CN102618502B

CN102618502B - 分泌抗喹诺酮类药物单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN102618502B
Application number: CN 201210004198
Authority: CN
Inventors: 吴建祥
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102618502A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用与牛血清白蛋白偶联的环丙沙星（CIP）为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株1F1，其保藏号为CGMCCNo.5608。1F1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7以上，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。间接竞争ELISA分析表明，该株单抗与环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星等喹诺酮类药物有特异反应。利用1F1单抗开发了检测食品中喹诺酮类药物残留的ELISA方法及试剂盒和试纸条。

Description

分泌抗喹诺酮类药物单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)是一类人工合成的广谱、高效的抗菌药物。作为兽药和饲料添加剂而大量应用于动物,导致其残留在动物可食性产品中。这类残留物可直接对人体造成危害：引起软骨毒性、关节疼痛和肿胀、皮肤过敏反应、白细胞和血小板减少、嗜酸细胞增多、溶血、肝肾损伤等。更严重的是低浓度的残留药物可能会对FQs类药物敏感的致病菌产生耐药性,从而间接威胁人类健康。为此许多国家对喹喏酮类抗生素制定了严格的限量标准，我国该类抗生素的最高残留限量：达氟沙星在牛、羊、家禽肌肉中为200μg/kg、奶中为30μg/kg，二氟沙星在牛、羊、猪肌肉中为400μg/kg、家禽中为300μg/kg，恩诺沙星在牛、羊、猪、家禽肌肉中均为100μg/kg。

目前采用的检测手段主要有微生物抑制分析法、荧光分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱（GC）、薄层色谱和气质联用，液相色谱方法及质谱联用方法等。目前主要用GC或HPLC进行测定。这些方法虽然有较高的灵敏度，但需昂贵的实验仪器，操作复杂、费时费钱、不能高通量检测，故难以在基层普及应用。而用抗体为基础开发的免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条能有效克服这些不足。

目前国内外没有检测喹诺酮类药物残留的免疫试剂盒及试纸条，本发明专利应用竞争抑制ELISA原理，以喹诺酮类药物单克隆抗体为核心建立检测喹诺酮类药物残留的竞争ELISA方法，并组装成有自主知识产权、廉价、灵敏的喹诺酮类药物残留检测试剂盒，应用免疫胶体金的原理，以胶体金标记环丙沙星特异性单克隆抗体为核心研制喹诺酮类药物残留快速检测的高灵敏度的免疫试纸条。发明专利的单抗及其免疫学检测试剂盒和试纸条完全满足中国、欧盟、日本等地区对喹诺酮类药物残留的检测要求。喹诺酮残留的免疫学检测方法、免疫学试剂盒及免疫试纸条的国产化对保障我国食品安全及食品的出口创汇具有重要意义，可产生巨大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5608，它能分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体；

杂交瘤细胞株分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与喹诺酮类药物环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星和双氟沙星有特异性免疫反应。

抗喹诺酮类药物单克隆抗体在食品中该类抗生素残留检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条。

本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的抗喹诺酮类药物单克隆抗体特异性强、灵敏度高，能满足开发免疫学检测方法及试剂盒的要求；以该发明提供的单抗为核心建立的检测食品中喹诺酮类药物残留的竞争ELISA方法及免疫学试剂盒和试纸条能特异、准确、灵敏、简单、快速、高通量地检测食品中喹诺酮类药物的残留。

附图说明

图1是试纸条的特异性分析，每个样品的含量为100ppb；

图2是试纸条的组织样品检测灵敏度分析；

图3是试纸条的蜂蜜样品检测灵敏度分析；

图4是试纸条的原奶样品检测灵敏度分析。

具体实施方式分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞

分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞，于2011年11月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.5608，分类命名为：分泌抗氟喹诺酮类药物单抗杂交瘤细胞；

本发明提供的杂交瘤细胞株能分泌抗喹诺酮类药物单抗，且其特异性强、灵敏度高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测食品中喹诺酮类药物的高通量的免疫学竞争ELISA方法及其免疫学试剂盒和试纸条，从而对保障我国食品安全及食品的出口创汇具有重要意义。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

