CN101776689A - 检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法，属于兽药残留的免疫化学速测技术领域。本发明的试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，其特征在于，在PVC背衬上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系所分泌得到的。所述的硝酸纤维素膜上分别包被有洛克沙砷-载体蛋白偶联物构成的检测线和兔抗鼠IgG构成的质控线。本发明的试纸条有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速、准确等显著优点。

Description

检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体地说，是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用于快速检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

近年来，洛克沙砷因为具有刺激动物生长、抗寄生虫和较广的抗菌谱药理特性，被作为一种饲料饲料添加剂广泛应用于畜牧养殖业。

虽然洛克沙砷的毒性较低，但大剂量作用时，仍然会导致中毒，如引起维生素B1缺乏症、肌肉震颤、共济失调甚至死亡。另外还会对环境造成很大的污染，畜禽日粮中如果大量使用有机砷类制剂，其含砷的畜禽排泄物进入环境，使土壤、空气、水体遭受严重污染。为此，我国食品卫生及饲料卫生标准均对各种食品和饲料原料、产品中的洛克沙砷含量作了严格规定。如规定鸡蛋中的阿散酸(ASA)允许残留限量为0.5mg/kg。另外日本肯定列表也规定了各种禽肉产品中的洛克沙砷和硝苯砷酸的允许残留量为0.5mg/kg和2mg/kg。因此，对饲料中有机砷添加量进行控制具有重要意义。

目前检测洛克沙砷残留的方法主要为色谱分析法，如高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。色谱技术对洛克沙砷检测是非常有效、准确的，但也存在如下缺点：(1)待测样品预处理程序繁琐费时；(2)需要经过专业培训的技术人员操作，操作人员要有丰富的相关经验，操作人员必须了解影响色谱分析的各种干扰因素，了解所使用方法的优缺点，才能获得可靠的分析结果；(3)需要昂贵的仪器设备辅助，难以在中小企业中普及；(4)仪器保养的要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；(5)检测费用高。

酶联免疫吸附法是以竞争性酶联反应为检测原理，以洛克沙砷抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶结合物同时加入酶标板，反应后通过显色测OD值来判定结果。存在的缺点是：(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，不利于在基层单位进行推广使用；(2)检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长，全程需要2-4h。

胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay GICA)是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方法，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。

发明内容

本发明的目的主要是在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单、检测快速、准确的专门用于检测洛克沙砷的试纸条及其制备方法。

本发明的总体技术路线图见图1所示。

本发明是这样实现的：

为了实现本发明，申请人制备了一种能分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体杂交瘤细胞系。

一种适用于检测洛克沙砷残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有洛克沙砷-载体蛋白偶联物构成检测线(5)和兔抗鼠IgG构成质控线(6)。

一种适用于检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括：

1)将洛克沙砷与载体蛋白偶联，形成洛克沙砷-载体蛋白偶联物；

2)用洛克沙砷-载体蛋白偶联物(人血清白蛋白)免疫小鼠，分离脾细胞，体外进行细胞融合，筛选后得到分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体的细胞系；

3)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

5)将步骤2)制备的抗洛克沙砷单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；

7)将洛克沙砷-载体蛋白偶联物(卵清蛋白)包被在硝酸纤维素膜(3)上构成检测线(5)；并将制备的兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)；

8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条。

本发明选用洛克沙砷-载体蛋白偶联物作为检测线，抗洛克沙砷特异性单克隆抗体为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有洛克沙砷。通过待测样品中的洛克沙砷与包被于硝酸纤维素膜上的洛克沙砷-载体蛋白偶联物共同竞争抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物，在检测线上出现颜色深浅不同的红色条带或不出现条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中洛克沙砷的浓度在100ppb-500ppb范围内；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带也判为阳性样品，即待测样品中洛克沙砷的浓度高于500ppb；若待测样品试纸条检测线颜色等于或深于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判为阴性样品，即洛克沙砷的浓度小于100ppb；如果质控线上没有红色条带出现，即该试纸条无效。

