CN106442779B - 提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率并减小基质效应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率并降低其基质效应的方法。该方法通过冷冻干燥有效去除水分，显著提高了动物组织中头孢喹肟残留的回收率、降低了其基质效应，使得检测结果更准确，可用于更加有效地监控头孢喹肟在兽医临床上的合理应用，保障人类的动物源食品安全。

Description

提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率并减小基质效应 的方法

技术领域

本发明涉及一种提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率并可减小其基质效应的方法。

背景技术

头孢喹肟(cefquinome)为第四代头孢菌素类动物专用药物，20世纪80年代由德国赫司特公司开发得到。1993年，硫酸头孢喹肟被首次批准上市。由英国英特威公司开发的混悬液和软膏于1994年上市。国产头孢喹肟原料及其注射液于2008年被农业部批准注册为国家二类新兽药。头孢喹肟具有抗菌谱广、抗菌活性强，吸收迅速、安全高效等特点，目前已被广泛应用于猪牛呼吸道疾病、奶牛乳房炎、子宫炎等多种疾病的临床治疗。为保证人类的食品安全，各国相继制定了头孢喹肟在动物源性食品中的最高残留限量。我国农业部235号公告规定了头孢喹肟在猪、牛的各种靶组织中的最大残留限量，牛奶：20μg/kg，猪、牛肌肉：50μg/kg，猪、牛肝脏：100μg/kg。为有效监控头孢喹肟在临床上的合理使用，保证上市动物源性食品的安全性，国内外研究者多采用高效液相色谱(HPLC)法和高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测动物可食性样品中头孢喹肟的残留。

在残留检测中，回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，也就说明检测方法的准确度越高。

此外，基质效应的存在可严重影响检测的选择性和灵敏度，进而影响分析结果的准确性和精密度，在残留分析中可造成假阳性或假阴性结果。基质效应是指非待测组分使待测物在仪器中的响应受到增强或减弱的现象。它普遍存在于质谱分析中。目前，基质效应已成为建立高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法时必须进行评价的指标之一。水分是细胞的主要成分，在细胞中的含量约占细胞鲜重的80～90％。同时它也是生物体的主要组成成分，平均含水量为60％～90％。哺乳动物含水量一般平均为65％。作为动物组织与体液化学组成中最主要的成分，组织中水分占其湿重的70％以上，牛奶中水分含量在80％以上。样品中水分的存在可能会影响分析物与提取液之间的相互作用，因此，有研究者在组织样品前处理过程中会加入无水硫酸钠去除水分以获得更好的检测结果。说明去除水分可能有助于提高分析物回收率。而样品中的水溶性杂质可能进入到与水互溶的乙腈提取液中，使得上机溶液中基质成分含量增加，基质效应增强。因此，去除水分也可能有助于减小基质效应。真空冷冻干燥又称冻干，是真空技术与冷冻技术相结合的新型干燥脱水技术。它是指先将湿物质冷冻，使其中的水分变成固态冰，再放至较低的水蒸气分压下，使冰直接升华成蒸汽的从而达到干燥样品的方法。由于干燥过程是在低温、真空状态下进行的，因此适用于热不稳定和易氧化的物质的干燥。真空冷冻干燥是去除水分最好的方法，它可去除样品中95％以上的水分。由于样品在冻结时形成稳定的固体骨架，水分升华后固体骨架基本保持原有形状，因此干燥后的制品呈多孔海绵状结构。因此，相比无水硫酸钠，该法可能会更有效地去除样品中水分，且可保证分析物的稳定性，同时冻干样品的多孔海绵状结构也更利于分析物与提取液的相互作用，从而更为有效地提高分析物的回收率。此外，随着水分的升华，水溶性杂质在有机提取溶剂中的溶出减少，从而使基质效应减小。

目前已有的头孢喹肟残留分析方法中，一般采用乙腈对样品进行提取，HLB、C18、Strata-X-C等固相萃取小柱进行净化。提取前均未对样品进行脱水处理，测得头孢喹肟的回收率仍有较大提升空间。研究表明，采用高效液相色谱-串联质谱法测定动物组织中头孢喹肟的残留时，会产生基质增强效应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率并降低其基质效应的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率的方法，包括以下步骤：

