CN105567645B - 一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2d4及其应用 - Google Patents

一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2d4及其应用 Download PDF

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Abstract

一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明单克隆细胞株2D4已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10872。本发明采用活化酯法将原药头孢喹肟与BSA偶联制备免疫原，头孢喹肟与OVA偶联制备包被原。经免疫后得到一株特异性抗头孢喹肟杂交瘤细胞株2D4。此细胞株分泌的单克隆抗体，仅特异性针对头孢喹肟，与其他头孢类抗生素头孢氨苄、头孢噻呋的交叉率分别为2.13%、6.31%，与其它头孢类抗菌素的交叉率均小于0.1%，因此具有很高的特异性。本发明获得的抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头孢类抗菌素的交叉反应率低，可以达到特异性检测头孢喹肟的目的。

Description

一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4及其 应用
技术领域
本发明涉及一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
头孢喹肟(CEF)，英文名称为Cefquinome，分子式为C23H24N6O5S2·H2SO4，分子量为626.69，化学名称为[[(6R,7R)-7-[[(2Z)-(2-氨基－4-噻唑基)(甲氧亚氨基)乙酰基]氨基]－2-羧基－8-氧-5-硫-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-3-基]甲基]-5,6,7,8-四氢喹啉硫酸盐一水合物，CAS登录号为84957-30-2。
头孢喹肟是目前唯一一个动物专用第四代头孢类抗生素，具有抗菌谱广，抗菌活性强的特点，适用于非肠道用药。头孢喹肟对β-内酰胺酶高度稳定，内在抗菌活性强于第三代头孢菌素头孢噻呋，与第三代头孢相比，四代头孢的血浆半衰期长且无肾毒性。头孢喹肟有很强的抗菌活性，其对金葡菌、链球菌、铜绿假单孢菌、肠细菌科(大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌、柠檬酸菌、粘质沙雷菌）都有极强的杀灭作用，对许多耐甲氧西林的葡萄球菌及肠杆菌也有良好的杀灭作用。主要应用于敏感菌引起的猪、牛的呼吸系统感染及奶牛乳房炎及母猪的无乳综合症的临床治疗，显示了其在兽医临床应用的广阔前景。
一般来说，头孢喹肟对各种动物的毒副作用较为轻微，大多数动物多可耐受，无需停药。少数动物可能出现过敏现象。对人体而言，长期食用头孢喹肟残留的动物性食品可引起细菌耐药性，造成人体微生物环境平衡紊乱和失调。由于头孢喹肟被广泛用于治疗牛乳腺炎和其它乳牛疾病，该药物在乳汁中的残留也会给乳制品的质量带来严重影响。欧盟颁布头孢喹肟最大残留限量在牛奶中最低，限量不得超过20μg/kg，所以有必要建立头孢喹肟的快速检测方法。
目前头孢喹肟的检测方法主要是仪器检测方法和免疫分析检测方法。仪器检测方法仪器成本高，操作复杂，需要专职人员操作，而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明在于提供一种对头孢喹肟具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对头孢喹肟具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立头孢喹肟酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。
本发明的技术方案，一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.10872。
抗头孢喹肟单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 10872的特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4分泌产生。
所述抗头孢喹肟单克隆抗体的应用：用于食品安全检测中头孢喹肟残留的分析检测。
本发明提供的特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4的制备基本步骤为：
（1）免疫原的制备与鉴定：头孢喹肟通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过SDS-PAGE凝胶电泳表征；
（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2D4；
（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
本发明的有益效果：本发明获得的抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头孢类抗菌素的交叉反应率低，可以达到特异性检测头孢喹肟的目的。本发明提供了一种新的制备针对特定头孢菌素特异性抗体的思路，得到很好的特异性单克隆抗体细胞株。
生物材料样品保藏：一株特异性抗头孢喹肟单克隆细胞株2D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏编号为CGMCC No.10872。
附图说明
图1是免疫原的SDS凝胶电泳表征示意图。1、BSA，2、CEF-EDC-BSA (CEF︰BSA 摩尔比=120︰1)，3、CEF-EDC- BSA (CEF︰BSA摩尔比=100︰1)，4、CEF-EDC- BSA (CEF︰BSA摩尔比=80︰1)。
图2是2D4抗头孢喹肟单克隆抗体对头孢喹肟CEF的标准曲线图。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将头孢喹肟完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对头孢喹肟有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4。
实施例1：杂交瘤细胞株2D4的制备
（1）完全抗原的合成：取4.8mgCEF，加入2.5mg EDC和2.0mg NHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化4 h；另取5 mg BSA溶解于2mL，0.05 M、pH9.6的CB溶液中，将上述活化后的头孢喹肟溶液慢速逐滴加入BSA的CB溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，得免疫原，-20℃分装保存。
（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取头孢喹肟完全抗原（1 mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。
（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（ⅰ）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（ⅱ）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（ⅲ）将脾细胞和SP2/0细胞按照5~10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含体积百分比为20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 ℃、体积浓度为5% CO2的培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用体积百分比为含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用CEF、头孢氨苄（CEX）、头孢噻呋（EFT）和其它结构类似头孢菌素为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对CEF有较好抑制且对其它结构类似头孢菌素抑制不好的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株2D4。
实施例2 单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞2D4，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定单克隆抗体的亚型，具体结果如表1所示，抗体亚型为IgG2b。
表1
使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对CEF、CEX和EFT的IC50分别为1.2ng/mL，56.34ng/mL和19.02ng/mL，交叉反应率均小于10%。可用于头孢喹肟的特异性快速检测。
杂交瘤细胞株2D4单克隆抗体对CEF、CEX、EFT和其它头孢菌素的IC50和交叉反应率如表2所示。特异性抗头孢喹肟单克隆抗体对CEF的标准曲线如图2所示。
表2
实施例3 抗体应用
将杂交瘤细胞株2D4通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于头孢喹肟的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
a、用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.5μg/mL CEF-EDC-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；
b、用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3min，拍干；
c、用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL的头孢喹肟标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰16000稀释的抗头孢喹肟单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
d、每孔加入100μL 用含0.1%明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
e、每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL、2M H2SO4终止液，450nm测吸光值；
f、添加回收及样品前处理：秤取1g奶粉样品至于15mL聚四氟乙烯离心管中，分别添加150ng、300ng及600ng CEF。加提取液（1000mL 0.2M磷酸氢二钠和625mL 0.1M柠檬酸混合）10mL。5000r/min离心10min，取上清3mL加1M NaOH 330μL调pH至7左右待测。用样品稀释液（0.01M PBS）稀释5倍后，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为112.71%，96.74%，88%。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4，3.62 g Na2HPO4·12H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% Tween 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10872。
2.抗头孢喹肟单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.10872的特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2D4分泌产生。
3.权利要求2所述抗头孢喹肟单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中头孢喹肟残留的分析检测。
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