本检测试纸条(结构图如图2所示)由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按顺序依次粘附在PVC背衬(7)上组装而成的。结合垫上包被有本发明制备的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有检测线(5)和质控线(6)，其中检测线为本发明制备的洛克沙砷-载体蛋白(卵清蛋白)偶联物，质控线为本发明制备的兔抗鼠IgG。所述的样品垫、结合垫(均购自上海金标公司)、硝酸纤维素膜(购自S&S公司)、吸水垫(购自Whatman公司)、PVC背衬(购自上海金标公司)，所述的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒购自Sigma公司。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1、本发明的检测洛克沙砷的免疫胶体金试纸条具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(8分钟)等优点。

2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。

3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。

4、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，室温下可保存6个月，4-8℃保存，有效期12个月。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图

图2：本发明检测试纸条的组装示意图

图3：本发明检测试纸条结果判定示意图

图中：A：为阴性标准品结果，B：为阴性样品结果，C：为阳性样品结果，D、E：为试纸条失效。

具体实施方式

实施例1(制备实施例)

检测洛克沙砷的免疫试纸条的制备方法

1、洛克沙砷-载体蛋白偶联物的制备

合成洛克沙砷-载体蛋白偶联物：

(1)合成ROX-HSA全抗原，具体步骤如下：首先取20mg ROX加到300μl二甲基甲酰胺溶液中，再缓慢加到1ml 0.5mol/LH₂SO₄中，然后在磁力搅拌下将1ml 1mol/L NaNO₂缓慢加到SMZ溶液中，反应10min，形成重氮盐。

(2)磁力搅拌下，分别取100mg HSA和100mg OVA各加到4ml磷酸缓冲液中。

(3)将上述形成的重氮化盐溶液在磁力搅拌下缓慢加到HSA溶液和OVA溶液中，用1MNaOH将pH维持在8-10，4℃反应1h。

(4)将反应液放在生理盐水中透析3d，每天更换2次生理盐水，以除去未反应的小分子物质及SMZ等。

(5)将SMZ-HSA和SMZ-OVA溶液分成两部分，一部分于4℃下保存供紫外和液相测试用，另一部分于-20℃下保存。

2、抗洛克沙砷单克隆抗体的制备：

(1)免疫：利用申请人所制备的洛克沙砷-人血清白蛋白(HSA)偶联物免疫Balb/C小鼠(购自中国军事科学院实验动物中心)，免试程序是选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠4只，体重18-22g，取免疫抗原100mg(以蛋白含量计算)，加等体积完全弗氏佐剂乳化，用注射器在安培瓶中反复抽吸搅拌，直至乳化药液在水中呈不溶液滴(水包油状态)。于Balb/C小鼠颈背部皮下多点注射进行一免，每只小鼠0.5ml；间隔两周后，抗原量减半用弗氏不完全佐剂混合，方法同上，进行第二次免疫，再过两周后，进行第三次免疫，方法同前次。三免后10d免疫鼠尾静脉采血，通过间接ELISA方法测定免疫鼠血清抗体效价。选择抗体效价较高者用于细胞融合，融合前二天给小鼠脾内注射含30μg免疫抗原水剂进行加强免疫。

(2)单抗制备：免疫鼠眼眶取血后，脊椎脱臼处死，消毒后置于超净工作台上的消毒表面皿中，小心取出经免疫已肿大的脾脏，用DMEM培养基冲洗2次，每次3ml。经计数细胞共有5.6×10⁸个，在37℃水浴中，将SP2/0细胞(购自GBICO公司)和脾细胞按10∶1比例混合于50ml离心管中，轻轻搅匀，1000rpm离心5min，弃上清，弹击管底使细胞混匀成糊状。将离心管置于37℃水浴中，吸管吸取37℃预热的0.8ml 50％PEG1500(购自Sigma公司)，将吸管插入离心管的底部，左手慢慢旋管，右手边搅边加，1min内加完，将融合液缓缓吸入吸管中，保持0.5min，然后慢慢放出，1min内完全放出，并于离心管中静置1min。静置之后，立即沿管壁滴加5ml IDMEM不完全培养基(配方：DMEM(袋装)13.5g，青霉素钠(注射用)10万单位，硫酸链霉素(注射用)10万单位，NaHCO₃ 3.7g，用重蒸水稀释至1000ml，并用0.1mol/L NaOH或HCl调节pH为7.4)终止融合反应，边加边缓慢搅拌，前0.5min加入2ml，后0.5min加入3ml，然后在1min内加完5ml。补加IDMEM培养基至40ml，1000rpm离心5min，弃上清。吸管吸取1ml HAT(配方：20ml胎牛血清，1mlHAT，79ml DMEM配成100ml)选择培养基后，插入离心管底部，边轻轻搅拌边加入，使细胞悬浮，不能吹，然后补加HAT至40ml，并轻轻混匀细胞，每孔0.1ml加入已铺好饲养细胞的96孔板中，共铺4块板。

