CN104977367B - 一种畜类尿液中20种β‑兴奋剂类药物残留的检测方法 - Google Patents
一种畜类尿液中20种β‑兴奋剂类药物残留的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种畜类尿液中20种β‑兴奋剂类药物残留的检测方法，该方法包括提取、净化和测定，其中，提取的方法为在待测畜类尿液中加入同位素内标工作液后调节pH至9‑10，加入正丁醇‑甲基叔丁基醚，混匀，离心，取上清液吹干，用0.1‑0.3体积%的甲酸水溶液复溶，在正丁醇‑甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇‑甲基叔丁基醚体积的50‑70%。本发明方法，前处理过程简单，可以方便、快捷、准确的检测畜类尿液中的β‑兴奋剂的含量，且一次即可检测20种β‑兴奋剂。
Description
技术领域
本发明涉及药物残留检测分析技术领域，具体地，涉及一种畜类尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法。
背景技术
从近年来的食品安全事件归纳总结，兽药残留已经成为影响食品安全的主要因素之一，而β-兴奋剂则是影响肉类食品安全的主要因素。β-兴奋剂是一类人工合成药物，此类物质可以增加蛋白质合成，减缓蛋白质降解，增强体脂分解，减少体脂合成。如果将其加入动物饲料中作为动物饲料添加剂可以提高饲料转化率。特别是在畜类养殖（如猪养殖）中，将其作为饲料添加剂时，能有效地促进畜类（如猪）肌肉的生长。然而，现在医学实验已证明其残留会严重影响到人类的健康，如出现心慌、头痛、恶心等症状，人如果长期食用含有β-兴奋剂残留的肉（如猪肉）还会增加致癌、致畸的风险。有鉴于此，在食品安全高度重视的今天，人们开始越来越关注动物源性食品中存在的β-兴奋剂给人们身体健康所带来的影响，我国于1988年6月发布的《兽药管理条例实施细则》中就规定了“不得添加激素类药品”，在1997年又下发了《关于严禁非法使用兽药的通知》，我国农业部在2002年农牧发［2002］1号文件中明确规定克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺为禁用药物。在食品安全要求甚严的欧盟也对此做出了规定，欧盟1996年通过法律禁止使用该类药物（ECDirective96/22/EC）。
目前，猪尿中的瘦肉精检测主要依靠酶联免疫快速检测方法，但该方法为非确证方法，而且检测种类有限。已有的仪器方法一次最多检测11种β-兴奋剂，而且样品前处理过程复杂，需要使用大量的有机试剂进行提取，前处理过程耗费较长时间。因此，研发出一种畜类中β-兴奋剂快速、灵敏的检测方法，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种畜类尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法。
本发明的发明人在研究中发现，在对畜类尿液中β-兴奋剂类药物残留进行检测时，尿液前处理步骤中提取和净化的条件，尤其是提取时尿液样品pH值的设定和提取时所用的提取液对尿液中各种β-兴奋剂的提取效果有重要影响，复溶时所用的溶解液对尿液中各种β-兴奋剂的净化效果有重要影响，较好的提取效果和净化效果则有利于后续检测的顺利进行并能有效保障回收率在正常范围内。其中，在提取步骤中，当调节尿液样品的pH至9-10时，用正丁醇-甲基叔丁基醚（正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的50-70%）作为提取液，并用0.1-0.3体积%的甲酸水溶液作为复溶时的溶解液时，不仅能够大大提高提取和净化效果，使尿液前处理过程变得简单，而且经高效液相色谱-串联质谱法测定一次即可检测出20种β-兴奋剂，且尿液样品中20种β-兴奋剂的回收率均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求。
为了实现上述目的，本发明提供了一种畜类尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法，该方法包括以下步骤：
（1）提取：在待测畜类尿液中加入同位素内标工作液后调节pH至9-10，加入正丁醇-甲基叔丁基醚，混匀，离心，取上清液吹干，用0.1-0.3体积%的甲酸水溶液复溶，其中，在所述正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的50-70%；
（2）净化、测定：将步骤（1）中复溶得到的溶液过阳离子交换柱进行净化，净化得到的溶液吹干后用与步骤（1）中待测畜类尿液相同体积的初始流动相复溶，将复溶得到的溶液过滤膜后用高效液相色谱-串联质谱法测定，其中，所述初始流动相为进行高效液相色谱测定时的初始流动相。
