一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种分子印迹聚合物的制备方法及应用。
背景技术
β-受体激动剂是一类具有肾上腺素功能的苯乙醇胺类人工合成化合物,上世纪80年代初,美国开始将克伦特罗用于动物养殖,增强动物体内的脂肪分解代谢,提高胴体的瘦肉率,改善养殖动物日增重和饲料转化率。目前,世界各国在动物养殖过程中使用最为广泛的β-受体激动剂类药物是克伦特罗,其次是莱克多巴胺、沙丁胺醇,马步特罗、班布特罗等也时有发现。通常,β-受体激动剂类化合物会作为药物添加剂使用,使用剂量一般均超过5mg/kg才能够有效的促进动物生长和改善动物肉品质。但高剂量的β-受体激动剂类药物易在可食性动物组织中残留,当人体中摄入剂量累计超过一定值或食入高残留(100ng/g)的内脏组织时,易出现β-受体激动剂的毒副作用。我国已明令禁止苯乙醇胺A等8种β-受体激动剂。
β-受体激动剂类药物分析方法主要有免疫筛选方法和仪器确证方法。由于动物样品种类繁多,基体成分复杂,对β-受体激动剂检测干扰严重,影响常规快速检测方法以及大型仪器对β-受体激动剂残留的有效检测。常规固相萃取柱前处理主要基于离子交换的原理,缺乏选择性,不能有效的富集目标分析物和消除基体干扰。因此,开发具有选择性、特异性且适用性强的新型样品前处理技术,从复杂的生物样品基质中快速、选择性的富集β-受体激动剂残留,对于提高β-受体激动剂检测灵敏度和准确性十分重要。
分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)是一种具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料,具有“类抗体”的特异性、高选择性、高强度等优点,而且制备简单、成本低、可重复利用,因此在固相萃取、色谱分离、传感器等领域得到广泛的应用。目前针对β-受体激动剂的分子印迹聚合物都是以单一目标物为模板,能够吸附的β-受体激动剂类物质较少,而在实际应用中,β-受体激动剂种类很多,多以混合物的形式存在在样品基质中。
发明内容
本发明的目的是要解决现有β-受体激动剂类分子印迹聚合物吸附种类少的问题,而提供一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的制备方法及应用。
一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的制备方法,具体是按以下步骤完成的:
一、制备复合模板剂/功能单体混合液:将复合模板溶解到有机溶剂中,再加入功能单体,再使用震荡器震荡1h~4h,得到复合模板剂/功能单体混合液;
步骤一中所述的复合模板与功能单体的摩尔比为1:(3~6);
步骤一中所述的复合模板的物质的量与有机溶剂的体积比为1g:(220mL~260mL);
二、加入交联剂和引发剂:向复合模板剂/功能单体混合液中加入交联剂和引发剂,再在超声功率为80W~110W的条件下超声分散5min~10min,再在氮气气氛下和温度为40℃~60℃下水浴反应20h~24h,得到聚合物A;
步骤二中所述的交联剂与复合模板剂/功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为(3~6):1;
步骤二中所述的引发剂与复合模板剂/功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为18mg:1mmol;
三、研磨、筛分:将聚合物A进行研磨,再使用300目的筛子进行筛分,得到粒径小于48μm的聚合物;再使用质量分数为5%~20%乙酸甲醇溶液反复洗脱,至洗脱液中无模板分子,再使用甲醇进行清洗,至清洗液中无杂质,再在温度为50℃~70℃下进行干燥9h~15h,得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物。
一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用是作为固相萃取柱的填料,富集净化样品中的痕量β-受体激动类物质。
本发明的优点:
一、本发明首次选择两种β-受体激动剂类物质作为复合模板,以甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂,在甲醇乙腈混合溶液采用本体聚合的方式合成了具有“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球;
二、本发明的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物是一种具有与模板分子结构相匹配的空间孔穴结构的高分子聚合物,能够选择性识别与模板分子结构类似的PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质,具有良好的“类”特异性;
三、本发明的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物制备步骤简单、成本低、所用化学试剂少,符合当前环保的要求;
四、本发明的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物在制备过程中采用了双模板分子,将其作为填料制备分子印迹固相萃取柱,可以解决当前通用型固相萃取柱选择性差、基质效应大的问题,还可以解决当前β-受体激动剂分子印迹固相萃取柱吸附物质少的问题,能够选择性净化、富集样品中的痕量β-受体激动剂类物质,对PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质的回收率为61.2%~80.4%,符合痕量残留检测的要求;
五、本发明的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用是作为固相萃取柱的填料,与通用型固相萃取柱相比,该分子印迹固相萃取柱的前处理过程简单、富集净化的效果好,有机试剂使用量少,经济环保。
附图说明
图1为试验一制备的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的扫描电子显微镜图;