融合后隔日更换HAT培养液。融合3-4天后，可见有小量细胞克隆，在融合10天后，换用HT培养基(配方：20ml胎牛血清，1ml HT，80ml DMEM配成100ml)，大约在12-16天左右，杂交瘤细胞克隆生长至孔底1/4，采用间接ELISA检测培养液上清中的特异性抗体，统计有杂交瘤细胞生长和阳性杂交瘤细胞生长的孔数，计算融合率和阳性率。采用洛克沙砷-卵清蛋白作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗洛克沙砷的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法按每孔10、5、2个细胞的比例，将细胞放入预先铺好饲养细胞的培养板中培养。观察克隆化细胞数目及状态，并及时测定每孔上清液阳性，直至找到阳性的单克隆细胞株，最终筛选出分泌抗洛克沙砷的单克隆杂交瘤细胞系。

对该细胞系进行染色体计数，结果显示：SP2/0骨髓瘤细胞的染色体数为36对，Balb/C小鼠脾脏细胞的染色体数为20对，而该杂交瘤细胞染色体数目为96-102条之间，可见本试验所得的单克隆抗体细胞株的染色体数与两亲本细胞的染色体数之和相似，证明此细胞为两亲本细胞融合产物。将该细胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生产出单克隆抗体。采用购自Sigma公司的鼠单抗分型ImmunotypeTM试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG₁亚类。

3、抗洛克沙砷单克隆抗体的纯化

具体步骤如下：4ml 0.06mol/L pH4.8的Hac-NaAc缓冲液分为两部分，大部分与1ml腹水混合，并轻轻搅拌均匀；另有少量的HAc-Aac缓冲液与辛酸(共需辛酸33μL)混合成乳浊液。将辛酸乳浊液慢慢滴加入腹水溶液中，边加边轻轻搅拌，加完后持续搅拌30min，此时有大量的白色沉淀。室温下12000rpm离心30min，留上清液弃掉沉淀，滴加4℃等体积pH7.4的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，用1.0mol/L NaOH溶液调pH为7.4，溶液析出大量沉淀，溶液4℃静置2h后，4℃12000rpm离心30min。去上清，将沉淀溶解于0.01mol/L pH7.4PBS中，对PBS透析除盐4次，最后抗体溶液中滴加0.02％NaN₃，分装置于-20℃保存。测定蛋白浓度为7.45mg/ml。用MbaTrap^TMG亲和层析柱纯化抗体，腹水经平衡缓冲液(PB，0.02mol/L，pH7.0)适当稀释后，上样用于平衡缓冲液平衡好的MbaTarP^TMG亲和柱，用平衡缓冲液彻底洗去杂蛋白后，换洗脱液(Gly-HCI，0.01mol/L，pH2.7)将抗体洗下，洗下的抗体立即用中和缓冲液(Tris-HCI，1mol/L，PH9.0)中和，使pH恢复至7.0左右，以免失去活性。

4、兔抗鼠IgG抗体的制备

利用申请人所在的实验室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制备高特异性、高效价的兔抗鼠IgG高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行提纯。利用该抗体作为质控线制作的生物材料。

5、抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备(柠檬酸三钠法)：

取新制去离子水稀释成的0.01％氯金酸水溶100ml置于锥形瓶中，放于微波炉内加热至沸腾，准确吸取2.5mL1％的柠檬酸三钠水溶液并迅速加入锥形瓶中，摇晃均匀后，立即放入微波炉中以中档火力继续加热3min，至溶液成酒红色后取出，冷却至室温后补足失水，4℃密封保存。按同样操作制备三次。