本发明方法，前处理过程简单，可以方便、快捷、准确的检测畜类尿液（如猪尿）中的β-兴奋剂的含量，且一次即可检测20种β-兴奋剂。同时，20种β-兴奋剂均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求。利用本发明方法可严格监控我国畜类养殖（如生猪养殖）中β-兴奋剂的使用情况，减少畜类肌肉（如猪肉）中β-兴奋剂对人体的危害，提高我国食品安全水平，有利于人们身体健康和社会稳定。
本领域技术人员应该理解的是，回收率越接近100%，说明检测方法越准确、可靠。回收率之所以会大于100%，原因有两个，第一是因为采用内标法定量，内标的损失过大时，回收率会超过100%，第二是因为基质对药物产生增强效果时，回收率也会偏高。
本发明方法适用于畜类尿液（如猪尿）中齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、苯氧丙酚胺、马喷特伦、溴代克伦特罗、氯丙那林、班布特罗、妥布特罗、克伦普罗、羟苄羟麻黄碱、克伦塞罗、苯乙醇胺A、沙美特罗20种β-兴奋剂的检测，用于肉品加工企业对畜类（如生猪）收购过程中对在畜类（如生猪）养殖时是否使用β-兴奋剂进行检测，同时适用于对畜类（如生猪）养殖过程中β-兴奋剂的普查，能够在不伤害活体动物的前提下有效检测其是否使用过β-兴奋剂。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种畜类尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法，该方法包括以下步骤：
（1）提取：在待测畜类尿液中加入同位素内标工作液后调节pH至9-10，加入正丁醇-甲基叔丁基醚，混匀，离心，取上清液吹干，用0.1-0.3体积%的甲酸水溶液复溶，其中，在所述正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的50-70%；
（2）净化、测定：将步骤（1）中复溶得到的溶液过阳离子交换柱进行净化，净化得到的溶液吹干后用与步骤（1）中待测畜类尿液相同体积的初始流动相复溶，将复溶得到的溶液过滤膜后用高效液相色谱-串联质谱法测定，其中，所述初始流动相为进行高效液相色谱测定时的初始流动相。
本发明方法中，20种β-兴奋剂类药物分别为齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、苯氧丙酚胺、马喷特伦、溴代克伦特罗、氯丙那林、班布特罗、妥布特罗、克伦普罗、羟苄羟麻黄碱、克伦塞罗、苯乙醇胺A和沙美特罗。在待测畜类尿液中加入的同位素内标工作液可以为能够代表该20种β-兴奋剂构型的若干β-兴奋剂的同位素内标工作液，例如可以为该20种β-兴奋剂的同位素内标工作液，也可以为其中几种β-兴奋剂的同位素内标工作液，为了节约成本，加入的同位素内标工作液优选为莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的乙腈溶液。
本发明方法中，对于加入的同位素内标工作液的量没有特别要求，只要能够将尿液中20种β-兴奋剂的残留量进行校对和定量即可，其中，当待测畜类尿液中加入的同位素内标工作液为莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的乙腈溶液时，每ml待测畜类尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度优选为10-50ug/L，更优选地，每ml待测畜类尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度相同。其中，在同位素内标工作液中，莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的浓度可以为500-2000ug/L，优选地，莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的浓度相同，然后可以根据每ml待测畜类尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度来控制加入的同位素内标工作液的量。
为了提高前处理过程中β-兴奋剂的回收率，优选用碱液调节加入同位素内标工作液后尿液的pH值，更优选用氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值，其中，氢氧化钠或氢氧化钾的浓度优选为10mol/L。
在步骤（1）中，加入同位素内标工作液后尿液pH值的调节对尿液中20种β-兴奋剂的提取效果有重要影响。pH值为9-10时，在20种β-兴奋剂的等电点附近，使得β-兴奋剂以成分子形态存在，在尿液中的溶解性减小，在有机溶剂中的溶解性增大，进而得到较好的提取效果。
为了进一步优化步骤（1）中的提取效果，优选情况下，在正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的60%。
本发明步骤（1）中，对于加入的正丁醇-甲基叔丁基醚的体积没有特别要求，为了进一步提高提取效果和降低成本，优选情况下，加入3-10倍待测畜类尿液体积的正丁醇-甲基叔丁基醚。