1.环丙沙星半抗原与载体蛋白的交联

1.环丙沙星（CIP）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联产物的制备方法:

a）将60mg环丙沙星和30mg EDC溶于2ml超纯水中。然后立即快速加入30mg/ml的BSA（或者OVA）水溶液1ml，搅拌反应12-18小时，合成CIP-BSA、CIP-OVA偶联产物。

b）CIP-BSA、CIP-OVA偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析2天；

c）透析后的CIP-BSA偶联产物、CIP-OVA偶联产物、CIP、BSA、OVA溶液进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度。

结果发现CIP-BSA偶联产物的紫外扫描图形与BSA、环丙沙星的扫描图形明显不同，CIP-OVA偶联产物的紫外扫描图形与OVA、环丙沙星的扫描图形明显不同，说明环丙沙星已与BSA、OVA偶联成功，偶联产物分装后于-20℃冰箱保存，用于抗体制备及检测食品中喹诺酮类药物残留的免疫学方法中的环丙沙星人工抗原。

分泌抗环丙沙星单抗杂交瘤细胞获得及其单抗制备

1）免疫动物

用CIP-BSA偶联物免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠：1mg/ml CIP-BSA偶联物0.5-0.7ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点加腹腔注射0.2-0.3ml/只，间隔3-4周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml/只，共进行5次加强免疫，末免用不加佐剂的加倍剂量抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

2）骨髓瘤细胞的制备

采用SP2/0为实验的骨髓瘤细胞，直接从细胞培养瓶中吹打悬浮的SP2/0，并计数细胞，活细胞数应高于95％为合格；一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3-6月应用8-氮-鸟嘌呤筛选一次，以防止细胞的突变。

3）免疫脾细胞的制备

免疫3天后，小白鼠眼球放血后拉颈处死，收集血清并离心，上清冻存，做阳性对照；将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒5分钟，取出固定于板上，在无菌条件下取脾；把脾放入5mL 1640液中，轻轻洗去脾上的红血球；用折弯后的巴氏管轻轻挤压脾，制成脾细胞悬液，用吸管将悬液移入无菌离心管中；并以400g离心3-5min（与此同时应开始制备骨髓细胞）；把沉淀用约10mL的新鲜培养液再悬浮；计数细胞，活细胞数高于80％为合格。

4）细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50%PEG（聚乙二醇，分子量为1500，Sigma）作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT筛选培养基（Sigma）悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。

5）杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞在培养箱中培养5天后，用HAT筛选培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-30%时，用环丙沙星偶联卵清蛋白（CIP-OVA）作为包被抗原进行间接ELISA方法筛选阳性孔，共获51多个对环丙沙星有反应的阳性孔，阳性率为5%。阳性孔进一步用间接竞争ELISA鉴定筛选，选择6个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆3-4次，获得1F1 1株能分泌抗环丙沙星的特异性抗体的杂交瘤细胞株。间接竞争ELISA分析发现该单抗的半数抑制率IC50及20%的抑制率IC20分别为3.65ng mL^-1、0.51ng mL^-1。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

6）细胞冻存

细胞冻存液所含血清的量为40%，冻存液中含8-10%的DMSO；细胞浓度为10⁷个/mL；细胞冻存管放入冻存盒后放入-80℃，几天后转入液氮中长期保存；含青霉素100U/mL，环丙沙星100μg/mL。

7）细胞复苏

从液氮罐中取出冻存管，立即放37℃水浴中速溶1min；400g离心3min，无菌操作打开冻存管，弃上清，细胞用HT培养基重新悬浮，取出细胞悬液，转入细胞培养瓶；培养箱中培养，2小时后吸掉培养上清，加入新的培养基培养。

8）单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000-5000rpm离心3-5min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。采用辛酸-硫酸铵法进行单克隆抗体免疫球蛋白的分离沉淀。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M pH 4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（33ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000-5000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用少量PBS溶解，透析并更换6次透析液，离心(5000rpm,20min)，上清即为纯化后的抗体，其浓度为4.35mg mL^-1，-70℃冷冻保存。

