CN104535730A - 用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法 - Google Patents
用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，属药物残留检测技术领域。该试剂盒包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由头孢氨苄单克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的；所述头孢噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201341杂交瘤细胞4D5所分泌的，所述芯片固定了头孢氨苄包被原和头孢噻呋包被原。本发明还公开了一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片方法，该方法可以同时检测8种头孢类药物，具有准确度高，精密度好、效率高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片和药物残留检测技术领域，尤其涉及一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及检测方法。
背景技术
头孢类抗生素属于β-内酰胺类药物，具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐青霉素酶等优点。在畜牧养殖中常用于治疗败血症、脑膜炎心内膜炎等。不合理的使用造成这些药物在动物源性组织中蓄积。人食用这些动物源性食品后，出现过敏反应，甚至休克，对人类健康构成了严重威胁。大量药物的滥用，还会导致耐药菌株的产生，破坏生态环境。为了保证人类食品安全和生态环境的稳定，我国对这些药物规定了最高残留限量。如何检测这些药物在动物源性食品中的残留成了亟待解决的问题，特别是研发一种快速、灵敏、操作简单的兽药残留检测技术及产品是非常必要的。目前兽药残留检测方法存在不足，如仪器方法操作复杂，仪器化程度高且价格昂贵，微生物法灵敏度和特异性低，Elisa检测组分单一，胶体金技术只能定性检测。
蛋白质芯片技术是后基因组时代的产物，是研究基因功能和蛋白质的有力工具，近年来发展地相当迅速。蛋白质芯片是将大量蛋白质探针(抗原、抗体、受体等)或肽链有序排列固定在载体上，利用蛋白质探针或肽链特异性地与配体分子结合的原理，芯片上的蛋白质探针或肽链与样品中的相应成分反应，然后加入标记物质，最后用芯片扫描仪扫描并存储结果。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒。
该试剂盒包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由头孢氨苄单克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的，能识别头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定；所述头孢噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201341杂交瘤细胞4D5所分泌的，能识别头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟，所述芯片固定了头孢氨苄包被原和头孢噻呋包被原，所述头孢氨苄包被原是由头孢氨苄采用戊二醛法与卵清白蛋白偶联，所述头孢噻呋包被原是由头孢噻呋采用碳二亚胺法与卵清白蛋白偶联。
所述杂交瘤细胞3A6，申请人已于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201340。
所述杂交瘤细胞4D5，申请人已于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201341。
所述芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基片分成两排共12个反应区域，每个反应区域设四排三纵共12个微阵列(4×3阵列)，将头孢氨苄包被原溶液、头孢噻呋包被原溶液以及两种对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定0.5h，用2％(重量百分比)牛血清白蛋白溶液封闭0.5h。
所述头孢氨苄包被原溶液的浓度为6μg/mL，所述头孢噻呋包被原溶液的浓度为32μg/mL，所述头孢氨苄包被原溶液和头孢噻呋包被原溶液的溶剂是含有5％(重量百分比)甘油的pH值为9.16的碳酸盐缓冲液。
所述微阵列上的点样顺序是从上到下，从左至右。
所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取甲醇10mL，超纯水稀释，定容至100mL。
本发明的第二个目的是提供所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中头孢类抗生素残留的应用。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片方法，该方法包括以下步骤：
1)样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取；
2)将样品液和稀释好的抗体混合后加入到固定了头孢氨苄包被原溶液、头孢噻呋包被原溶液、以及对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液的芯片上，于37℃反应0.5h，洗涤3次，甩干。
3)将Cy3标记的二抗加到芯片，于37℃反应0.5h，洗涤3次，甩干；
