CN104569325A

CN104569325A - 用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法

Info

Publication number: CN104569325A
Application number: CN201410829545.3A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 彭大鹏; 魏娜娜; 王玉莲; 陈冬梅; 陶燕飞; 刘振利
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104569325B

Abstract

本发明公开了一种检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC？NO:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC？NO:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，所述芯片固定了阿米卡星包被原和西索霉素包被原。本发明还公开了一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，该方法可以同时检测5种氨基糖苷类抗生素，从而为食品中的氨基糖苷类抗生素残留检测提供了一个快速、灵敏、高通量的方法，具有准确度高，精密度好、效率高等特点。

Description

用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物芯片技术领域，尤其涉及一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒及方法。

背景技术

氨基糖苷类抗生素抗菌谱广，尤其是对革兰氏阴性菌有强大杀灭作用，在兽医临床上常用于治疗细菌感染，细菌性肠炎和乳腺炎。在畜牧养殖中，也被添加到饲料中用于预防和促生长。不合理用药导致药物在动物可食性组织中蓄积，人食用之后，出现前庭功能障碍和耳蜗听神经损伤、肾功能降低、甚至呼吸停止，直接危害人类的健康。因此我国对氨基糖苷类抗生素规定了最高残留限量(MRL)，规定新霉素在牛奶和猪肌肉中MRL为500μg/kg，庆大霉素在牛奶的MRL为200μg/kg，猪肌肉的MRL为100μg/kg。

目前，氨基糖苷类抗生素的检测方法主要有微生物法、胶体金试纸条、仪器分析法以及Elisa。微生物法和胶体金试纸条准确度和特异性较差，只能作为筛选方法。仪器分析法依赖昂贵的设备，需要专业人员操作，不便于推广。Elisa具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优势，是目前最广泛应用的检测方法，但仅能检测单一组分，通量有待提高。近年来发展迅速的抗体芯片检测技术既具有Elisa的优势，又具备芯片技术高通量、低成本、高平行、微型化和极高的灵敏度等特点，非常适合用于大量样本中多种药物的同时检测。

CN 102585006A公开了一种用于检测新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单抗和酶联免疫方法与试剂盒；CN 102608319A公开了一种用于检测庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒，以上两个发明不能同时检测以上五种氨基糖苷类抗生素，而且检测灵敏度较低，前者对新霉素在猪肌肉中的最低检测限(LOD)为15.90μg/L，后者对庆大霉素在鸡肌肉中的最低检测限(LOD)为34.09μg/L。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒。

该试剂盒包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米卡星以及巴龙霉素；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，能识别庆大霉素和西索霉，所述芯片固定了阿米卡星包被原和西索霉素包被原，所述阿米卡星包被原是阿米卡星与卵清蛋白的偶联物，所述西索霉素包被原是西索霉素与卵清蛋白的偶联物。

所述的保藏号为CCTCC NO:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04已在本申请人于2012年2月27日申请的“用于检测新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单抗和酶联免疫方法与试剂盒”的发明专利中公开，公开号为102585006A，公开日为2012年7月18日。

所述的保藏号为CCTCC NO:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5已在本申请人于2012年2月27日申请的“用于检测庆大霉素和西索霉素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒”的发明专利中公开，公开号为102608319A，公开日为2012年7月25日。

优选地，所述的芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基片分成两排共12个反应区域，每个反应区域设四排三纵共12个微阵列，将阿米卡星包被原溶液、西索霉素包被原溶液，以及两种对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定0.5h，用2％(重量百分比)牛血清白蛋白溶液封闭0.5h。

优选地，所述阿米卡星包被原溶液的浓度为6μg/mL，所述西索霉素包被原溶液的浓度为32μg/mL，所述阿米卡星包被原溶液和西索霉素包被原溶液的溶剂是含5％(重量百分比)甘油的pH值为9.16的碳酸盐缓冲液。

优选地，所述微阵列上的点样顺序是从上到下，从左至右。

优选地，所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。

优选地，所述的提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取三氯乙酸3mL，超纯水稀释，定容至100mL；

本发明的第二个目的是提供所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，该方法包括以下步骤：

1)样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取；

2)将样品液和稀释好的抗体按1∶1的体积比混合后加入到固定了阿米卡星包被原溶液、西索霉素包被原溶液、以及对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液的芯片上，于37℃反应0.5h，洗涤3次，甩干；

