.9mm宽的条子，备用。
2、工艺反应体系的优化
2.1抗体标记条件的优化
1）pH的优化：用1.5%的金，0.2mol/L的K2CO3分别加1.5/2/2.5/3.0µl /ml，抗体标记量为1µl/ml，每个条件标记1 ml，10%BSA封闭，复溶液CS复溶至100µl，备用。结果如图1所示。结果： 0.2mol/L K2CO3加入量为1.5.0µl/ml时，效果最好。
2）Ab标记量的优化：在上述标记条件下，Ab标记量调整为1、2µg/ml；结果如图2所示：结果显示：Ab标记量在1、2µg/ml加金量相同的情况下显色基本一致，因此抗体标记量定为1µg/ml。
2.2 NC膜的优化
如图3~5所示，由于需要用相同的抗原、抗体原料建立2.5ppm、15ppm两个相差6倍的检测限的试纸条系统，故在金量相同时，选择阴性显色最深的试纸条。故此选择CN95膜。
五、产品性能测试
1、灵敏度试验
对所测阴性血浆样本进行加标回收试验，结果如图6、7所示：结果显示：高检和低检试纸条的 1/2检测限，即7.5ppm和1.25ppm均可见T线；检测限即15ppm和2.5pm均不可见T线。符合胶体金消线产品对1/2检测限和检测限的要求。
2、重复性试验
制备两批不同批次的半成品，批次A和批次B，分别做阴性、阳性（标准品15ppm）各5条，结果如图8、9所示，结论：从图可以看出，批次A阴性和阳性平行性良好，各平行试纸条之间无明显差异；批次B阴性和阳性平行性良好，各平行试纸条之间无明显差异；批次A和批次B之间亦无没有明显差异。
六、检测样本结果
1、样本稀释倍数的确定
将拉莫三嗪标准品用0.02MPBS逐级稀释至5ppb、10ppb、20ppb、40ppb、80ppb、160ppb 、320ppb、640ppb，结果如图10所示：结果可见：检测160ppb标品，消线，80ppb时T线可见。高检测限15ppm，与标品160ppb之间相差约100倍，故此将样本稀释倍数暂定为100。同时又与80倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍的稀释结果做了对比。最终确定为样本的稀释倍数为100倍。
注：“0”表示样品稀释液中拉莫三嗪标品含量为0；“5ppb”表示样品稀释液中拉莫三嗪标品含量为5ppb；以此类推。
2、样本检测结果如图11、12所示。
如图所示：样本含量低于2.5ppm时，低检和高检试纸条均显示为阴性即C、T线均显色；样本含量在2.5ppm和15ppm之间时，低检试纸条为阳性，高检试纸条为阴性，即低检试纸条只有C线显色而高检试纸条C、T线均显色；样本中拉摸三嗪的含量高于15ppm时，高检试纸条和低检试纸条均呈阳性，即高检和低检试纸条均只有C线显色。
卡壳上的数字为样本编号。高检试纸条16号样本含量最高，故该卡条T线显色最浅；低检试纸条13、17号样本含量低于2.5ppm故T线显色。图片中T线的显色深度与实际效果略有差异。
七、结论
由以上实验得知，对已知的抗原抗体，从抗体标记参数、抗原包被参数、NC膜、金颗粒大小、复溶液、前处理方法优化进行调试，通过调试产品达到检测需求，抗体为LAM-Ab，浓度为6.2mg/ml，抗体标记用参数为K2CO31.5ul/ml，标记量为抗体原液1 ug/ml，抗原为LAM-Ag，浓度为1.5mg/ml，划膜浓度为抗原原液5稀释。样本稀释液为0.02M PBS，稀释倍数为100倍，NC膜为CN95。
实施例2：一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法
一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，包括：
样品垫的制备：将聚酯纤维用样品垫处理液浸泡，然后取出脱水，接着将样品垫放入干燥箱内，烘干至湿度为20%得到样品垫；
金标垫的制备：将聚酯纤维用金标垫处理液浸泡，然后取出脱水，接着将金标垫放入干燥箱内，烘干至湿度为20%，再在相对湿度为30％，室温条件下，用BIODOT仪器的AIRJET喷头将拉莫三嗪单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在所述金标垫上，喷点参数为5ul/cm2；然后置于37℃条件下干燥, 至湿度为20%；
反应膜的制备：用磷酸缓冲液将拉莫三嗪半抗原-卵清蛋白偶联物稀释，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线C，将包被好的反应膜置于37 ℃条件下干燥2 h；
将样品垫、金标垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC背板上；金标垫从起始端有一定区域被样品垫覆盖，金标垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品垫的始端与PVC背板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC背板的末端对齐；所述反应膜的检测线和质控线均呈与所述试纸条的长度相垂直的条状带；检测线位于金标垫的末端的一侧；质控线位于远离金标垫的末端的一侧。