本发明步骤（1）中，对于将上清液吹干的方法没有特殊要求，只要能够将上清液进行吹干即可，优选情况下，上清液在40-65℃水浴中氮气吹干。
本发明步骤（1）中，对于复溶时所用的0.1-0.3体积%的甲酸水溶液的用量没有特殊要求，只要能够将吹干后物质进行溶解即可。优选情况下，用与待测畜类尿液相同体积的0.1-0.3体积%的甲酸水溶液进行复溶。为了进一步提高净化效果，复溶所用的甲酸水溶液的浓度为0.2体积%，即，甲酸的体积为甲酸水溶液体积的0.2%。
本发明步骤（2）中，对于用阳离子交换柱进行净化的方法没有特殊要求，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，例如可以为：将阳离子交换柱连接到真空过柱装置，依次用甲醇、水活化阳离子交换柱，将步骤（1）中复溶得到的溶液全部过柱，再依次用水、0.2体积%的甲酸水溶液和甲醇洗涤阳离子交换柱并彻底抽干，最后用5体积%的氨水甲醇溶液洗脱阳离子交换柱，得到净化得到的溶液。为了进一步提高净化效果，阳离子交换柱优选为MCX柱，MCX柱可以为Oasis MCX固相萃取柱（60mg/3mL）。
本发明步骤（2）中，净化得到的溶液可以在40-65℃水浴中经氮气吹干，再用与步骤（1）中待测畜类尿液相同体积的初始流动性复溶。为了进一步提高净化效果，初始流动相优选为0.1体积%甲酸水溶液-0.1体积%甲酸乙腈溶液，其中，0.1体积%甲酸水溶液和0.1体积%甲酸乙腈溶液的体积比为1︰7-9，更优选为1︰9。
本领域技术人员应该理解的是，0.1体积%甲酸水溶液是指甲酸体积为0.1体积%的水溶液（即，在甲酸水溶液中，甲酸的体积为甲酸水溶液体积的0.1%）；5体积%的氨水甲醇溶液是指氨水体积为5体积%的甲醇溶液；0.1体积%甲酸乙腈溶液是指甲酸体积为0.1体积%的乙腈溶液。
本发明步骤（2）中，对于高效液相色谱-串联质谱法的具体方法没有特别要求，可以为本领域常用的方法。例如，高效液相色谱的条件可以为：
分析仪器：LC-30A系统
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（2.1×100mm,2.7μm）
流动相：1‰甲酸水溶液-1‰甲酸乙腈溶液(A/B)
流速：0.2mL/min
进样体积：5μL
柱温：30℃
洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为8%，梯度洗脱时间程序见表1。
表1
| 时间(min) | 模块（Module） | 命令（Command） | 值（Value） |
| 0.01 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 8% |
| 8.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 30% |
| 10.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 60% |
| 12.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 95% |
| 13.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 95% |
| 13.1 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 8% |
| 15.0 | 控制器（Controller） | 结束 |
质谱条件可以为：
分析仪器：LCMS-8040
离子源：ESI(+)
离子源接口电压：3.5kV
雾化气、干燥气：氮气3.0L/min、氮气20L/min
碰撞气：氩气
脱溶剂管温度：250℃
加热模块温度：450℃
检测器电压：1.1kV
扫描模式：多反应监测，具体参数见表2。
表2
注：表2中，*是指定量离子。
另外，本发明方法中高效液相色谱-串联质谱法测定还包括：将空白畜类尿液按照步骤（1）方法进行提取，得到的溶液过阳离子交换柱进行净化，净化得到的溶液吹干后分别用与空白畜类尿液相同体积的5个不同浓度的混合标准溶液复溶，将复溶得到的溶液分别过滤膜后用高效液相色谱-串联质谱法测定，制作每种β-兴奋剂类药物的标准工作曲线；根据待测畜类尿液测定的结果和制作的标准工作曲线，得到待测畜类尿液中20种β-兴奋剂类药物的残留量。
本领域技术人员应该理解的是，空白畜类尿液是指不含该20种β-兴奋剂的畜类尿液。混合标准溶液是指该20种β-兴奋剂的乙腈溶液，即溶质为20种β-兴奋剂、溶剂为乙腈的溶液。优选情况下，混合标准溶液中该20种β-兴奋剂的浓度相同。更优选地，5个不同浓度的混合标准溶液分别是20种β-兴奋剂浓度均为1μg/L，5μg/L，20μg/L，50μg/L和100μg/L的混合标准溶液，其中，混合标准溶液中该20种β-兴奋剂的浓度相同。