(2)抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物的制备：

取20mL新制胶体金，用0.1M K₂CO₃调节胶体金溶液pH至8.2左右。将胶体金溶液3500rpm离心15分钟，弃沉淀。在磁力搅拌情况下，向胶体金溶液中逐滴加入1mL含100μg抗体蛋白的0.01M pH7.4的PB缓冲液(配方：Na₂HPO₄·12H₂O 1.4507g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.1482g，用三蒸水配成500ml)。逐滴加入一定体积的10％PEG20000至终浓度为1％，持续搅拌10min，4℃静置12小时。采用低温超速离心法纯化，除去金标抗体混合液中未标记的抗体和未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。步骤如下：将金标抗体溶液4℃3500rpm离心20min，弃去离心管底凝聚的金颗粒。取上层溶液4℃12000rpm离心60min。吸出上清。4℃11000rpm离心45min，沉淀用金标抗体稀释液(配方：0.005gPEG20000，0.01gBSA，用0.01M pH7.4的PB缓冲液定溶至100ml)稀释至原体积。重复离心1次。最后将沉淀用上述稀释液混悬为原体积的1/20，4℃保存备用。

6、硝酸纤维素膜的包被

用0.01M pH7.4的PB缓冲液将洛克沙砷-卵清蛋白(OVA)偶联物稀释到0.2mg/ml，用BioDot点膜仪将其包被在硝酸纤维素膜上作检测线，包被量为0.5μl/cm，检测线靠近结合垫端，距结合垫垫端约6mm，用0.01M pH7.4的磷酸缓冲液将兔抗鼠IgG抗体稀释到0.4mg/ml，将其包被在硝酸纤维素膜上作质控线，包被量为0.5μl/cm，质控线靠近吸水垫，距吸水垫约7mm，两线距离约5-7mm，37℃烘干，封装备用。

7、试纸条的组装

将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按图2所述顺序依次粘附在PVC背衬(7)上，切成3mm宽小条，于干燥小桶中保存。常温保存，有效期6个月，4-8℃保存，有效期一年。

实施例2(应用实施例)

检测洛克沙砷的免疫胶体金试纸条的使用方法

1、样品的预处理

(1)猪尿的预处理

将供试尿液2ml，2000rpm离心10min，取上清液供检测备用。

(2)牛奶样品的预处理

牛奶样品经3500rpm离心10min，取3ml加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min，室温3000rpm离心10min，取2ml上层液体蒸干或在氮气流中吹干，用1ml 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。

(3)组织样品的预处理

将待检组织样品匀浆，取3g待检组织样品加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min，室温3000rpm离心10min，取2ml上层液体蒸干或在氮气流中吹干，用1ml 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。

(4)鸡蛋样品的预处理

吸取3ml蛋黄加入6ml乙酸乙酯上下振荡10min，室温3000rpm离心10min，取2ml上层液体蒸干或在氮气流中吹干，用1ml 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。

2、检测

阴性标准品(0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液，配方同上。)及待检样品各取200μl加入微孔板中，将胶体金试纸条插入待检样品中，15分钟后观察结果。

3、结果判定

如图3所示，若待检样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线出现红色条带则判定为阳性样品，即待测样品中洛克沙砷的浓度在100ppb-500ppb范围内；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线出现红色条带也判断为阳性样品，即待测样品中洛克沙砷的浓度高于500ppb；若待测样品试纸条检测线颜色等于或深于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线出现红色条带则判断为阴性样品，即洛克沙砷的浓度小于100ppb；若质控线上无红色条带出现，则该试纸条无效。

实施例3(应用实施例)

检测洛克沙砷的免疫胶体金试纸条的应用

1、特异性试验

将洛克沙砷、硝苯胂酸、阿散酸配制成浓度为600ppb的样品。按实施例2所述方法进行试验。试验结果(见表1)表明，洛克沙砷样品检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带，而硝苯胂酸、阿散酸样品试纸条检测线颜色与标准品试纸条检测线颜色一致，同时质控线上出现红色条带，这表明硝苯胂酸、阿散酸与本发明的试纸条无交叉反应，显示本试纸条具有好的特异性。