优选的实施方式为：所述样品垫处理液由质量分数为0.55%的牛血清蛋白溶液和pH值为7 .2的0 .1mol/L的磷酸盐缓冲液混合后构成。
优选的实施方式为：所述金标垫处理液由质量分数为0.55%的牛血清蛋白溶液和pH值为7 .2的0 .1mol/L的磷酸盐缓冲液混合后构成。
优选的技术方案为：所述拉莫三嗪单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法包括：取1ml胶体金溶液于试管中，加入0.2M的K2CO3溶液2μl，搅拌均匀后得到胶体金溶液，然后向胶体金溶液中加入35μg拉莫三嗪单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置，加入质量分数为10%的牛血清蛋白溶液，混匀后静置10 min，然后在4℃条件下，以12000r/min离心5分钟，沉淀用复溶缓冲液洗涤，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬。
复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.2％、吐温-80的质量分数为0.1％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法：
试剂与溶液：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（北京勤邦生物技术有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS，浓度，pH7.2），包被液（磷酸盐缓冲液浓度，pH7.4），反应稀释液（PBST，浓度，pH7.4+0.05%吐温20），洗涤工作液（用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释）；封闭液（在0.02mol/L PBS1中加入0.05%BSA），底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化氢，B液为四甲基联苯胺；终止液（2mol/L H2SO4），酶标二抗（北京勤邦生物）。
主要仪器设备：真空冷冻干燥机，电热恒温培养箱，ProteinA/G柱，酶标仪，低温高速离心机等。
动物免疫：1、免疫方式：皮下多点注射。免疫小鼠数量：各免疫原分别免疫5只Balb/c小鼠，共30只。免疫时间进程记录。1.小鼠以不同的免疫原分组，每组5只鼠。2.M：免疫，1M代表第一次免疫；C：采血，1C代表第一次采血检测结果；以此类推。
检测方法：
1、主要试剂：酶标二抗（北京勤邦生物），改造抗原（北京勤邦生物），标准品，洗涤液，抗体稀释液，标准品稀释液，抗原稀释液，底物A /B 液，封闭液。
2、主要耗材：96孔酶标板（北京勤邦生物）。
3、实验操作步骤：
A、包板：稀释液稀释抗原至500倍浓度，混匀并加入酶标板（每孔100ul、37 ℃
孵育、2小时），洗板一次，拍干；
B、封闭：加入封闭液进行封闭（每孔150ul、37 ℃孵育、2小时），弃液，拍
干，备用；
C、加抗体：将抗体稀释相应浓度，每孔加入50ul；（37 ℃孵育、30分钟）；
D、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
E、加酶标二抗：每孔100ul、37℃孵育、30分钟；
F、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
G、显色：加入等量A/B底物显色液，（每孔100ul 、37 ℃孵育、15分钟）；
H、终止：加入终止液终止反应；
I、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm。
一种拉莫三嗪单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤。
第一步：将拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物作为免疫原注射入Balb/c小鼠体内，所用免疫原用量为60ug/只，每隔7~15天免疫一次，使Balb/c小鼠产生抗血清；
第二步：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按6:1的数量比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用聚乙二醇水溶液作为融合剂将两种细胞融合得到融合细胞，然后将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的细胞培养板中，再将细胞培养板置于CO2培养箱中进行培养；待融合细胞开始形成集落后进行第一次 ELISA 筛选，以筛选到仅与拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆7天后再进行单克隆孔的ELISA 筛选，重复亚克隆 2次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；