本发明方法中，优选情况下，畜类为猪、牛或羊。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例和对比例中，20种β-兴奋剂分别为齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、苯氧丙酚胺、马喷特伦、溴代克伦特罗、氯丙那林、班布特罗、妥布特罗、克伦普罗、羟苄羟麻黄碱、克伦塞罗、苯乙醇胺A和沙美特罗。
MCX柱购自WATERS公司。
实施例1
本实施例用于说明本发明的猪尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法。
（1）提取：称取2ml空白猪尿液，向空白猪尿液中加入混合标准溶液，该混合标准溶液为20种β-兴奋剂浓度均相同的乙腈溶液，使得每ml猪尿液中20种β-兴奋剂的终浓度均为5μg/L，得到加标浓度为5μg/L的猪尿液；再加入同位素内标工作液，该同位素内标工作液为莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3浓度均相同的乙腈溶液，使得每ml猪尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度均为30ug/L，然后用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.5，加入10ml正丁醇-甲基叔丁基醚，该正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的60%，混匀，离心，取上清液在40℃水浴中氮气吹干，用2mL0.2体积%的甲酸水溶液复溶。
（2）净化：将MCX柱连接到真空过柱装置，MCX柱依次用2ml甲醇、2ml水活化，将步骤（1）中复溶得到的溶液全部过柱，再依次用2mL水、2mL0.2体积%的甲酸水溶液和2mL甲醇洗涤MCX柱并彻底抽干，最后用2mL5体积%的氨水甲醇溶液洗脱MCX柱，流速控制在0.5mL/min，洗脱液在40℃水浴下氮气吹干，用2mL0.1体积%甲酸水溶液-0.1体积%甲酸乙腈溶液复溶（0.1体积%甲酸水溶液和0.1体积%甲酸乙腈溶液的体积比为1︰9），得到加标浓度为5μg/L的猪尿液净化复溶后的溶液。重复上述步骤，分别得到加标浓度分别为20μg/L和50μg/L的猪尿液净化复溶后的溶液。
（3）将步骤（2）中得到的加标浓度分别为5μg/L、20μg/L和50μg/L的猪尿液净化复溶后的溶液分别过滤膜，然后用高效液相色谱-串联质谱法测定，每种浓度6次重复。其中，高效液相色谱的条件为：
分析仪器：LC-30A系统
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（2.1×100mm,2.7μm）
流动相：1‰甲酸水溶液-1‰甲酸乙腈溶液(A/B)
流速：0.2mL/min
进样体积：5μL
柱温：30℃
洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为8%，梯度洗脱时间程序见表1。
表1
| 时间(min) | 模块（Module） | 命令（Command） | 值（Value） |
| 0.01 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 8% |
| 8.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 30% |
| 10.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 60% |
| 12.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.）. | 95% |
| 13.0 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 95% |
| 13.1 | 泵（Pumps） | 连B泵比例（Pump B Conc.） | 8% |
| 15.0 | 控制器（Controller） | 结束 |
质谱条件为：
分析仪器：LCMS-8040
离子源：ESI(+)
离子源接口电压：3.5kV
雾化气、干燥气：氮气3.0L/min、氮气20L/min
碰撞气：氩气
脱溶剂管温度：250℃
加热模块温度：450℃
检测器电压：1.1kV
扫描模式：多反应监测，具体参数见表2。
表2
注：表2中，*是指定量离子。
其中，经上述处理后，加标浓度为5μg/L、20μg/L和50μg/L的猪尿液中20种β-兴奋剂在11分钟时在色谱柱上就有较好的分离效果，猪尿液中各种β-兴奋剂的保留时间如表3所示。
表3
（4）标准工作曲线的制作：称取5份2ml空白猪尿液，按照步骤（1）方法进行提取，得到的溶液按照步骤（2）方法进行净化，净化得到的溶液吹干后分别用2ml混合标准溶液复溶，混合标准溶液中20种β-兴奋剂浓度分别均为1μg/L、5μg/L，20μg/L，50μg/L和100μg/L，将复溶得到的溶液分别过滤膜后按照步骤（3）高效液相色谱-串联质谱法测定，制作标准工作曲线；20种β-兴奋剂的线性范围良好，各种β-兴奋剂的标准工作曲线的线性方程具体见表4，各标准工作曲线中X为β-兴奋剂的浓度，Y为β-兴奋剂的峰面积。