4)用InnoScan 700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析。
所述抗体由头孢氨苄单克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的，能识别头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定；所述头孢噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201341杂交瘤细胞4D5所分泌的，能识别头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟；
所述头孢氨苄包被原是头孢氨苄与卵清白蛋白的偶联物，所述头孢噻呋包被原是头孢噻呋与卵清白蛋白的偶联物；
所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取甲醇10mL，超纯水稀释，定容至100mL。
所述抗体是用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释的，其中头孢氨苄单克隆抗体的稀释度为1:10000，头孢噻呋单克隆抗体的稀释度为1:12000；所述头孢氨苄包被原溶液的浓度为6μg/mL，所述头孢噻呋包被原溶液的浓度为32μg/mL，所述头孢氨苄包被原溶液和头孢噻呋包被原溶液的溶剂是含有5％甘油的pH 9.16的碳酸盐缓冲液。
本发明的有益效果是：
1)本发明的抗体芯片试剂盒可以同时检测8种头孢类药物——头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟，为食品中的头孢抗生素残留检测提供了一个快速、灵敏、高通量的方法。而现有的试剂盒无法同时检测以上药物。
2)本发明所建立的抗体芯片试剂盒和检测方法准确度高，精密度好、检测效率高。与现有的方法相比，不仅在检测药物的种类上具有明显的优势，而且可以节省大量的时间和成本，具有更好的市场应用价值。方法中所涉及的样品前处理方法简单，快速，所使用的有机溶剂为甲醇，对人体及环境危害较小。再者，本发明采用示踪物质是荧光物质，信号持续时间长。
附图说明
图1是本发明的技术路线图。
图2是基片优化的结果，图中1是不同基片相对荧光信号强度的比较；2是不同基片背景值的比较。
图3是4种点样顺序以及点样顺序的优化结果，图中1是点样效果示意，2、3、4、5是4种点样顺序，3是最优的点样顺序图。
图4是点样溶液和封闭液的优化结果，图中1是不同缓冲溶液作为点样液的优化结果；2是不同pH的CBS作为点样液的优化结果；3是添加不同表面活性的固定效果的比较；4是封闭液的优化结果。
图5是抗体稀释液和反应温度的优化结果，图中1是一抗稀释液的优化结果；2是二抗稀释液的优化结果；3是反应温的优化结果。
图6是制备抗体芯片过程中各时间的优化结果，图中1是固定时间的优化结果；2是封闭时间的优化结果；3是一抗反应时间的优化结果；4是二抗反应时间的优化结果。
图7是本发明采用的固相载体以及分区示意图，图中1：玻片；2：晶芯高分子基片G修饰物；3：12个分区围栏。
图8是绘制的标准曲线，图中CLX：头孢氨苄；CRO：头孢噻呋。
图9是抗体芯片37℃加速稳定性实验结果，图中CLX：头孢氨苄；CRO：头孢噻呋。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
实施例1抗头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定的单克隆抗体的制备
1.1免疫原的制备
准确称取头孢氨苄36.5mg，完全溶解在4mL的PBS中为A液。准确称取BSA 68mg，使其充分溶解在6mLPBS中为B液。另取碳二亚胺(EDC)120.0mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)60mg溶解在1mLPBS中为C液。冰浴，磁力搅拌下将C液逐滴加入到B液中，冰浴反应4h，然后将混合液逐滴加入A液中，冰浴反应12h。反应完成后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4～6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物头孢氨苄–BSA，置－20℃保存。
1.2包被原的制备
取OVA 120mg溶于8mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，为A液。头孢氨苄36.5mg溶于2mL PBS中，为B液。室温条件下，将A液和B液混合，然后缓缓加入0.1mL戊二醛(GA)溶液，室温反应6h。离心后取上清，4℃PBS中透析3d，每4～6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物头孢氨苄-OVA，置-20℃保存。
1.3单克隆抗体的制备
杂交瘤细胞的制备：参照杨汉春《动物免疫学》，以实施例1制备的免疫原头孢氨苄-牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序为：基础免疫用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下；以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×107个SP2/0与108个免疫脾细胞(1:10～1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min 5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。
融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2～3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。