9）单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

采用美国Sigma公司的羊抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM标准抗血清，将纯化的腹水抗体作适当稀释后用琼脂双扩散法测定，24h后观察沉淀线，判断单抗的抗体类型及亚类。结果为，1F1的抗体类型及亚类均为IgG1，轻链为kappa链。腹水效价测定以间接ELISA方法测定，操作如下：CIP-OVA交联物10μg/ml浓度用0.05mol／L pH 9.6碳酸盐缓冲液包被ELISA板，每孔100ul，37℃孵育2h，PBST洗涤3次；用2.0％脱脂奶封闭，每孔200ul，37℃孵育0.5h后洗涤3次；倍比稀释的腹水作一抗，每孔100ul，37℃孵育1h后洗涤3次；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，每孔100ul，37℃孵育1h后洗涤3次，加入底物溶液，每孔100ul，37℃孵育15min，加入50ul 2mol/l硫酸终止反应，酶标仪测定OD450值。OD450值为大于阴性抗体的2.1倍时的抗体的最高稀释倍数即为其效价。1F1单抗的ELISA效价达到10^-7以上。

10）单抗的特异性

采用方阵滴定方法确定间接竞争ELISA抗原抗体最佳工作浓度，在优化的条件下，将环丙沙星标准品、双氢环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、青霉素G、磺胺嘧啶、氯霉素、蔗糖、葡萄糖做系列稀释，分别与单抗进行间接竞争ELISA。制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的浓度，以及上述几种物质50％抑制率的浓度，然后计算出各类抗生素的交叉反应率。交叉反应率CR计算方法为CR%＝环丙沙星IC₅₀/其它抗生素IC₅₀×100。

如表1所示，单抗与喹诺酮类药物有交叉反应，但与新霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、四环素的交叉反应率均小于0.01%,说明单抗具有很好的特异性，而且对于喹诺酮类药物，如：恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星等具有明显的抑制作用，因此，所确定的单抗不单可以检测环丙沙星，亦可检测上述的喹诺酮类药物。

表1.单抗的特异性分析

Antibiotics	IC50(ng mL^-1)	Cross-reactivity(%)
			环丙沙星	3.65	100.00
恩诺沙星	3.01	121.26
			氧氟沙星	4.15	87.95
达氟沙星	4.85	75.26
			诺氟沙星	3.75	97.33
依诺沙星	3.70	98.65
			麻保沙星	3.83	95.30
沙拉沙星	4.62	85.68
			双氟沙星	52.7	6.93
新霉素	＞50000	＜0.01
			庆大霉素	＞50000	＜0.01
卡那霉素	＞50000	＜0.01

磺胺嘧啶	＞50000	＜0.01
			青霉素G	＞50000	＜0.01
四环素	＞50000	＜0.01

3．检测喹诺酮类药物残留的间接竞争ELISA方法及其试剂盒

1）间接竞争ELISA的步骤：

CIP-OVA抗原的包被酶标板，4℃过夜；每孔加入系列浓度的环丙沙星标样和工作浓度的单抗各50μL，震荡1min后37℃下温育1h，每浓度3孔重复，设不加环丙沙星对照和溶剂空白对照；PBST洗涤4次后，再每孔加入工作浓度的酶标二抗100μL，37℃下温育1h；PBST洗涤4次；加入TMB底物溶液（100μL/well），37℃温育15min后加入2M硫酸终止液（50μL/well），用酶标仪测定各孔的OD450值。以抑制率与环丙沙星浓度的半对数绘制标准曲线。

2）间接竞争ELISA方法条件优化：

包被缓冲液的选择：

包被抗原过程中需要对利用缓冲溶液对抗原进行稀释,在本实验中分别用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液(CB)、0.1mol/L pH9.6PB、0.01mol/L pH7.4 PBS进行包被，其它操作步骤不变，用以考察不同包被缓冲液对包被效果的影响。包被液以0.05M CB作为抗原包被液时,所得的抑制率是最高的。因此本实验中选用0.05M CB用作包被液。

包被温度和时间的选择：

在一定温度和时间范围内，固定效果随时间的延长和温度的升高而增加。然而由于高温尤其是长时间高温易引起蛋白质变性，故时间太长、温度太高都不利于包被。本实验中，根据前几步筛选出来的条件，选择在4℃包被过夜(12h)，或37℃包被1h、2h、3h或43℃包被1h、2h、3h让固相表面充分吸附，经过正常操作后，最后测定OD_450nm值，以最终酶促反应较强且包被温度和时间较适宜的条件作为优先包被温度和时间。4℃包被过夜(12h)包被所得的抑制率是最高的，故该方法选择该包被温度和时间。