3)将Cy3标记的二抗加到芯片，于37℃反应0.5h，洗涤3次，甩干；

4)用InnoScan 700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析。

所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米卡星以及巴龙霉素；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，能识别庆大霉素和西索霉；

所述阿米卡星包被原是阿米卡星与卵清蛋白的偶联物，所述西索霉素包被原是西索霉素与卵清蛋白的偶联物；

所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。

优选地，所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取三氯乙酸3mL，超纯水稀释，定容至100mL。

优选地，所述抗体是用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释的，其中新霉素单克隆抗体的稀释度为1:800，庆大霉毒单克隆抗体的稀释度为1:4000；所述阿米卡星包被原溶液的浓度为16μg/mL，所述庆大霉毒包被原溶液的浓度为20μg/mL，所述阿米卡星包被原溶液和庆大霉毒包被原溶液的溶剂是含有5％甘油的pH9.16的碳酸盐缓冲液。

本发明的有益效果是：

1)本发明的抗体芯片试剂盒可以同时检测5种氨基糖苷类抗生素——新霉素、阿米卡星、巴龙霉素、庆大霉素和西索霉，为食品中的氨基糖苷抗生素残留检测提供了一个快速、灵敏、高通量的方法，而现有的试剂盒无法同时检测以上药物。

2)本发明所建立的抗体芯片试剂盒和检测方法准确度高，精密度好、检测效率高。新霉素的IC₅₀为IC₅₀为1.87μg/L，庆大霉素的IC₅₀为10.40μg/L，对新霉素在猪肌肉中的最低检测限(LOD)为7.43μg/L，对庆大霉素在猪肌肉中的最低检测限(LOD)为10.96μg/L。

3)与现有的方法相比，不仅在检测药物的种类上具有明显的优势，而且可以节省大量的时间和成本，具有更好的市场应用价值。方法中所涉及的样品前处理方法简单，快速，所使用的有机溶剂为甲醇，对人体及环境危害较小。再者，本发明采用示踪物质是荧光物质，信号持续时间长。

附图说明

附图1是本发明的技术路线图。

附图2是基片优化的结果，图中1是不同基片相对荧光信号强度的比较，2是不同基片背景值的比较。

附图3是4种点样顺序以及点样顺序的优化结果，图中B、C、D、E是4种点样顺序，A是点样效果示意图，C是最优的点样顺序图。

附图4是点样溶液和封闭液的优化结果，图中1是不同缓冲溶液作为点样液的优化结果，2是不同pH的CBS作为点样液的优化结果，3是添加不同表面活性的固定效果的比较，4是封闭液的优化结果。

附图5是抗体稀释液和反应温度的优化结果，图中1是一抗稀释液的优化结果，2是二抗稀释液的优化结果，3是反应温的优化结果。

附图6是制备抗体芯片过程中各时间的优化结果，图中1是固定时间的优化结果，2是封闭时间的优化结果，3是一抗反应时间的优化结果，4是二抗反应时间的优化结果。

附图7是本发明采用的固相载体以及分区示意图，图中1：玻片；2：晶芯高分子基片G修饰物；3：12个分区围栏。

附图8是绘制的标准曲线，图中N：新霉素，GM：庆大霉素。

附图9是抗体芯片的37℃加速稳定性实验结果，图中N：新霉素，GM：庆大霉素。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1氨基糖苷类包被原的合成

1)阿米卡星包被原的合成

称取阿米卡星148.0mg和OVA240.0mg溶解在12mL纯水中(pH7.4)，搅拌均匀，然后逐滴加入溶解在4mL纯水中的EDC430.00mg，室温下搅拌反应8小时。最后该反应液转入透析袋中，在PBS液(pH7.4)中4℃透析4天。离心后冷冻干燥，置-20℃保存备用。

2)西索霉素包被原的合成

称取西索霉素20.0mg和OVA200.0mg溶解在20mL PBS液(pH7.4)，搅拌均匀，然后缓慢加入溶解在1mL纯水中的80.00mgEDC。在室温下搅拌反应2小时。最后将反应液转入透析袋中，在PBS(pH7.4)液中4℃透析4天。离心后冷冻干燥，置-20℃保存备用。