(1)称取新鲜样品进行真空干燥，制备冻干粉样品；

(2)对冻干粉样品进行提取；

(3)对所提取的冻干粉样品进行净化；

(4)将净化后的冻干粉样品进行液相色谱-串联质谱和/或高效液相色谱检测。

作为优选，冻干粉样品的制备包括以下步骤：

(5)称取新鲜样品适量，预冷后进行真空冷冻干燥；

(6)取出样品，立即捣碎至粉末状，待提取。

作为进一步的优选，称取的新鲜样品质量为1～10g。

作为进一步的优选，预冷温度为-80℃～4℃；预冷时间为1～5h。

作为进一步的优选，真空冷冻干燥温度为-50℃～-90℃；真空冷冻干燥时间为2～72h。

作为另一个优选，对冻干粉样品采用超声提取。

本发明的有益效果是：

通过冷冻干燥有效去除水分，将显著提高动物组织中头孢喹肟残留的回收率，并有效减小基质效应，使得检测结果更准确，可用于更加有效地监控头孢喹肟在兽医临床上的合理应用，保障人类的动物源食品安全。

具体实施方式

实施例1

本实施例选择头孢喹肟为分析物，分别采用猪肌肉、肝脏鲜样及冻干样为实验样品，对头孢喹肟进行添加回收率的对比实验。

一、样品处理

(1)空白添加新鲜样品的制备

准确称取空白试样5.0±0.05g于离心管中，加入适量标准溶液，旋涡混匀，静置20min以上，制备成1/2MRL(最高残留限量)、MRL和2MRL三个浓度水平的空白添加新鲜样品，即：肌肉分别为25、50、100μg/kg；肝脏分别为50、100、200μg/kg；待提取。

(2)空白添加冻干样品的制备

按上述方法制备相同浓度的空白添加新鲜样品，预冷后进行真空冷冻干燥，取出样品，立即捣碎至粉末状，待提取。其中的预冷温度：-80℃～4℃；预冷时间：1～5h；真空冷冻干燥温度：-50℃～-90℃；真空冷冻干燥时间：2～72h。

(3)鲜样与冻干样的提取

样品中加入适量乙腈/水溶液，超声提取后离心，转移上清液，残渣用乙腈/水溶液重复提取一次，合并上清液。将提取液于水浴中旋转蒸发至近干，加入适量水溶解残渣，溶液转移至50mL离心管中，离心，取上清液，待净化。具体提取方法为：乙腈/水比例：10/90～90/10，V/V；乙腈/水用量：5～30mL；离心温度：4℃～常温；离心转速：3000～25000r/min；离心时间：5～15min；水浴温度：30～60℃。

(4)鲜样与冻干样的净化

HLB固相萃取小柱经乙腈活化、水平衡后，将提取液过柱，流干后用真空泵抽干或洗耳球挤干水分。加乙腈洗脱，洗脱液水浴氮气吹至近干，加适量水溶解，过滤膜，待上机检测。具体净化方法为：HLB固相萃取小柱规格：体积3～6mL，填料60～500mg；活化用乙腈体积：3～5mL；平衡用水体积：3～5mL；样品溶液过柱流速：1～10滴/S；洗脱液体积：3～5mL；复溶用水：0.5～3mL。

二、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测

本实施例采用了液相色谱-串联质谱法检测，也可以采用高效液相色谱法进行检测。

1)液相条件

色谱柱：Eclipse Plus C18(RRHD 1.8μm，2.1×100mm)；

柱温：30℃；

流动相：A:0.1％甲酸水，B:甲醇；

梯度洗脱：0～0.5min保持5％B，0.5～5min 5％B线性变化至60％B，5～7min保持60％B，7～7.1min 60％B线性变化至5％B，7.1～9min保持5％B；

流速：0.25mL/min；

进样量：5μL；

2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源

扫描模式：正离子扫描(ESI⁺)

检测方式：多反应监测(MRM)

毛细管电压：4000V；

离子源温度(TEM)：325℃；

干燥气温度：300℃；

干燥气流量：8L/min；

雾化气压力：40psi；

鞘气温度：350℃；

鞘气流量：12L/min。

定性离子对(m/z)：529/395.9、529/134.1；

定量离子对(m/z)：529/134.1；

碰撞气能量(CE)：12V；

碰撞电压：90V。

三、回收率的计算

回收率＝加标浓度的实际检测结果/理论加标浓度×100。

其中理论加标浓度是指样品未处理前外加至该待测样品的头孢喹肟的含量，加标浓度的实际检测结果是指外加至该待测样品的头孢喹肟的含量经样品处理后的检测结果。

四、回收率的比较结果

采用上述样品处理与检测方法，测定添加鲜样与冻干样中头孢喹肟的浓度，计算头孢喹肟的添加回收率。对比结果如表1和表2所示。

表1头孢喹肟在新鲜与冻干猪肌肉中的回收率(％)