封闭物的选择：

已包被的固相与待测标本或酶结合物之间会发生非特异性吸附，降低检测的敏感性和特异性。可以通过以如下方式减少非特异性吸附：①在抗原包被完毕后，用明胶或其他惰性蛋白对固相载体进行封闭，以减少或避免在以后的反应过程中发生非特异性吸附作用。②可以通过在洗涤液中加入少量Tween-20，起保护蛋白，洗去非特异性吸附的抗体和结合不牢固的反应复合物的作用。③可以通过在反应液中加入其他杂蛋白或明胶以减少非特异性吸附。在本实验中，以0.01M PBS为对照，在0.01M PBS中加入2%牛奶、0.1%BSA、10%小牛血清(FCS)、0.1%OVA、1%明胶进行实验，测定其对减少非特异性吸附的影响。采用间接竞争ELISA法分析发现，在抗原抗体反应过程中，加入不同的杂蛋白或明胶，均能减少非特异性吸附，增加检测灵敏度，其中又以2%脱脂牛奶和0.1%BSA为好。本实验最终选择以0.1%BSA作为封闭物以减少非特异性吸附及增强灵敏度。

抗原、单抗、HRP酶标二抗工作浓度、灵敏度及线性的确定

用方阵试验法对包被抗原、单抗、HRP酶标二抗进行一系列浓度的稀释，确定间接竞争ELISA法包被抗原、单抗、HRP酶标二抗的最适工作浓度。阴性、阳性标品之间的OD₄₅₀值差距最大,且阴性OD₄₅₀值大于1.5的组合，即为抗原、抗体的最佳工作浓度。

检测灵敏度的确定：在优化的条件下，在预先包被好CIP-OVA抗原的酶标板上，每孔加入系列浓度的环丙沙星标样和工作浓度的单抗各50μL，震荡1min后37℃下温育1h，每浓度3孔重复，设不加环丙沙星对照和溶剂空白对照，PBST洗涤4次后，再每孔加入工作浓度的酶标二抗100μL，37℃下温育1h；PBST洗涤4次；加入TMB底物溶液（100μL/well），37℃温育15min，加入2M硫酸终止液（50μL/well），用酶标仪测定各孔的OD450值。以抑制率与环丙沙星浓度的半对数绘制标准曲线。在优化的ELISA分析条件下，对环丙沙星建立标准曲线，以考察其在最优化的反应体系中的检测灵敏度。以IC₂₀作为ELISA方法的检测灵敏度。

用方阵试验确定竞争ELISA方法的包被抗原、单抗、HRP标记的羊抗鼠IgG的工作浓度分别为0.001MG/ML、0.0005MG/ML、0.0005MG/ML。通过竞争ELISA试验比较发现间接竞争ELISA最佳孵育条件为抗原包被为4C过夜、单抗与样品及HRP标记的羊抗鼠IgG均为37℃1h、底物显色反应为37℃15min。在工作浓度下对不同的CIP标准溶液：0ppb，0.25ppb，0.5ppb，3.0ppb，9.0ppb，经过间接竞争ELISA检测，结果发现IC₂₀为0.25ppb，即建立的间接竞争ELISA方法的灵敏度是：0.25ppb。同时该方法在检测0.25-9.0ppb是具有良好的线性范围。

3）间接竞争ELISA的不同样本的检测分析

为了分析建立的间接竞争ELSA方法检测原奶、蜂蜜、组织样品中环丙沙星的正确性，分别对确认不含喹诺酮类药物的原奶、蜂蜜及组织做为阴性样本,对确认不含喹诺酮类药物的原奶、蜂蜜及组织样本进行添加不同浓度的环丙沙星,作为添标阳性样本,对确认含有环丙沙星的样本作为真实样本,通过对这些样本的检测,以确定产品是否适合对于各种样本的检测,并确定样本检出限。

