CN104178458B - 一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。本发明将单增李斯特菌特异性多肽完全抗原与等体积的弗氏佐剂（Freundadjuvant，Sigma）混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠。经过4次免疫后将免疫的小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株单克隆细胞株A号。此单克隆细胞株A号分泌的单克隆抗体，对不同的单增李斯特菌培养上清均有交叉反应，而对李斯特菌属内的非单增李斯特菌以及E.coli O157、沙门氏菌、空肠弯曲菌没有交叉反应，可以用于食品中单增李斯特菌的特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，具体涉及单克隆细胞株A号及其产生的单增李斯特菌单克隆抗体的应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。
背景技术
单增李斯特菌(L.monocytohenes)是一种广泛存在于环境中的革兰氏阳性菌，是国际上重要的人畜共患病原菌。单增李斯特菌是李斯特菌的一种，其它李斯特菌包括绵羊李斯特菌 (L.iuanuii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌 (L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、默氏李斯特菌 (L.murrayi)，但单增李斯特菌是唯一引起人类致病的李斯特菌。
单增李斯特菌的易感人群主要是儿童、老年人、孕妇和慢性病患者等免疫力较差人群，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都曾被证实是李斯特菌的感染源，而且该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品如乳制品中威胁人类健康的主要病原菌之一。因此很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特菌，并制定了相应的标准。
目前检测单增李斯特菌的方法主要有：平板培养法、免疫学方法和分子生物学方法。平板培养法是我国的国标方法，结果可靠，操作相对简单，但过程复杂，耗时很长。免疫学检测方法主要是基于抗原抗体特异性反应而实现对待检测物进行检测的，具有灵敏度高、操作简单、检测时间快、处理样品多的特点。分子生物学方法分子检测方法是基于脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的，目前的检测方法已具有快速、灵敏、特异性好、自动化程度高的特点。然而分子生物学方法依赖于检测仪器、对操作人员要求较高，因此检测成本相对较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以特异性检测单增李斯特菌而不对李斯特菌属内其它菌有交叉反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的技术方案，一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为单克隆细胞株A号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9301。
所述菌株的制备基本步骤为：
（1）免疫原的制备与鉴定：偶联剂SMCC先通过琥珀酰亚胺酯与载体蛋白的氨基相连，随后人工合成的N端修饰色氨酸（Cys）单增李斯特菌P60蛋白多肽peptide D (PepD：QQQTAPKAPTE）通过色氨酸的巯基与载体蛋白上马来酰亚胺基团反应，透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过电泳图鉴定；
（2）小鼠的免疫：单增李斯特菌特异性多肽完全抗原与等体积的弗氏佐剂（Freundadjuvant，Sigma），混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐剂，随后的3次加强免疫使用弗氏不完全佐剂；
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，通过有限稀释法对阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株：单克隆细胞株A号；
（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：抗体亚型的鉴定采用小鼠单克隆抗体亚型试剂盒方法。
所述菌株单克隆细胞株A号分泌产生的单增李斯特菌单克隆抗体，其由单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株A号所分泌产生。利用其能够特异性检测单增李斯特菌的特点，应用于单增李斯特菌分析检测。
本发明的有益效果：本发明获得的单增李斯特菌单克隆抗体细胞株A号可以特异性识别单增李斯特菌在培养上清中分泌的P60蛋白，而不对李斯特菌属内其它菌分泌的P60蛋白有交叉反应。也不对其它重要的食源性致病菌，如E.coli O157、沙门氏菌、空肠弯曲菌等有交叉反应。
生物材料样品保藏：上述小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株A号，已于2014年5月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9301。
附图说明
图1、多肽-SMCC-BSA免疫原的电泳表征图。1、BSA，2、BSA-SMCC（1︰40），3、BSA-SMCC-LM多肽（1︰40︰20），4、BSA-SMCC-LM多肽（1︰40︰40）。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将P60多肽peptide D完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA筛选细胞上清，最终得到了特异性识别单增李斯特菌培养上清P60蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株A号。
实施例1 单克隆细胞株A号的制备
1、完全抗原的合成：取1mg SMCC用DMF溶解，并加入到用偶联缓冲液（0.1M PB缓冲液，含0.15M NaCl）溶解的5mg BSA溶液中，室温反应2h后用超滤管(Millipore, cutoff3000)洗涤离心3次，用适量偶联缓冲液重悬活化后的BSA。称取3.75mg 多肽peptide D，用适量偶联缓冲液溶解后缓缓加入到活化后的BSA溶液中。室温搅拌反应2h后，4℃透析三天，-20℃分装保存。
2、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取peptide D完全抗原（1mg/mL）与等体积的弗氏佐剂（Freundadjuvant，Sigma）混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐剂，随后的3次加强免疫使用弗氏不完全佐剂，时间间隔均为21天。四免后10天采血，使用间接ELISA方法测定小鼠血清效价，选择效价最高的小鼠，在四免后15天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。
3、细胞融合：
在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照数量比1︰10 的比例混合，离心后用50% (w/v) PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。
4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第8天取细胞上清进行筛选。筛选用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得单克隆细胞株A号。
实施例2 单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射实施例1制备的1×106单克隆细胞株A号，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为 IgG1 型。
单克隆细胞株A号单克隆抗体的亚型鉴定如表1所示。
表1 单克隆细胞株A号的单克隆抗体的亚型鉴定
| IgG1 | 1.856 |
| IgG2a | 0.169 |
| IgG2b | 0.168 |
| IgG3 | 0.049 |
| IgM | 0.055 |
| IgA | 0.056 |
实施例3 单克隆抗体的应用
将单克隆细胞株A号通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于单增李斯特菌的检测，具体步骤如下：
（1）用0.01M碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.5μg/mL PepD-SPDP-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；
（2）用含0.01%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；
（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1，24.3，72.9μg/L的单增李斯特菌P60蛋白（重组蛋白，购于AdipoGen）标准溶液。将标准溶液以及单增李斯特菌培养液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL1︰16000稀释的单增李斯特菌单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；
（4）每孔加入100 μL 用含0.01% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；
（5）每孔加入100 μL TMB显色液，37℃显色15 min后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，450 nm测吸光值。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
单克隆细胞株A号的单克隆抗体的交叉反应如表2所示。
表2 单克隆细胞株A号的单克隆抗体的交叉反应
| IC50（ng/mL） | 交叉反应率（%） | |
| 单增李斯特菌P60 | 1 | 100.00 |
| 绵羊李斯特菌 | ND | ND |
| 英诺克李斯特菌 | ND | ND |
| 威尔斯李斯特菌 | ND | ND |
| E．coli O157 | ND | ND |
| 沙门氏菌 | ND | ND |
| 空肠弯曲菌 | ND | ND |
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
Claims (2)
1.一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为单克隆细胞株A号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9301。
2.权利要求1所述菌株单克隆细胞株A号分泌产生的单增李斯特菌单克隆抗体，其特征在于：其由单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株A号所分泌产生。
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