添加浓度(μg/kg)	新鲜样品	冻干样品	提高百分比(％)
				25	63.8	81.5	27.7
50	48.6	86.5	77.9
				100	47.3	86.5	83.0

表2头孢喹肟在新鲜与冻干猪肝脏中的回收率(％)

添加浓度(μg/kg)	新鲜样品	冻干样品	提高百分比(％)
				25	62.3	70.3	12.8
50	59.6	85.4	43.2
				100	38.1	68.9	81.0

从表1和表2中可见，头孢喹肟在冻干样品中的回收率比鲜样提高12.8～83.0％，说明冻干样品后进行提取净化可有效提高头孢喹肟的回收率。

实施例2

本实施例选择猪肝脏鲜样及冻干样为实验样品，对头孢喹肟的基质效应进行评价。

一、样品处理

(1)冻干粉样品的制备

同实施例1。

(2)空白基质溶液的制备

空白的猪肝新鲜样品或冻干样品按实施例1同样的方法进行提取净化，获得新鲜或冻干猪肝样品的空白基质溶液。

(3)纯溶剂标准溶液与空白基质匹配标准溶液的制备

向超纯水和已制备好的空白基质溶液中添加头孢喹肟，配制成含有相同浓度头孢喹肟的纯溶剂标准溶液(50、100和200μg/L)和空白基质匹配标准溶液(50、100和200μg/L即50、100和200μg/kg)

二、样品检测

采用高效液相色谱-串联质谱仪检测，按实施例1同样的检测条件进行测定。

三、基质效应的计算

获得头孢喹肟在纯溶剂和空白基质溶液中的峰面积，通过公式ME(％)＝B/A×100评价基质效应。式中A和B分别表示纯溶剂与基质溶液中头孢喹肟的峰面积，B/A>1，说明样品基质可增强分析物的响应值，存在基质增强效应；B/A<1，说明样品基质可抑制分析物的响应值，存在基质抑制效应；B/A＝1，说明不存在基质效应。ME(％)越接近100，说明基质效应越弱，分析结果受基质效应的影响越小。

四、基质效应的比较结果

采用上述样品处理、检测方法和基质效应计算方法，测定头孢喹肟在猪肝鲜样和冻干样中的基质效应。对比结果如表3所示。

表3头孢喹肟在新鲜与冻干猪肝脏中的基质效应(ME)(％)

添加浓度(μg/kg)	新鲜样品	冻干样品	降低百分比(％)
				50	445	119	73.3
100	577	124	78.5
				200	422	119	71.7

表3中可见，猪肝样品中的基质可增强头孢喹肟的响应值，鲜样中基质效应非常强，将样品冻干则可有效降低基质效应，降低百分比为71.7～78.5％。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (1)

1.提高动物源食品中头孢喹肟残留检测回收率并降低基质效应的方法，包括以下步骤：

(1)称取新鲜样品进行真空干燥，制备冻干粉样品；

(2)对冻干粉样品进行提取；其中，样品中加入适量乙腈/水溶液，超声提取后离心，转移上清液，残渣用乙腈/水溶液重复提取一次，合并上清液；将提取液于水浴中旋转蒸发至近干，加入适量水溶解残渣，溶液转移至50mL离心管中，离心，取上清液，待净化；乙腈/水比例：10/90～90/10，V/V；乙腈/水用量：5～30mL；离心温度：4℃～常温；离心转速：3000～25000r/min；离心时间：5～15min；水浴温度：30～60℃；

(3)对所提取的冻干粉样品进行净化；其中采用HLB固相萃取小柱经乙腈活化、水平衡后，将提取液过柱，流干后用真空泵抽干或洗耳球挤干水分；加乙腈洗脱，洗脱液水浴氮气吹至近干，加适量水溶解，过滤膜，待上机检测，HLB固相萃取小柱规格：体积3～6mL，填料60～500mg；活化用乙腈体积：3～5mL；平衡用水体积：3～5mL；样品溶液过柱流速：1～10滴/S；洗脱液体积：3～5mL；复溶用水：0.5～3mL；

(4)将净化后的冻干粉样品进行液相色谱-串联质谱和/或高效液相色谱检测；

其中，所述冻干粉样品的制备包括以下步骤：

(5)称取新鲜样品，预冷后进行真空冷冻干燥；

(6)取出样品，立即捣碎至粉末状，待提取；

称取的新鲜样品的质量为1～10g，预冷后进行真空冷冻干燥；

所述预冷温度为-80℃～4℃；预冷时间为1～5h；

所述真空冷冻干燥温度为-50℃～-90℃；真空冷冻干燥时间为2～72h；

对冻干粉样品采用超声提取。