样本处理方法:

a.原奶的处理方法是：取100μL的原奶，用400μL PBST做稀释，待检。

b.蜂蜜的处理方法是：称取4g待检蜂蜜于15mL刻度离心管中；加入1mL0.01M PBS和1ML 0.1M NaOH溶液,振荡溶解蜂蜜（注：若不宜混匀，可于60℃～80℃的热水中温热数分钟，再振荡混匀）；再先后加入3mL乙酸乙酯和6mL二氯甲烷，上下翻转振荡约8分钟；静置至上层澄清，转移5mL上层澄清溶剂于5mL刻度离心管中；65℃氮（空）气吹干；加入400μL PBST缓冲液于5mL刻度冷冻管中，冲洗管内壁，充分溶解壁上残留，待检。

c.组织的处理方法:称取样本2g于5ml离心管；加入3ML乙酸乙酯,剧烈震荡5min，静置分层；移取上层液体1.5ml(参考离心管刻度)于5ml离心管中，65℃加热条件下用空(氮)气吹干；加入0.5mlPBST缓冲液于5ml离心管中，用刻度滴管润洗管内壁，待检。

阴性样本的检测:

取确认为阴性的原奶、蜂蜜、组织样本各50份,按上述样本处理方法进行处理后用建立的ELSA方法进行检测,结果发现:所有样本均为阴性结果.

添标样本的检测:

为了分析建立的ELSA方法检测原奶、蜂蜜和组织样品中环丙沙星的检出限，在确认为不含喹诺酮类药物残留的原奶，蜂蜜和组织样本中添加不同数量的环丙沙星进行间接竞争ELISA检测。

结果的判读方法为:标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即:样本百分吸光率=样本OD值/0ppb标品的OD值*100(如果计算结果大于等于100，判为阴性，如果小于等于85判为阳性，100-85之间为灰区，建议复查，或作为可疑样本对待)。

表2原奶，蜂蜜，组织中添加环丙沙星的检测结果(n=6)

样本	添标量（PPB)	检测结果
			原奶	0.25	6个全为阴性
原奶	0.5	5个阴性,1个可疑
			原奶	1.0	6个全为阳性
原奶	2.0	6个全为阳性
			蜂蜜	0.025	6个全为阴性
蜂蜜	0.05	2个阴性,4个可疑
			蜂蜜	0.1	6个全为阳性
蜂蜜	0.2	6个全为阳性
			组织	0.1	6个全为阴性
组织	0.2	4个阴性,2个可疑
			组织	0.4	6个全为阳性
组织	0.8	6个全为阳性

根据表2判读结果，发现对原奶、蜂蜜、组织样本添标后的检测限分别为:1ppb,0.1ppb,0.4ppb取经过确认为阳性的原奶、蜂蜜、组织样本进行检测，结果如表3。

表3阳性样本的检测结果(复孔取平均数)

样品	确定的数值(ng/ml)	ELISA检测结果(ng/ml)
			原奶1号	5.6	5.3
原奶2号	12.3	11.2
			蜂蜜1号	5.3	5.6
蜂蜜2号	8.9	9.3
			组织1号	10.2	9.8
组织2号	22.3	25.2

确定的ELISA法检测环丙沙星，150份阴性样本，经过检测，未见假阳性，原奶、蜂蜜、组织样本分别以:1PPB,0.1PPB,0.4PPB为检测限，未见假阳性和漏检情况。真阳性样本亦可被检出，以真阳性样本计算得确定的ELISA法的回收率为：91.06%-113.00%。

根据1F1单抗的特性及分析结果表明，以该抗体为核心的竞争ELISA方法对喹诺酮类药物中的恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星等具有明显的抑制作用，因此，所确定的ELISA法不单可以检测环丙沙星，亦可检测上述的喹诺酮类药物。

4）检测喹诺酮类药物间接竞争ELISA检测试剂盒的组装

根据建立的间接竞争ELISA方法组装喹诺酮类药物残留检测试剂盒，该试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物喹诺酮类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗环丙沙星抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物喹诺酮的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物喹诺酮的含量。试剂盒中的材料如下：96孔板酶标板1块；环丙沙星标准液6瓶；酶标记物11mL；抗环丙沙星抗体6mL；显色液A液B液各6mL；终止液6mL；浓缩洗涤液40mL；浓缩复溶液50mL，说明书一份。试剂盒灵敏度：0.25PPB，标准曲线在0.25PPB-9.00PPB范围之内具有良好的线性。试剂盒精密度：变异系数小于15%。试剂盒4℃存放，保质期为12个月。