实施例2芯片参数的选择

1)基片的选择：分别在多聚赖氨酸玻片，正电荷玻片，晶芯高分子基片G、醛基基片、琼脂糖修饰玻片上点0.5μg/mL Cy3-OVA，用InnoScan 700A扫描仪扫描并储存数据，结果见附图2。从图2-1可以明显看到高分子基片G的相对荧光信号强度最高，表明高分子基片G对我们的样品的吸附性最好；从图2-2可以看出其背景值低于醛基的背景值。综合考虑吸附性和背景值两方面因素，最终选择商业化的晶芯高分子基片G作为基片。

2)不同点样顺序的选择：分别按照以下四种方式：B为从右至左，从下向上；C为从左至右，从上向下；D为从左到右，从上向下，先点第一排反应区域，再点第二排反应区域；E为从右到左，从下向上，先点第二排反应区域，再点第一排反应区域，各点样方式的示意图见附图3，1为最终点样效果。结果显示，相对于其他方式，方式3的相对荧光信号值基本处于稳定状态，变异系数最小(7.96％)，说明该方式点出的点均一性较好，所以选用方式C作为最优的芯片点样方式。

3)点样稀释液的选择：选用pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、pH 9.6碳酸盐缓冲溶液(CBS)、pH 7.4Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)、含10％(重量百分比，下同)甘油的pH 7.4PBS(PBS+10％G)、含10％甘油的pH 9.6CBS(CBS+10％G)、含10％甘油的pH 7.4TBS(TBS+10％G)分别作为点样液配制10μg/mL氨基糖苷包被原溶液进行点样，制备芯片，结果见附图4-1。可以看出用CBS+10％G、CBS作为点样液的相对荧光信号强度明显高于其他点样液的，所以初步选用CBS为晶芯高分子基片G的点样溶液；对CBS的pH进行了优化，结果如附图4-2所示，可以显示随着CBS pH值的增大，荧光信号强度呈现降低趋势，说明用pH9.16的CBS作为点样液比较好；考察了不同表面活性剂对固定效果的影响，结果见附图4-3，可以看出用含0.5％Trehalose、不加表面活性剂和含1.5％Mannitol的相对荧光信号强度基本差不多，都比其他的高，所以拟选用pH9.16CBS作为点样液，同时考虑到低浓度甘油(5％-10％)可以减少样品点的挥发，稳定点形，所以选用含5％甘油的pH 9.16CBS作为点样液。

4)固定时间的选择：分别将固定时间设置为0.5、1、2、4、6h，根据相对荧光信号强度筛出合适的固定时间，结果见附图6-1，可以看出随着固定时间的延长，相对荧光信号强度急剧下降，所以选用0.5h作为固定时间。

5)封闭液的选择：选用2％(重量百分比，下同)卵清蛋白(OVA)、2％牛血清白蛋白(BSA)、25％胎牛血清(FCS)分别作为封闭液进行筛选，结果见附图4-4，可以看出2％BSA为封闭液时相对荧光信号强度高于其他两个，所以选用2％BSA为封闭液。

6)封闭时间的选择：分别将封闭时间设置为0.5、1、1.5、2h，根据相对荧光信号强度筛选出一个在较短时间内达到需要的信号强度的封闭时间，结果见附图6-2。可以看出随着封闭时间的延长，其相对荧光信号强度逐渐下降，所以选用0.5h作为封闭时间。

7)抗体稀释液的选择：用pH7.4PBS，pH7.4TBS，pH9.6CBS三种常用缓冲溶液分别作为一抗和二抗稀释液，结果见附图5-1和2，可知pH7.4PBS作为抗体稀释液时的相对荧光信号强度最高，说明在pH7.4PBS的环境下抗原抗体反应较好，所以选用pH7.4PBS作为抗体稀释液。