图2为试验一制备的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物MIP和非印迹聚合物NIP对七种β-受体激动剂类物质的吸附效果柱状图,图中1为MIP,2为NIP。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式是一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的制备方法具体是按以下步骤完成的:
一、制备复合模板剂/功能单体混合液:将复合模板溶解到有机溶剂中,再加入功能单体,再使用震荡器震荡1h~4h,得到复合模板剂/功能单体混合液;
步骤一中所述的复合模板与功能单体的摩尔比为1:(3~6);
步骤一中所述的复合模板的物质的量与有机溶剂的体积比为1g:(220mL~260mL);
二、加入交联剂和引发剂:向复合模板剂/功能单体混合液中加入交联剂和引发剂,再在超声功率为80W~110W的条件下超声分散5min~10min,再在氮气气氛下和温度为40℃~60℃下水浴反应20h~24h,得到聚合物A;
步骤二中所述的交联剂与复合模板剂/功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为(3~6):1;
步骤二中所述的引发剂与复合模板剂/功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为18mg:1mmol;
三、研磨、筛分:将聚合物A进行研磨,再使用300目的筛子进行筛分,得到粒径小于48μm的聚合物;再使用质量分数为5%~20%乙酸甲醇溶液反复洗脱,至洗脱液中无模板分子,再使用甲醇进行清洗,至清洗液中无杂质,再在温度为50℃~70℃下进行干燥9h~15h,得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物。
本实施方式步骤三中使用质量分数为5%~20%乙酸甲醇溶液反复洗脱,至洗脱液中无模板分子,是通过高效液相色谱对洗脱液进行分析,检测不到洗脱液中有模板分子,证明已经使用质量分数为5%~20%乙酸甲醇溶液将模板分子去除。
本实施方式步骤三中使用甲醇进行清洗,至清洗液中无杂质,是通过高效液相色谱对清洗液进行分析,无杂质峰,证明已经使用甲醇去除杂质。
本实施方式的优点:
一、本实施方式首次选择两种β-受体激动剂类物质作为复合模板,以甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂,在甲醇乙腈混合溶液采用本体聚合的方式合成了具有“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球;
二、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物是一种具有与模板分子结构相匹配的空间孔穴结构的高分子聚合物,能够选择性识别与模板分子结构类似的PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质,具有良好的“类”特异性;
三、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物制备步骤简单、成本低、所用化学试剂少,符合当前环保的要求;
四、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物在制备过程中采用了双模板分子,将其作为填料制备分子印迹固相萃取柱,可以解决当前通用型固相萃取柱选择性差、基质效应大的问题,还可以解决当前β-受体激动剂分子印迹固相萃取柱吸附物质少的问题,能够选择性净化、富集样品中的痕量β-受体激动剂类物质,对PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质的回收率为61.2%~80.4%,符合痕量残留检测的要求;
五、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用是作为固相萃取柱的填料,与通用型固相萃取柱相比,该分子印迹固相萃取柱的前处理过程简单、富集净化的效果好,有机试剂使用量少,经济环保。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同点是:步骤一中所述的功能单体为甲基丙烯酸。其他步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是:步骤一中所述的复合模板为苯乙醇胺A和克伦特罗的混合物;所述的苯乙醇胺A与克伦特罗的摩尔比为(1~1.5):1。其他步骤与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是:步骤一中所述的有机溶剂为甲醇和乙腈的混合液;所述的甲醇与乙腈的体积比为为1:20。其他步骤与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是:步骤一中所述的震荡器的震荡频率为130Hz。其他步骤与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是:步骤二中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。其他步骤与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是:步骤二中所述的引发剂为偶氮二异丁腈。其他步骤与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八:本实施方式是一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用是作为固相萃取柱的填料,富集净化样品中的痕量β-受体激动类物质;
β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用具体是按以下步骤完成的:
首先将β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物加入到乙腈中,再在固相萃取空柱中装入筛板后,再将β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物和乙腈的混合液填装到固相萃取空柱中,待乙腈自然流干后,再将筛板放到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物上方,使用装柱工具β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物压紧,然后通过真空泵将剩余溶液吸干,然后再依次使用甲醇、水和pH值为6.5的乙酸铵缓冲溶液活化β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物,上样液的溶剂为甲醇;然后使用水、甲醇和质量分数为0.1%的乙酸甲醇溶液进行淋洗,最后用15%乙酸乙腈溶液对β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物进行洗脱,将洗脱液氮气吹干后用流动相溶解,再使用HPLC-MS/MS进行检测;
所述的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的质量与乙腈的体积比为5mg:1mL。
本实施方式的优点:
一、本实施方式首次选择两种β-受体激动剂类物质作为复合模板,以甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂,在甲醇乙腈混合溶液采用本体聚合的方式合成了具有“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球;
二、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物是一种具有与模板分子结构相匹配的空间孔穴结构的高分子聚合物,能够选择性识别与模板分子结构类似的PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质,具有良好的“类”特异性;
三、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物制备步骤简单、成本低、所用化学试剂少,符合当前环保的要求;
四、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物在制备过程中采用了双模板分子,将其作为填料制备分子印迹固相萃取柱,可以解决当前通用型固相萃取柱选择性差、基质效应大的问题,还可以解决当前β-受体激动剂分子印迹固相萃取柱吸附物质少的问题,能够选择性净化、富集样品中的痕量β-受体激动剂类物质,对PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质的回收率为61.2%~80.4%,符合痕量残留检测的要求;
五、本实施方式的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用是作为固相萃取柱的填料,与通用型固相萃取柱相比,该分子印迹固相萃取柱的前处理过程简单、富集净化的效果好,有机试剂使用量少,经济环保。
采用以下试验验证本发明的有益效果:
试验一:一种β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的制备方法,具体是按以下步骤完成的:
一、制备复合模板剂/功能单体混合液:将复合模板溶解到有机溶剂中,再加入功能单体,再使用震荡器震荡4h,得到复合模板剂/功能单体混合液;
步骤一中所述的功能单体为甲基丙烯酸;
步骤一中所述的复合模板为苯乙醇胺A和克伦特罗的混合物;所述的苯乙醇胺A与克伦特罗的摩尔比为1.5:1;
步骤一中所述的有机溶剂为甲醇和乙腈的混合液;所述的甲醇与乙腈的体积比为为1:20;
步骤一中所述的震荡器的震荡频率为130Hz;
步骤一中所述的复合模板与功能单体的摩尔比为1:4;
步骤一中所述的复合模板的物质的量与有机溶剂的体积比为1g:240mL;
二、加入交联剂和引发剂:向复合模板剂/功能单体混合液中加入交联剂和引发剂,再在超声功率为100W的条件下超声分散5min,再在氮气气氛下和温度为50℃下水浴反应24h,得到聚合物A;
步骤二中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯;
步骤二中所述的引发剂为偶氮二异丁腈;
步骤二中所述的交联剂与复合模板剂/功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为5:1;
步骤二中所述的引发剂与复合模板剂/功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为18mg:1mmol;
三、研磨、筛分:将聚合物A进行研磨,再使用300目的筛子进行筛分,得到粒径小于48μm的聚合物;再使用质量分数为10%乙酸甲醇溶液反复洗脱,至洗脱液中无模板分子,再使用甲醇进行清洗,至清洗液中无杂质,再在温度为60℃下进行干燥12h,得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物。
使用扫描电子显微镜对试验一制备的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物进行测试,如图1所示,图1为图1为试验一制备的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的扫描电子显微镜图。从图1可以看出,试验一制备的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物为圆形微球,且形貌规则,其粒径主要分布在10μm~20μm,适合用于固相萃取材料。
试验二:非印迹聚合物的制备方法是按以下步骤完成的:
一、制备功能单体混合液:将功能单体加入到有机溶剂中,再使用震荡器震荡4h,得到功能单体混合液;
步骤一中所述的功能单体为甲基丙烯酸;
步骤一中所述的有机溶剂为甲醇和乙腈的混合液;所述的甲醇与乙腈的体积比为为1:20;
步骤一中所述的震荡器的震荡频率为130Hz;
步骤一中所述的功能单体的物质的量与有机溶剂的体积比为1mmol:20mL;