第三步：向6~7周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，注射量为0 .5 mL/只，7天后腹腔注射所述杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水，离心后吸出上清液，然后用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到拉莫三嗪单克隆抗体溶液。
拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物的制备方法：
1、称10mg对氨基苯甲酸溶入1.1mL的0.2 mol/L HCl 中，置于0-4℃搅拌至完全溶解，得到对氨基苯甲酸溶液；然后称取6mg的 NaNO2溶在0.35mL的蒸馏水中，置于0-4℃搅拌至完全溶解，得到 NaNO2溶液；将NaNO2溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1 小时，得A液。
2、称取1.5mg 的拉莫三嗪分散在10mL含NaCl 的硼砂缓冲液中，置于 0-4℃下搅拌至完全溶解，得到B液；将A液逐滴加入到B液中，避光反应 2 小时，得到C液；含 NaCl 的硼砂缓冲液中，硼砂的浓度为 0.05mol/L，pH值为 8.5，并含有浓度为0.15mol/L的NaCl。
3、在C液中添加H3BO3晶体调节其pH值至7.4，然后加入94mg牛血清白蛋白、80mg碳二亚胺和4mg N- 羟基琥珀酰亚胺，然后置于室温搅拌 2 小时，得D液。
4、将D液转移到透析袋中，用0.01mol/L，pH为7.4 的PBS缓冲液，在0-4℃下透析五天，每 12小时更换一次透析液；将透析后的溶液冻干，得到固体粉末即为拉莫三嗪-牛血清蛋白偶联物，将其置于-20℃保存，备用。
按照免疫流程进行免疫、并完成血清采集与竞争抑制情况进行检测。在经第一、二、三次采血检测后选择效价较高、抑制较好、符合实验要求的目标小鼠进行融合。本项目优选1只小鼠进行了融合。
利用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与优选小鼠的脾细胞进行细胞融合，融合后经培养、观察、检测及阴阳性对照试验，获得一批符合实验要求的杂交瘤细胞，并对其继续培养与选择。从后期筛选细胞株情况看，从以上待融合的小鼠中的C1458-4小鼠获得理想的细胞株及抗体。
C1458-4鼠融合后共获得15个阳性孔，30ng/ml检测抑制,2孔抑制近完全，其余显色低且基本无抑制。进行下一步筛选工作，通过二次克隆共获得2株单细胞株。
C1458-4小鼠融合后，经有限稀释法的一次、二次克隆及上清检测，共得到2株细胞株，具体效价对应数值以及每株细胞株对应鼠编号见表3。
对所获得的7株特异阳性细胞株分别进行小鼠腹水（抗体）制备，经腹水检测，结果均能达到实验要求，不同的细胞株产生的腹水效价等方面存在一定的差异。7株细胞株共获得22个腹水样品。
经过检测、筛选与验证，最后共得到符合要求阳性细胞株7株，腹水制备共30个腹水，经抗体（腹水）检测后，大部分能够满足实验要求，只是不同的细胞株产生的腹水的效价等方面存在一定的差异。
羊抗鼠抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
拉莫三嗪半抗原的制备方法：
称取盐酸拉莫三嗪0.2mmol，置于25mL单口瓶中，加入DMF5mL，搅拌溶解；加入无水碳酸钾固体69mg(0.5mmol)，混匀；10min后，加入4-溴丁酸乙酯32μL，加干燥管隔绝外界水汽，控温55～60℃，搅拌反应6h，TLC法跟踪反应进程。反应完毕后，冷却至室温，加入冰水20mL搅拌均匀，用乙酸乙酯10mL萃取3次，合并有机相；用饱和食盐水20mL、水20mL各洗涤1次，收集有机相。无水硫酸钠干燥2h，过滤，减压回收溶剂，得浅黄色油状物80mg。
将上述浅黄色油状物溶于3mL无水乙醇中，加入饱和氢氧化锂溶液，室温搅拌反应3h。反应完毕，加入冰水30mL，搅拌均匀，用1mol/L 盐酸调pH6～6.5，用三氯甲烷10mL萃取3次，合并有机相，经洗涤，干燥，减压回收溶剂得拉莫三嗪半抗原62mg。半抗原的结构经气相色谱-质谱联用(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)仪确证。
拉莫三嗪半抗原-卵清蛋白偶联物的制备方法：