8)反应温度的选择：分别在4、25、37℃下进行抗原抗体反应，结果见附图5-3，可以明显看出在37℃抗原抗体反应才能进行得较彻底，所以选取37℃作为反应温度。

9)反应时间的选择：分别将抗原抗体反应时间设置为0.5、1、1.5、2、3h，根据相对荧光信号强度筛出合适的抗体反应时间。附图6-3是一抗反应时间测优化结果，可知一抗反应时间为1.5h时其信号强度较高，说明抗原抗体反应在1.5h时达到最佳状态。考虑到芯片作为一种快速检测方法，选用0.5h作为一抗反应时间，并将通过点样浓度和抗体稀释度优化相对荧光信号强度。附图6-3是二抗反应时间测优化结果，可以看出相对荧光信号强度大致随着二抗反应时间的延长而增强，但是增强的不是很明显，所以最终选0.5h作为二抗反应时间。

实施例3抗体芯片的制备

1)考核所用的两种氨基糖苷类包被原和单克隆抗体

按ELSlA操作流程测定抗体的效价，将包被原用碳酸盐缓冲液稀释成一系列工作浓度，4℃包被过夜，甩出包被液，每孔加250μL洗涤液，静置30秒后，甩出洗涤液，拍干，重复洗涤3次，拍干，每孔加250μL封闭液，置37℃湿盒封闭1h，甩出封闭液后洗涤3次，拍干。将抗体稀释成1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，每孔加入50μLPBS，50μL稀释一系列浓度的抗体，37℃湿盒孵育30min，甩出孔内液体后洗涤3次，拍干，将HRP标记羊抗鼠二抗用缓冲液稀释成工作浓度1:5000，100μL/孔，37℃湿盒孵育30min，甩出孔内液体后洗涤3次，拍干，加底物液100μL/孔，37℃湿盒孵育15min，每孔加50μL终止液，用酶标仪测OD_450nm值，以"0"孔OD_450nm值接近2.0，对应的抗体稀释度定义为抗体的效价。

间接竞争ELISA法与间接ELISA法的程序基本相同，只是在加入抗体时应当先加入相应的药物50μL，然后再加入稀释的抗体50μL，37℃湿盒孵育30min。获得新霉素的IC50为5.1μg/L，线性范围为1-8μg/L。庆大霉素的IC50为24.43μg/L，线性范围为5-80μg/L。灵敏度完全达到国家兽药残留检测方法要求，也很适合制备抗体芯片。

2)包被原和抗体浓度的优化

包被原浓度的选择：将新霉素包被浓度从左到右设置为2、4、8、16、32、64μg/mL 6个浓度，从右到左依次加1:3200、1:1600、1:800、1:400、1:200、1:100的新霉素单克隆抗体进行优化，结果发现当新霉素包被液为16μg/mL时，新霉素单克隆抗体稀释度1:400时的信号强度在1.2万左右，与其前后左右的信号强度相差较大，所以选16μg/mL为阿米卡星包被原溶液的浓度，初步确定抗体稀释度为1:400。

最佳抗体稀释度的确定：以选定的包被原浓度制备新霉素抗体芯片，从左到右依次添加1:100、1:200、1:400、1:800新霉素单克隆抗体进行反应，结果发现随着抗体稀释度的增加，相对荧光信号强度明显下降。抗体稀释度为1:400时，绘制得到标准曲线，得到IC₅₀为4.34μg/L，低于ELISA方法IC₅₀的5.09μg/L；抗体稀释度为1:800时，绘制得到标准曲线，得到计算IC₅₀为1.64μg/L，远远低于ELISA方法的IC₅₀，所以新霉素单克隆抗体最佳稀释度为1:800。以上两条标准曲线的范围均为1.25-20μg/L，但相关系数都达不到0.99，所以调整标准曲线范围为0.625-10μg/L。

同理优化了西索霉素包被原和庆大霉素单克隆抗体浓度，结果得到最佳西索霉素包被原溶液的浓度为20μg/mL，最佳庆大霉素单克隆抗体的稀释度为1:4000。

3)点制氨基糖苷类抗体芯片

将载体用围栏分成12(2×6)个反应区域如附图7所示。分别用AD3200点样仪把1％OVA溶液、16μg/mL阿米卡星包被原溶液、20μg/mL西索霉素包被原溶液、Cy3-OVA溶液在每个区域进行点样，20nL/点，每个区域形成1个3×4的点阵。将点样后的芯片置于密闭的湿盒中，置于37℃恒温箱中固定0.5h。将芯片放入含PBST(量以淹没玻片为准)洗涤管中，用摇床振摇/手动摇洗2min，重复三次，再放入含ddH₂O(以淹没玻片为准)洗涤管中用摇床振摇/手动摇洗2min，重复三次，最后将玻片以2000r/min转速4℃离心1min。然后加入20μL/孔2％BSA封闭液，放入密闭的湿盒中，置于37℃恒温箱封闭0.5h，洗涤后，37℃烘干5min，抽真空封装存于4℃备用。