4.检测喹诺酮类药物试纸条的制备

1）胶体金的制备及单抗的金标记：

胶体金颗粒制备：在100ml去离子水中加入1%柠檬酸三钠1ml，煮沸后迅速加入1%氯金酸1ml，继续煮沸15min，冷却后，4℃下保存备用。通常情况下，制备好的胶体金颗粒的大小平均为30nm。

单抗的金标记：

取已制备好的胶体金溶液100ml，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入单抗2mg，搅拌15min，再逐滴加入2.5ml 25mg/ml聚乙二醇20000（PEG 20000），搅拌20min。20000rpmin离心20min，弃上清液，加入10ml pH 7.4PBS缓冲液（含0.4mg/ml PEG）清洗2次。将沉淀用5ml含2%BSA的PBS缓冲液（pH 7.4）溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

2）试纸条的组装：

用点膜机把适当浓度的CIP-BSA抗原及羊抗鼠IgG喷在NC膜上，分别作为检测线（T）和控制线（C），在37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记抗环丙沙星单抗包被在胶体金结合垫上。将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫依次粘贴在底板上，从而组成一个连续的微滤体系。将贴好的板切割成4mm宽的条，装入模板中制成检测试纸条，避光、密闭、室温保存备用。

3）样品检测及结果判断：

滴加3滴（约100ul）于上述试纸条的加样孔中，加样后开始计时；结果应在3-5分钟内读取，其他时间判读无效；根据观察区的T、C线的颜色比对来确定结果，T线显色比C线深或者相等时，结果判定为阴性。当T线颜色显色比C线浅时，检测结果为阳性。

4）试纸条的特异性试验:

将新霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、氯霉素标准品稀释至1000ng/mL的终浓度，试纸条进行检测，检测结果发现当新霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、氯霉素的浓度是1000ng/mL时，该试纸条的检测结果仍是阴性，而100ng/mL环丙沙星浓度时T线完全消失。说明该环丙沙星试纸条对环丙沙星有特异性反应，而与新霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、青霉素G、氯霉素没有任何交叉反应，能很好地用于食品中环丙沙星残留的检测。

将恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星、双氟沙星配制为100ppb，用于检测试剂板时，结果全部显示为阳性结果。和环丙沙星交叉反应率相近的恩诺沙星，氧氟沙星等未见T线显色。和环丙沙星交叉反应率只有6.93%的双氟沙星可明显见到T线，但明显弱于C线，亦明显可判为阳性结果（图1）。

5）试纸条的稳定性试验：

用同一批次不同试纸条检测同一样品，及用不同批次检测试纸条测定同一样品，其质控线、检测线的显色时间及颜色深浅和最终结果判读基本相同。将相同批次的试纸条置于37℃、密闭保存3个月，每2周各检测阳性和阴性奶样各20份，根据37℃下一天相当于1周估算，本试纸条可以在室温下保存12个月。

6）试纸条的应用及灵敏度

为了分析建立的试纸条检测原奶、蜂蜜、组织样品中环丙沙星的正确性，分别对确认不含喹诺酮类药物的原奶、蜂蜜及组织做为阴性样本,对确认不含喹诺酮类药物的原奶、蜂蜜及组织样本进行添加不同浓度的环丙沙星作为添标阳性样本,对确认含有环丙沙星的样本作为真实样本,通过对这些样本的检测,以确定产品是否适合对于各种样本的检测,并确定样本检出限。

添标样本检测:抽取确认阴性的原奶、蜂蜜、组织样本各15份,分别按20ppb、5ppb、10ppb的量进行添加标准品。结果发现均为阳性结果。分别添标：10ppb、2.5ppb、5ppb的均为阴性结果（图2）。故试纸条检测原奶、蜂蜜、组织样本,分别以20ppb、5ppb、10ppb为检测限值，即灵敏度。