待融合细胞集落长至培养孔1/10～1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。
经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经染色体计数，该杂交瘤细胞的染色体数目为103.6。申请人将其命名为杂交瘤细胞3A6，并于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201340。
腹水单抗制备与鉴定：将该细胞株3A6经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。ThermoScientific公司鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒的操作要求，对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。
实施例2抗头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟的单克隆抗体的制备
2.1免疫原的制备
取头孢噻呋50mg溶于二甲基甲酰胺(DMF)1mL中，为A液。称取HSA 66mg溶于PBS10mL中，为B液。分别N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)20mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)10mg加入A液，室温条件下反应24h，反应完成后离心除去沉淀，将上清缓慢滴入B液中，冰浴反应24h。反应完成后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4-6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物头孢噻呋–HSA，置-20℃保存。
2.2包被原的制备
取OVA 120mg溶于8mL碳酸盐缓冲液(CBS)中，为A液。头孢噻呋50mg溶于2mL CBS中，为B液。另取EDC 120.0mg和NHS 60mg溶解在1mLCBS中为C液。冰浴，磁力搅拌下将C液逐滴加入到B液中，冰浴反应4h，然后将混合液逐滴加入A液中，冰浴反应12h。反应完成后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4-6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物头孢噻呋–OVA，置-20℃保存。
2.3单克隆抗体的制备
杂交瘤细胞的制备：参照杨汉春《动物免疫学》，以实施例1制备的免疫原头孢噻呋-HSA偶联物免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序为：基础免疫用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下；以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1-2×107个SP2/0与108个免疫脾细胞(1:10-1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4-6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。
融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2-3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。
待融合细胞集落长至培养孔1/10-1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2-6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。
经过3-4次克隆，最终筛选出分泌抗头孢噻呋、头孢曲松等多个头孢菌素类抗生素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经染色体计数，该杂交瘤细胞的染色体数目为99.6。申请人将其命名为杂交瘤细胞4D5，并于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201341。
腹水单抗制备与鉴定：将该细胞株4D5经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。ThermoScientific公司鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒的操作要求，对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。
实施例3芯片参数的选择
1)基片的选择：分别在多聚赖氨酸玻片，正电荷玻片，晶芯高分子基片G、醛基基片、琼脂糖修饰玻片上点0.5μg/mL Cy3-OVA，用InnoScan 700A扫描仪扫描并储存数据，结果见附图2，从图2-1可以看到晶芯高分子基片G的相对荧光信号强度最高，表明晶芯高分子基片G对样品的吸附性最好。从图2-2可以看出其背景值低于醛基基片的背景值但显著高于其它三种基片的背景值。综合考虑吸附性和背景值两方面因素选择晶芯高分子基片G作为基片。