实施例4氨基糖苷类抗体芯片的性能考核

1)标准曲线的建立

配制氨基糖苷类混合抗体(1:800新霉素抗体和1:4000庆大霉素抗体)，用PBS将新霉素和庆大霉素标准品配制成6个浓度的混合标准溶液(0.625-10μg/L新霉素标准溶液，2.5-40μg/L庆大霉素标准溶液)。分别将10μL混合药物和10μL混合抗体加到芯片上，反应0.5小时，使固定的人工抗原充分与样品中的药物共同竞争特异性抗体，洗涤，离心甩干。加入20μL 1:200稀释的Cy3标记羊抗小鼠IgG，反应0.5小时。洗涤，离心甩干。将甩干的芯片使用InnoScan700A扫描仪进行扫描，用Mapix分析软件进行分析。以竞争物浓度的对数值为横坐标、对应的抑制率F/F₀为纵坐标，绘制标准曲线，见附图8得到回归方程及相关系数，根据回归方程计算IC₅₀。得到新霉素的IC₅₀为IC₅₀为1.87μg/L，线性范围为0.625-10μg/L，庆大霉素的IC₅₀为10.40μg/L，线性范围为2.5-40μg/L。相同方法，重复测定5批，求出IC₅₀平均值，并计算片内与片间变异系数，得到片内片间变异系数均小于15％，说明重复性良好。

2)灵敏度

测定20份0μg/L竞争物标准溶液，将F值分别代入标准曲线回归方程计算对应浓度值，求20份测定浓度值的平均值()和标准差(SD)。根据公式计算Z值，作为抗体芯片检测方法灵敏度的判定指标。得到氨基糖苷类抗体芯片检测方法新霉素的灵敏度为0.55μg/L，庆大霉素的灵敏度为5.22μg/L，远远低于各自的最大残留限量。

3)特异性

分别将氨基糖苷类及其结构类似物标准品倍比稀释成一系列浓度绘制标准曲线，计算IC₅₀值，与标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率。结果见表1，该抗体芯片能够很好地识别新霉素、阿米卡星，巴龙霉素以及庆大霉素，对西索霉素也有一定识别。

表1 氨基糖苷类抗体芯片的交叉反应率结果

4)稳定性研究

抗体芯片的37℃稳定性实验：将制备好的氨基糖苷类抗体芯片，进行37℃加速试验(阿伦尼乌斯定律)。分别于加速第0、2、4、6、8天取出抗体芯片采用间接竞争法检测，绘制标准曲线，计算IC50值。将加速试验的“0”孔相对荧光信号强度值及IC50值与0天的试验结果进行对比，若“0”孔相对荧光信号强度值明显下降(超过50％)，或IC₅₀值明显升高(超过1倍)，则判定抗体芯片的生物活性已下降一半，抗体芯片将不能再用，“0”孔相对荧光信号强度值和IC₅₀值在可变范围内的这段时间即为抗体芯片的保质期(农医发[2005]17号，2005)。结果见附图9，由图可知“0”孔的相对荧光信号强度值在37℃加速试验的第8天仍保持在F0的60％以上，IC50值在±20％的范围内浮动。表明抗体芯片在4℃至少可以保存6个月。

5)样品前处理方法

提取试剂：准确吸取三氯乙酸3mL，少量超纯水稀释，定容至100mL。

稀释液：准确称取NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄1.44g，KCl 0.20g，加超纯水定容至1000mL，上下颠倒混匀，用1mol/L NaOH调pH到8.0左右。

新霉素牛奶样品处理方法：量取牛奶样品2mL于4mL离心管中，涡旋2min后，取部分牛奶用提取试剂稀释6倍，12000r/min，4℃离心10min，除去上层脂肪颗粒和下层蛋白后，取中间液体，用稀释液稀释10倍，即可上样。

新霉素猪肉样品处理方法：称取匀浆肌肉样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入提取试剂12mL，震荡10min使之混匀，6000r/min，4℃离心5min，用稀释液稀释10倍后上样检测。