表1本发明试纸条特异性试验结果

检测样品	洛克沙砷	胺苯胂酸	阿散酸
				检测结果	+	-	-

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2、敏感性试验

按实施例2所述方法，用本发明的检测试纸条分别检测0、100、200、400、500、600ppb的洛克沙砷标准品，重复10次。发现当标准品浓度在100ppb-500ppb范围内，肉眼很容易判定结果，当洛克沙砷标准品浓度高于500ppb时检测线无颜色出现。

3、样品中的洛克沙砷模拟检测试验

(1)猪尿中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向猪尿液中添加洛克沙砷标准品，使猪尿中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷猪尿样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500ppb洛克沙砷猪尿样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷猪尿样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，而500ppb洛克沙砷猪尿样品检测线无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测猪尿样品。

(2)牛奶中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向牛奶液中添加洛克沙砷标准品，使牛奶中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷牛奶样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500ppb洛克沙砷牛奶样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷牛奶样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，而500ppb洛克沙砷牛奶样品检测线无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测牛奶样品。

(3)鸡肉样品中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向鸡肉样品中添加洛克沙砷标准品，使鸡肉样品中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷鸡肉样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500ppb洛克沙砷鸡肉样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷鸡肉样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，而500ppb洛克沙砷鸡肉样品检测无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测鸡肉样品。

(4)鸡肝脏样品中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向鸡肝脏样品中添加洛克沙砷标准品，使鸡肝脏样品中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷鸡肝脏样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500ppb洛克沙砷鸡肝脏样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷鸡肝脏样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，500ppb洛克沙砷鸡肝脏样品检测线无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测鸡肝脏样品。

(5)猪肉样品中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向猪肉样品中添加洛克沙砷标准品，使猪尿中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷猪肉样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500ppb洛克沙砷猪肉样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷猪肉样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，而500ppb洛克沙砷猪肉样品检测线无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测猪肉样品。

(6)猪肝脏样品中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向猪肝脏样品中添加洛克沙砷标准品，使猪肝脏样品中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷猪肝脏样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500洛克沙砷猪肝脏样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷猪肝脏样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，而500ppb洛克沙砷猪肝脏样品检测线无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测猪肝脏样品。

(7)鸡蛋样品中洛克沙砷的模拟检测试验

分别向鸡蛋样品中添加洛克沙砷标准品，使鸡蛋样品中洛克沙砷浓度分别为0ppb，500ppb，制成0ppb和500ppb洛克沙砷鸡蛋样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别对0ppb和500ppb洛克沙砷鸡蛋样品进行检测，重复10次，结果显示，0ppb洛克沙砷猪尿样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，判为阴性样品，而500ppb洛克沙砷鸡蛋样品检测线无色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测鸡蛋样品。

4、样品检测

在大连市的超市和农贸市场中采集鸡肝样品72份，用本发明检测试纸条进行检测，检出阳性样品3份，阳性检出率为4.17％，用HPLC法进行复核，含量分别为553ppb、587ppb、546ppb，大于500ppb，判为阳性，与试纸条检测结果一致。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种适用于检测洛克沙砷残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有洛克沙砷-载体蛋白偶联物构成的检测线(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。

2.权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的载体蛋白是卵清蛋白。

3.权利要求1所述的一种适用于检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括：

1)将洛克沙砷与载体蛋白偶联，形成洛克沙砷-载体蛋白偶联物；

2)用洛克沙砷-载体蛋白偶联物免疫小鼠，得到分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体的细胞系；

3)提取免疫小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

5)将步骤2)制备的抗洛克沙砷单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；

7)将洛克沙砷-载体蛋白偶联物包被在硝酸纤维素膜(3)上构成的检测线(5)；并将制备得的兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成的质控线(6)；

8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条。

4.权利要求所述的试纸条在检测各种动物性食品中洛克沙砷残留的应用。

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