表4
（5）灵敏度实验
信噪比及仪器检测限(3倍噪声计算)的结果见表5（加标浓度为20μg/L）。
表5
由表5可知，加标浓度为20μg/L的猪尿液中20种β-兴奋剂的检测限为0.03-1.39μg/L。
（6）根据三种不同加标浓度的猪尿液测定的结果和制作的标准工作曲线，得到三种不同加标浓度的猪尿液中20种β-兴奋剂的含量。
20种β-兴奋剂的回收率（%）与标准偏差（RSD/%）结果见表6，其中，表6中20种β-兴奋剂的回收率为6次重复的平均值。
表6
由表6可知，20种β-兴奋剂均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求。
实施例2
本实施例用于说明本发明的羊尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法。
按照实施例1的方法，不同的是，本实施例检测的是羊尿液中的20种β-兴奋剂的含量，其中，步骤（1）中，称取2ml空白羊尿液，得到加标浓度为5μg/L的羊尿液后，加入同位素内标工作液，使得每ml羊尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度均为10ug/L，然后用10mol/L氢氧化钾溶液调节pH至9；步骤（2）中，0.1体积%甲酸水溶液-0.1体积%甲酸乙腈溶液中，0.1体积%甲酸水溶液和0.1体积%甲酸乙腈溶液的体积比为1︰7，同时，分别得到加标浓度分别为5μg/L、20μg/L和50μg/L的羊尿液净化复溶后的溶液；步骤（4）中，制作相应的标准工作曲线。
本实施例的3种不同加标浓度羊尿液中，20种β-兴奋剂的回收率与标准偏差结果见表7。
表7
由表7可知，20种β-兴奋剂均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求。
实施例3
本实施例用于说明本发明的牛尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法。
按照实施例1的方法，不同的是，本实施例检测的是牛尿液中的20种β-兴奋剂的含量，其中，步骤（1）中，称取2ml空白牛尿液，得到加标浓度为5μg/L的牛尿液后，加入同位素内标工作液，使得每ml牛尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度均为50ug/L，然后用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10；步骤（2）中，0.1体积%甲酸水溶液-0.1体积%甲酸乙腈溶液中，0.1体积%甲酸水溶液和0.1体积%甲酸乙腈溶液的体积比为1︰8，同时，分别得到加标浓度分别为5μg/L、20μg/L和50μg/L的牛尿液净化复溶后的溶液；步骤（4）中，制作相应的标准工作曲线。
本实施例的3种不同加标浓度牛尿液中，20种β-兴奋剂的回收率与标准偏差结果见表8。
表8
由表8可知，20种β-兴奋剂均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求。
实施例4
本实施例用于说明本发明的猪尿液中20种β-兴奋剂类药物残留高通量检测方法。
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的70%。
本实施例中，20种β-兴奋剂的回收率与标准偏差结果见表9。
表9
实施例5
本实施例用于说明本发明的猪尿液中20种β-兴奋剂类药物残留高通量检测方法。
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的50%。
本实施例中，20种β-兴奋剂的回收率与标准偏差结果见表10。
表10
实施例6
本实施例用于说明本发明的猪尿液中20种β-兴奋剂类药物残留高通量检测方法。
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，所用的甲酸水溶液为0.1体积%的甲酸水溶液。
本实施例中，20种β-兴奋剂的回收率与标准偏差结果见表11。
表11
实施例7
本实施例用于说明本发明的猪尿液中20种β-兴奋剂类药物残留高通量检测方法。
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，所用的甲酸水溶液为0.3体积%的甲酸水溶液。
本实施例中，20种β-兴奋剂的回收率与标准偏差结果见表12。
表12
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至11。
对比例1的部分药物回收率的结果见表13。
表13
对比例2
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8。