二、加入交联剂和引发剂:向功能单体混合液中加入交联剂和引发剂,再在超声功率为100W的条件下超声分散5min,再在氮气气氛下和温度为50℃下水浴反应24h,得到聚合物A;
步骤二中所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯;
步骤二中所述的引发剂为偶氮二异丁腈;
步骤二中所述的交联剂与功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为5:1;
步骤二中所述的引发剂与功能单体混合液中的功能单体的摩尔比为18mg:1mmol;
三、研磨、筛分:将聚合物A进行研磨,再使用300目的筛子进行筛分,得到粒径小于48μm的聚合物;再使用甲醇进行清洗,至清洗液中无杂质,再在温度为60℃下进行干燥12h,得到非印迹聚合物。
分别称取10mg试验一中得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物和10mg试验二中得到的非印迹聚合物分别置于10mL试管中;再将2mLβ-受体激动剂混标溶液加入到装有试验一中得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的试管中,所述的β-受体激动剂混标溶液由PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL组成,且PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL的浓度均为0.2ug/mL,再将试管在室温下和振荡频率为140W下振荡吸附6h,再进行离心,取离心后的上清液,再过0.45μm滤膜,测定其吸附后溶液平衡浓度,计算其平衡吸附量。
将2mLβ-受体激动剂混标溶液加入到装有试验二中得到的非印迹聚合物的试管中,所述的所述的β-受体激动剂混标溶液由PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL组成,且PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL的浓度均为0.2ug/mL,再将试管在室温下和振荡频率为140W下振荡吸附6h,再进行离心,取离心后的上清液,再过0.45μm滤膜,测定其吸附后溶液平衡浓度,计算其平衡吸附量。
试验一中得到的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物MIP和试验二得到的非印迹聚合物NIP对苯乙醇胺A(PEA)、莱克多巴胺(RAC)、克伦特罗(CL)、西马特罗(SMT)、马布特罗(MBT)、美托洛尔(MET)和沙丁胺醇(SAL)这七种β-受体激动剂类物质的吸附效果如图2所示,图2为试验一制备的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物MIP和非印迹聚合物NIP对七种β-受体激动剂类物质的吸附效果柱状图,图中1为MIP,2为NIP;从图2可以看出,试验一中得到的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物MIP对PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质的吸附量均高于试验二得到的非印迹聚合物,说明试验一中得到的β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物MIP对PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质的吸附属于特异性吸附;同时还可以看出,MIP对PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质的吸附量是不同的,吸附量从大到小分别为CL、PEA、RAC、SMT、MBT、SAL、MET;该结果为β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物作为固相萃取的填料净化、富集PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七种β-受体激动剂类物质提供依据。
试验三:试验一得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物的应用:
首先将30mg试验一得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物加入到6mL的乙腈中,再在固相萃取空柱中装入筛板后,再将试验一得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物和乙腈的混合液填装到3mL固相萃取空柱中,待乙腈自然流干后,再将筛板放到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物上方,使用装柱工具β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物压紧,然后通过真空泵将剩余溶液吸干,然后再依次使用2mL甲醇、2mL水和1mL pH值为6.5的乙酸铵缓冲溶液活化试验一得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物,上样液的溶剂为甲醇;然后使用1mL水、1mL甲醇和1mL质量分数为0.1%的乙酸甲醇溶液进行淋洗,最后用3mL 15%乙酸乙腈溶液对试验一得到β-受体激动剂复合模板分子印迹聚合物进行洗脱,将洗脱液氮气吹干后用流动相溶解,HPLC-MS/MS进行检测。
使用试验三得到的β-受体激动剂复合模板分子印迹固相萃取柱按照上述方法对猪尿液中PEA、RAC、CL、SMT、MBT、MET和SAL这七中β-受体激动剂类物质进行净化、富集,回收率结果如表1所示。从表1可知在添加水平为0.25ng/mL和1ng/mL时,试验一得到的β-受体激动剂复合模板分子印迹固相萃取柱对7种β-受体激动剂类物质的回收率为61.2%~80.4%,相对标准偏差(RSD)小于13%,满足β-受体激动剂残留检测的要求。
表1