2)点样顺序的选择：分别按照以下四种方式：2为从右至左，从上向下；3为从左至右，从上向下；4为从左到右，从上向下，先点完第一排反应区域，再点第二排反应区域；5为从右到左，从上向下，先点完第一排反应区域，再点第二排反应区域，各点样方式的示意图见附图3，1为最终点样效果。结果显示，相对于其他方式，方式3的相对荧光信号值基本处于稳定状态，变异系数最小(7.96％)，说明该方式点出的点均一性较好，所以选用方式3作为最优的芯片点样方式。
3)点样稀释液的选择：选用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、pH9.6碳酸盐缓冲溶液(CBS)、pH7.4 Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)、含10％(重量百分比，下同)甘油的pH7.4 PBS(PBS+10％G)、含10％甘油的pH9.6 CBS(CBS+10％G)、含10％甘油的pH7.4 TBS(TBS+10％G)分别作为点样液配制10μg/mL头孢包被原溶液进行点样，以卵白蛋白(OVA)作为阴性对照，以Cy3标记的卵白蛋白(Cy3-OVA)作为阳性对照，制备芯片，结果见附图4-1，可以看出用CBS+10％G、CBS作为点样液的相对荧光信号强度明显高于其他点样液的，所以初步选用CBS为晶芯高分子基片G的点样溶液；对CBS的pH进行了优化，结果如附图4-2所示，可以显示随着CBS pH值的增大，荧光信号强度呈现降低趋势，说明用pH9.16的CBS作为点样液比较好；考察了不同表面活性剂45％甘油(glycerine)、0.0025％酪蛋白(Casein)、0.5％海藻糖(Trehalose)、1.5％甘露醇(Mannitol)、0.01％曲拉通X-100(triton X-100)、0.05％吐温-20(tween-20)对固定效果的影响，OVA作为阴性对照，Cy3-OVA作为阳性对照，结果见附图4-3，可以看出用含0.5％Trehalose、不加表面活性剂和含1.5％Mannitol的相对荧光信号强度基本差不多，都比其他的高，所以选用pH9.16 CBS作为点样液，同时考虑到低浓度甘油(5-10％)可以减少样品点的挥发，稳定点形，所以选用含5％甘油的pH9.16 CBS作为点样液。
4)固定时间的选择：分别将固定时间设置为0.5、1、2、4、6h，根据相对荧光信号强度筛出合适的固定时间，结果见附图6-1，可以看出随着固定时间的延长，相对荧光信号强度急剧下降，所以选用0.5h作为固定时间。
5)封闭液的选择：选用2％(重量百分比，下同)卵清蛋白(OVA)、2％牛血清白蛋白(BSA)、25％胎牛血清(FCS)分别作为封闭液进行筛选，结果见附图4-4，可以看出2％BSA为封闭液时相对荧光信号强度高于其他两个，所以选用2％BSA为封闭液。
6)封闭时间的选择：分别将封闭时间设置为0.5、1、1.5、2h，根据相对荧光信号强度筛选出一个在较短时间内达到需要的信号强度的封闭时间。结果见附图6-2，可以看出随着封闭时间的延长，其相对荧光信号强度逐渐下降，所以选用0.5h作为封闭时间。
7)抗体稀释液的选择：用pH7.4 PBS，pH7.4 TBS，pH9.6 CBS三种常用缓冲溶液分别作为一抗和二抗稀释液，结果见附图5-1和2，可知pH7.4 PBS作为抗体稀释液时的相对荧光信号强度最高，说明在pH7.4 PBS的环境下抗原抗体反应较好，所以最终选pH7.4 PBS作为抗体稀释液。
8)反应温度的选择：分别在4、25、37℃下进行抗原抗体反应，结果见附图5-3，可以明显看出在37℃抗原抗体反应才能进行得较彻底，所以选取37℃作为反应温度。
9)反应时间的选择：分别将抗原抗体反应时间设置为0.5、1、1.5、2、3h，根据相对荧光信号强度筛出合适的反应时间。附图6-3是一抗反应时间测优化结果，可知一抗反应时间为1.5h时其信号强度较高，说明抗原抗体反应在1.5h时达到最佳状态，考虑到芯片作为一种快速检测方法，选用0.5h作为一抗反应时间，并将通过点样浓度和抗体稀释度优化相对荧光信号强度。附图6-4是二抗反应时间测优化结果，可以看出相对荧光信号强度大致随着二抗反应时间的延长而增强，但是增强地不是很明显，所以选0.5h作为二抗反应时间。
实施例4抗体芯片的制备
1)考核所用的两种头孢类包被原和单克隆抗体
按ELSlA操作流程测定抗体的效价，将包被原用碳酸盐缓冲液稀释成一系列工作浓度，4℃包被过夜。甩出包被液，每孔加250μL洗涤液，静置30秒后，甩出洗涤液，拍干，重复洗涤3次，拍干。每孔加250μL封闭液，置37℃湿盒封闭1h。甩出封闭液后洗涤3次，拍干。将抗体稀释成1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，每孔加入50μL PBS，50μL稀释一系列浓度的抗体，37℃湿盒孵育30min。甩出孔内液体后洗涤3次，拍干。将HRP标记羊抗鼠二抗用缓冲液稀释成工作浓度1:5000，100μL/孔，37℃湿盒孵育30min。甩出孔内液体后洗涤3次，拍干。加底物液100μL/孔，37℃湿盒孵育15min。每孔加50μL终止液，用酶标仪测OD450 nm值。以"0"孔OD450 nm值接近2.0，对应的抗体稀释度定义为抗体的效价。
间接竞争ELISA法与间接ELISA法的程序基本相同，只是在加入抗体时应当先加入相应的药物50μL，然后再加入稀释的抗体50μL，37℃湿盒孵育30min。获得头孢氨苄的IC50为2μg/L，线性范围为0.5-8μg/L，头孢曲松的IC50为2.91μg/L，线性范围为0.625-10μg/L，灵敏度完全达到国家兽药残留检测方法要求，也很适合制备抗体芯片。
2)包被原和抗体浓度的优化
包被原浓度的选择：将头孢氨苄包被原的浓度从左到右设置为0.75、1.5、3、6、12、24μg/mL6个浓度，从右到左依次加1:64000、1:32000、1:16000、1:8000、1:4000、1:2000的头孢氨苄单克隆抗体进行优化，结果发现当头孢氨苄包被原为6μg/mL时，抗体稀释度1:4000时的信号强度在1.5万左右，与其它信号强度相差较大，所以选6μg/mL为头孢氨苄包被原溶液的浓度。