将400mg卵清蛋白溶于50m l pH值为8.0的PBS缓冲液中，得到卵清蛋白溶液，然后加入8mmol的拉莫三嗪半抗原，并立即边搅拌边滴加体积分数为40%的甲醛溶液，甲醛滴加过量，用1M的NaOH调节pH 值在8.0左右，有白色絮状物质出现，继续搅拌2小时。将反应液过滤得到澄清的滤液，滤液封口放入4℃冰箱过夜。
透析袋煮沸1小时, 将滤液倒入透析袋中, 置于蒸馏水中透析6天, 每天换1次蒸馏水。透析产物经冷冻、抽干得到白色絮状的拉莫三嗪半抗原-卵清蛋白偶联物。偶联物放入4℃冰箱保存。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：包括：
样品垫的制备：将玻璃纤维或聚酯纤维用样品垫处理液浸泡，然后取出脱水，接着将样品垫放入干燥箱内，烘干至湿度为19~21%得到样品垫；
金标垫的制备：将玻璃纤维或聚酯纤维用金标垫处理液浸泡，然后取出脱水，接着将金标垫放入干燥箱内，烘干至湿度为19~21%，再在相对湿度为20-40％，室温条件下，用BIODOT仪器的AIRJET喷头将拉莫三嗪单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在所述金标垫上，喷点参数为4~6ul/cm2；然后置于37℃条件下干燥, 至湿度为19~21%；
反应膜的制备：用磷酸缓冲液将拉莫三嗪半抗原-卵清蛋白偶联物稀释，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线C，将包被好的反应膜置于37 ℃条件下干燥2 h；
将样品垫、金标垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC背板上；金标垫从起始端有一定区域被样品垫覆盖，金标垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品垫的始端与PVC背板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC背板的末端对齐；所述反应膜的检测线和质控线均呈与所述试纸条的长度相垂直的条状带；检测线位于金标垫的末端的一侧；质控线位于远离金标垫的末端的一侧；
拉莫三嗪半抗原的制备方法：
称取盐酸拉莫三嗪0.2mmol，置于25mL单口瓶中，加入DMF5mL，搅拌溶解；加入无水碳酸钾固体69mg，混匀；10min后，加入4-溴丁酸乙酯32μL，加干燥管隔绝外界水汽，控温55～60℃，搅拌反应6h，TLC法跟踪反应进程；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水20mL搅拌均匀，用乙酸乙酯10mL萃取3次，合并有机相；用饱和食盐水20mL、水20mL各洗涤1次，收集有机相；无水硫酸钠干燥2h，过滤，减压回收溶剂，得浅黄色油状物80mg；
将上述浅黄色油状物溶于3mL无水乙醇中，加入饱和氢氧化锂溶液，室温搅拌反应3h；反应完毕，加入冰水30mL，搅拌均匀，用1mol/L 盐酸调pH6～6.5，用三氯甲烷10mL萃取3次，合并有机相，经洗涤，干燥，减压回收溶剂得拉莫三嗪半抗原62mg；
拉莫三嗪半抗原-卵清蛋白偶联物的制备方法：
将400mg卵清蛋白溶于50ml pH值为8.0的PBS缓冲液中，得到卵清蛋白溶液，然后加入8mmol的拉莫三嗪半抗原，并立即边搅拌边滴加体积分数为40%的甲醛溶液，甲醛滴加过量，用1M的NaOH调节pH 值在8.0，有白色絮状物质出现，继续搅拌2小时；将反应液过滤得到澄清的滤液，滤液封口放入4℃冰箱过夜。
2.根据权利要求1所述的拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：所述样品垫处理液由质量分数为0.4~0.7%的牛血清蛋白溶液和pH值为7 .2的0 .1mol/L的磷酸盐缓冲液混合后构成。
3.根据权利要求1所述的拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：所述金标垫处理液由质量分数为0.4~0.7%的牛血清蛋白溶液和pH值为7 .2的0 .1mol/L的磷酸盐缓冲液混合后构成。
4.根据权利要求1所述的拉莫三嗪胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：所述拉莫三嗪单克隆抗体-胶体金标记物的制备方法包括：取1ml胶体金溶液于试管中，加入0.2M的K2CO3溶液1.5-3.0μl，搅拌均匀后得到胶体金溶液，然后向胶体金溶液中加入20-50μg拉莫三嗪单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置，加入质量分数为10%的牛血清蛋白溶液，混匀后静置10 min，然后在4℃条件下，以12000r/min离心5分钟，沉淀用复溶缓冲液洗涤，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬。
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