7）免疫胶体金快速检测试纸条使用说明书

本产品可快速检测蜂蜜（原蜜和浓缩蜜均可）和组织中的喹诺酮类药物残留，整个检测过程只需要30-40分钟，灵敏度分别为5μg/kg（ppb）和10μg/kg（ppb）。同时本产品可直接稀释原奶来检测原奶中的喹诺酮类药物残留，整个过程仅需5-10分钟，检测灵敏度为如下：部分氟喹诺酮类药物检出限（μg/kg）

药物名称	蜂蜜样本检出限	原奶样本检出限	组织样本检出限
				环丙沙星	5	20	10
诺氟沙星	5	20	10
				氧氟沙星	5	20	10
达氟沙星	8	25	15
				诺氟沙星	5	20	10
依诺沙星	5	20	10
				麻保沙星	5	20	10
沙拉沙星	6	20	10

产品组成:

试纸条（40份/盒）

提取液（4瓶/盒）

PBST缓冲液（1瓶/盒）

说明书（1份/盒）

配套器具:

滴管（40支/盒）;

5mL刻度冷冻管（40个/盒）;

15mL刻度冷冻管（40个/盒）;

样品处理:

1.蜂蜜的处理方法:称取4g待检蜂蜜于15mL刻度离心管中；加入1mL0.01M PBS和1ML0.1M NaOH溶液,振荡溶解蜂蜜（注：若不宜混匀，可于60℃～80℃的热水中温热数分钟，再振荡混匀）；再先后加入3mL乙酸乙酯和6mL二氯甲烷，上下翻转振荡约8分钟；静置至上层澄清，转移5mL上层澄清溶剂于5mL刻度离心管中；65℃氮（空）气吹干；加入150μL PBST缓冲液于5mL刻度离心管中，冲洗管内壁，充分溶解壁上残留，待检。

2.原奶的处理方法:取400μL PBST缓冲液加入洁净的1.5mL刻度离心管中；用滴管吸取3滴（约100μL）原奶加入刻度离心管中，混合均匀；吸取混合溶液待检。

3.组织的处理方法:称取样本2g于5ml离心管；加入3ML乙酸乙酯,剧烈震荡5min，静置分层；移取上层液体1ml(参考离心管刻度)于5ml离心管中，65℃加热条件下用空(氮)气吹干；加入0.3mlPBST缓冲液于5ml离心管中，用刻度滴管润洗管内壁，待检。

检测步骤：

测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温（20℃-30℃）。

从原包装袋中取出试剂板，水平放置于观察者正面，（打开后请立即使用）；用滴管吸取待检样品溶液，垂直滴加3滴（约100μL）于加样孔中，加样后开始计时；结果应在3～5分钟读取，其他时间判读无效。

读取结果时，试剂板应置于观察者正面，如上图右侧所示。

结果判断：

阴性（-）：T线显色（测试线，靠近加样孔一端）比C线（对照线）显色深或一样深，表明样品中氟喹诺酮类药物浓度低于产品检出限。

阳性（+）：T线显色比C线显色浅，或T线无显色，表明样品中氟喹诺酮类药物浓度高于产品检出限，T线显色相比C线越浅，表明样品中氟喹诺酮类药物浓度越高。

无效：未出现C线，可能操作不当或试纸条已失效。应再次阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

精密度：

同时使用本产品和环丙沙星酶联免疫检测试剂盒对199份样品包括150份阴性样本和45份添标及4份真阳性样本进行对比检测，判读结果100%准确。选取蜂蜜、原奶和组织阴性样本各一份，各重复做10份检测试剂板，结果均为阴性，把这三个样本分别添标：5PPB，20PB，10PPB，各重复做10份检测试剂板，结果均为阳性

贮存条件：4℃-30℃避光保存，切勿冷冻。

有效期：12个月。

Claims

1.一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC N o.5608，其特征在于能分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗喹诺酮类药物单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与喹诺酮类药物环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、沙拉沙星和双氟沙星有特异性免疫反应。

3.如权利要求2所述的抗喹诺酮类药物单克隆抗体在食品中该类抗生素残留检测上的应用，其特征在于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其试剂盒和试纸条。