最佳抗体稀释度的确定：以选定的浓度制备头孢氨苄抗体芯片，自上而下添加1:2000-1:64000头孢氨苄单克隆抗体进行反应，结果发现随着抗体稀释度的增加，相对荧光信号强度明显下降，初步确定抗体稀释度为1:2000、1:4000、1:8000，然后在三个抗体稀释度下做间接竞争反应，结果发现抗体稀释为1:4000时抑制不明显，应该是头孢抗体过量造成的；抗体稀释为1:16000时抑制效果较明显，但整体信号强度较弱；头孢氨苄抗体稀释为1:800时抑制效果一般，得到的IC50为3.36μg/L，比ELISA方法IC502μg/L高，所以将最佳头孢氨苄单克隆抗体的稀释度设置为1:10000。
同理优化了头孢噻呋包被原和抗体浓度，结果得到最佳头孢噻呋包被原溶液的浓度为32μg/mL，最佳头孢噻呋单克隆抗体的稀释度为1:12000。
3)点制头孢类抗体芯片
将载体用围栏分成12(2×6)个反应区域如附图7所示。分别用AD3200点样仪把1％OVA溶液、6μg/mL头孢氨苄包被原溶液、32μg/mL头孢噻呋包被原溶液、Cy3-OVA溶液在每个区域进行点样，20nL/点，每个区域形成1个3×4的点阵。将点样后的芯片置于密闭的湿盒中，置于37℃恒温箱中固定0.5h。将芯片放入含PBST(量以淹没玻片为准)洗涤管中，用摇床振摇/手动摇洗2min，重复三次，再放入含ddH2O(以淹没玻片为准)洗涤管中用摇床振摇9/手动摇洗2min，重复三次，最后将玻片以2000r/min转速4℃离心1min。然后加入20μL/孔2％BSA封闭液，放入密闭的湿盒中，置于37℃恒温箱封闭0.5h，洗涤后，37℃烘干5min，抽真空封装存于4℃备用。
实施例5头孢类抗体芯片的性能考核
5.1标准曲线的建立
配制头孢类混合抗体(1:10000头孢氨苄抗体和1:12000头孢噻呋抗体)。用PBS将头孢氨苄和头孢曲松标准品配制成0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/L等6个浓度。分别将10μL混合药物和10μL混合抗体加到芯片上，反应0.5小时，使固定的人工抗原充分与样品中的药物共同竞争特异性抗体，洗涤，离心甩干。加入20μL 1:200稀释的Cy3标记羊抗小鼠IgG，反应0.5小时，洗涤，离心甩干，将甩干的芯片使用InnoScan 700A扫描仪进行扫描，用Mapix分析软件进行分析。以竞争物浓度的对数值为横坐标、对应的抑制率F/F0为纵坐标，绘制标准曲线，见附图8得到回归方程及相关系数，根据回归方程计算IC50，得到头孢氨苄的IC50为1.79μg/L，线性范围为0.625-10μg/L，头孢曲松的IC50为2.52μg/L，线性范围为0.625-10μg/L。相同方法，重复测定5批，求出IC50平均值，并计算片内与片间变异系数，得到片内片间变异系数均小于15％，说明重复性良好。
5.2灵敏度
测定20份0μg/L竞争物标准溶液，将F值分别代入标准曲线回归方程计算对应浓度值，求20份测定浓度值的平均值和标准差(SD)。根据公式计算Z值，作为抗体芯片检测方法灵敏度的判定指标。得到头孢类抗体芯片检测方法头孢氨苄的灵敏度为0.47μg/L，头孢曲松的灵敏度为0.73μg/L，远远低于最大残留限量。
5.3特异性
分别将头孢类及其类似物标准品倍比稀释成一系列浓度绘制标准曲线，计算IC50值，与标准品IC50值对比得到交叉反应率。结果见表1，该抗体芯片能够很好地识别头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢曲松、头孢噻呋、脱呋喃甲酰头孢噻呋，对头孢噻肟和头孢喹肟也有一定识别。
表1头孢类体芯片的交叉反应率结果
5.4稳定性研究
头孢类抗体芯片的37℃稳定性实验：将制备好的头孢类抗体芯片，进行37℃加速试验(阿伦尼乌斯定律)。分别于加速第0、2、4、6、8天取出抗体芯片采用间接竞争法检测，绘制标准曲线，计算IC50值。将加速试验的“0”孔相对荧光信号强度值及IC50值与0天的试验结果进行对比，若“0”孔相对荧光信号强度值明显下降(超过50％)，或IC50值明显升高(超过1倍)，则判定抗体芯片的生物活性已下降一半，抗体芯片将不能再用，“0”孔相对荧光信号强度值和IC50值在可变范围内的这段时间即为抗体芯片的保质期(农医发[2005]17号，2005)。结果见附图9，由图可知“0”孔的相对荧光信号强度值在37℃加速试验的第8天仍保持在F0的60％以上，IC50值在±20％的范围内浮动。表明头孢类抗体芯片在4℃至少可以保存6个月。
5.5样品前处理方法
样品提取液的配制：准确吸取甲醇10mL，少量超纯水稀释，定容至100mL。
牛奶样品处理方法：量取牛奶样品2mL于4mL离心管中，涡旋2min后，取部分牛奶用头孢类提取液40倍稀释，12000r/min，4℃离心10min，除去上层脂肪颗粒后上样。
猪肉样品处理方法：称取匀浆肌肉样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入头孢类提取液10mL，震荡10min使之混匀，6000r/min，4℃离心5min，取上清稀释16倍后直接上样检测。
5.6头孢类抗体芯片检测步骤
采用间接竞争法(附图4所示)用头孢类抗体芯片检测样品。将10μL提取液和10μL混合抗体加到芯片上，反应0.5小时，使固定的人工抗原充分与样品中的药物共同竞争特异性抗体，洗涤，离心甩干，加入20μL 1:200稀释的Cy3标记羊抗小鼠IgG，反应0.5小时，洗涤，离心甩干，将甩干的芯片使用InnoScan 700A扫描仪进行扫描，用Mapix分析软件进行分析。
5.7最低检测限和定量限
取经仪器检测为阴性的待测组织(猪肉和牛奶)样品各20份，经上述样品前处理方法处理后，采用间接竞争法检测，测定F值，计算空白样品F0值的平均值将代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的最低检测限(LOD)。根据公式Q＝C+10×SD计算Q值，此即为组织方法的最低定量限(LOQ)。结果见表2。