对比例2的部分药物回收率的结果见表14。
表14
对比例3
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，加入的提取液为10ml异丙醇-乙酸乙酯，其中异丙醇和乙酸乙酯的体积比为6︰4。
对比例3的部分药物回收率的结果见表15。
表15
对比例4
按照实施例1的方法，不同的是，步骤（1）中，上清液吹干后，用2mL2mol/L的乙酸铵溶液（pH为5.2）复溶。
对比例4的部分药物回收率的结果见表16。
表16
由实施例1-7与对比例1-4比较可知，本发明方法，不仅能够大大提高提取和净化效果，而且经高效液相色谱-串联质谱法测定一次即可检测出20种β-兴奋剂，且尿液样品中20种β-兴奋剂的回收率均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求；而对比例1-4的部分药物回收率的结果则远远偏离回收率在60～120%之间的要求，且准确性有待提高。
由实施例1分别与实施例4和实施例5比较可知，在步骤（1）中，正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的60%时，尿液中20种β-兴奋剂的回收率更接近100%，检测方法更加准确、可靠。
由实施例1分别与实施例6和实施例7比较可知，在步骤（1）中，甲酸水溶液为0.2体积%的甲酸水溶液时，尿液中20种β-兴奋剂的回收率更接近100%，检测方法更加准确、可靠。
本发明方法，前处理过程简单，可以方便、快捷、准确的检测畜类尿液中的β-兴奋剂的含量，且一次即可检测20种β-兴奋剂。同时，20种β-兴奋剂均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》样品含量<0.100mg/kg时，回收率在60～120%之间的要求。利用本发明方法可严格监控我国畜类养殖（如生猪养殖）中β-兴奋剂的使用情况，减少畜类肌肉（如猪肉）中β-兴奋剂对人体的危害，提高我国食品安全水平，有利于人们身体健康和社会稳定。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种畜类尿液中20种β-兴奋剂类药物残留的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)提取：在待测畜类尿液中加入同位素内标工作液后调节pH至9-10，加入正丁醇-甲基叔丁基醚，混匀，离心，取上清液吹干，用0.1-0.3体积％的甲酸水溶液复溶，其中，在所述正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的50-70％；
(2)净化、测定：将步骤(1)中复溶得到的溶液过阳离子交换柱进行净化，净化得到的溶液吹干后用与步骤(1)中待测畜类尿液相同体积的初始流动相复溶，将复溶得到的溶液过滤膜后用高效液相色谱-串联质谱法测定，其中，所述初始流动相为0.1体积％甲酸水溶液-0.1体积％甲酸乙腈溶液，0.1体积％甲酸水溶液和0.1体积％甲酸乙腈溶液的体积比为1︰7-9；
其中，在步骤(1)中，所述同位素内标工作液为莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的乙腈溶液；
其中，所述20种β-兴奋剂类药物分别为齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、苯氧丙酚胺、马喷特伦、溴代克伦特罗、氯丙那林、班布特罗、妥布特罗、克伦普罗、羟苄羟麻黄碱、克伦塞罗、苯乙醇胺A和沙美特罗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，用氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，在所述正丁醇-甲基叔丁基醚中，正丁醇的体积为正丁醇-甲基叔丁基醚体积的60％。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述甲酸水溶液的浓度为0.2体积％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在待测畜类尿液中加入所述同位素内标工作液后，每ml待测畜类尿液中莱克多巴胺D3、克伦特罗D9和沙丁胺醇D3的终浓度相同，均为10-50ug/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述阳离子交换柱为MCX柱。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，0.1体积％甲酸水溶液和0.1体积％甲酸乙腈溶液的体积比为1︰9。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述畜类为猪、牛或羊。
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