表2组织样品中头孢类药物的最低检测限
5.8回收率
取经仪器检测为阴性的待测组织(猪肉和牛奶)样品，添加最大残留限量要求的浓度，每个样品浓度设3个平行。样品处理后，采用间接竞争法测定药物浓度，重复3次，根据公式：计算回收率，并计算批内批间变异系数。结果(表3)显示，回收率在80％-110％之间，批内与批间变异系数＜10％，表明头孢类抗体芯片检测方法准确性良好。
表3头孢类药物牛奶和猪肉中添加回收率
Claims (9)
1.一种用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，其特征在于：所述抗体由头孢氨苄单克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的，能识别头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定；所述头孢噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO:C201341杂交瘤细胞4D5所分泌的，能识别头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟，所述芯片固定了头孢氨苄包被原和头孢噻呋包被原，所述头孢氨苄包被原是头孢氨苄与卵清白蛋白偶联物，所述头孢噻呋包被原是头孢噻呋与卵清白蛋白偶联物。
2.如权利要求1所述的用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于所述芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基片分成两排共12个反应区域，每个反应区域设四排三纵共12个微阵列，将头孢氨苄包被原溶液、头孢噻呋包被原溶液以及两种对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定0.5h，用2％牛血清白蛋白溶液封闭0.5h。
3.如权利要求2所述的用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述头孢氨苄包被原溶液的浓度为6μg/mL，所述头孢噻呋包被原溶液的浓度为32μg/mL，所述头孢氨苄包被原溶液和头孢噻呋包被原溶液的溶剂是含有5％甘油的pH9.16碳酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
5.如权利要求1所述的用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取甲醇10mL，超纯水稀释，定容至100mL。
6.权利要求1-5任何一项所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中头孢类抗生素残留的应用。
7.一种检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于包括以下步骤：
1)样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取；
2)将样品液和稀释好的抗体混合后加入到固定了头孢氨苄包被原溶液、头孢噻呋包被原溶液、以及对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液的芯片上，于37℃反应0.5h，洗涤3次，甩干；
3)将Cy3标记的二抗加到芯片，于37℃反应0.5h，洗涤3次，甩干；
4)用InnoScan 700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析，
所述抗体由头孢氨苄单克隆抗体和头孢噻呋单克隆抗体组成，所述头孢氨苄单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201340杂交瘤细胞3A6所分泌的，能识别头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢拉定；所述头孢噻呋单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201341杂交瘤细胞4D5所分泌的，能识别头孢噻呋，脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟及头孢喹肟；
所述头孢氨苄包被原是头孢氨苄与卵清白蛋白偶联物，所述头孢噻呋包被原是头孢噻呋与卵清白蛋白偶联物；
所述Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
8.根据权利要求7所述的用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于：所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取甲醇10mL，超纯水稀释，定容至100mL。
9.根据权利要求7所述的用于检测食品中头孢类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于：所述抗体是用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释的，其中头孢氨苄单克隆抗体的稀释度为1:10000，头孢噻呋单克隆抗体的稀释度为1:12000；所述头孢氨苄包被原溶液的浓度为6μg/mL，所述头孢噻呋包被原溶液的浓度为32μg/mL，所述头孢氨苄包被原溶液和头孢噻呋包被原溶液的溶剂是含有5％甘油的pH9.16碳酸盐缓冲液。
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