庆大霉素牛奶样品处理方法：量取牛奶样品2mL于4mL离心管中，涡旋2min后，取部分牛奶用提取试剂稀释5倍，12000r/min，4℃离心10min，除去上层脂肪颗粒和下层蛋白后，取中间液体，用1mol/L NaOH调pH到7.4左右，即可上样。

庆大霉素猪肉样品处理方法：称取匀浆肌肉样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入提取试剂10mL，震荡10min使之混匀，6000r/min离心5min，除去上层脂肪颗粒和下层蛋白后，取中间液体，用1mol/L NaOH调pH到7.4左右，即可上样。

6)氨基糖苷类抗体芯片检测步骤

采用间接竞争法用基糖苷类抗体芯片检测样品。将10μL提取液和10μL混合抗体加到芯片上，反应0.5小时，使固定的人工抗原充分与样品中的药物共同竞争特异性抗体，洗涤，离心甩干，加入20μL 1:200稀释的Cy3标记羊抗小鼠IgG，反应0.5小时。洗涤，离心甩干。将甩干的芯片使用InnoScan 700A扫描仪进行扫描，用Mapix分析软件进行分析。

7)最低检测限和定量限

取经仪器检测为阴性的待测组织(猪肉和牛奶)样品各20份，经上述样品前处理方法处理后，采用间接竞争法检测，测定F值，计算空白样品F₀值的平均值()。将代入标准曲线上查出对应的浓度(C)，并计算标准差(SD)。根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的最低检测限(LOD)。根据公式Q＝C+10×SD计算Q值，此即为组织方法的最低定量限(LOQ)。结果见表2，在猪肉和牛奶中的最低检测限和定量限在15μg/kg以下，低于MRL。

表2 组织样品中氨基糖苷类药物的最低检测限

8)回收率

取经仪器检测为阴性的待测组织(猪肉和牛奶)样品，添加最大残留限量要求的浓度，每个样品浓度设3个平行。样品处理后，采用间接竞争法测定药物浓度，重复3次，根据公式：计算回收率，并计算批内批间变异系数。结果(表3)显示，回收率在80％-110％之间，批内与批间变异系数＜9％，表明方法准确性好。

表3 氨基糖苷类药物牛奶和猪肉中添加回收率

Claims

1.一种用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，其特征在于：所述抗体由新霉素单克隆抗体和庆大霉素单克隆抗体组成，所述新霉素单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201144的杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的，能识别新霉素、阿米卡星以及巴龙霉素；所述庆大霉毒单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201145的杂交瘤细胞EDC/2D5所分泌的，能识别庆大霉素和西索霉素，所述芯片固定了阿米卡星包被原和西索霉素包被原，所述阿米卡星包被原是阿米卡星与卵清蛋白偶联物，所述西索霉素包被原是西索霉素与卵清蛋白偶联物。

2.如权利要求1所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于所述的芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基片分成两排共12个反应区域，每个反应区域设四排三纵共12个微阵列，将阿米卡星包被原溶液、西索霉素包被原溶液，以及两种对照溶液——卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液分别点样在其中一排微阵列上，点样完成后固定0.5h，用2％牛血清白蛋白溶液封闭0.5h。

3.如权利要求2所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述阿米卡星包被原溶液的浓度为16μg/mL，所述西索霉素包被原溶液的浓度为20μg/mL，所述阿米卡星包被原溶液和西索霉素包被原溶液的溶剂是含有5％甘油的pH9.16碳酸盐缓冲液。

4.如权利要求1所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。

5.如权利要求1所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片试剂盒，其特征在于所述的提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取三氯乙酸3mL，超纯水稀释，定容至100mL。

6.权利要求1-5任何一项所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的应用。

7.一种检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取；

4)用InnoScan 700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析，

所述Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。

8.如权利要求7所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于：所述提取试剂是按如下方法配制的：准确吸取三氯乙酸3mL，超纯水稀释，定容至100mL。

9.如权利要求7所述的用于检测食品中氨基糖苷类抗生素残留的抗体芯片方法，其特征在于：所述抗体是用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释的，其中新霉素单克隆抗体的稀释度为1:800，庆大霉毒单克隆抗体的稀释度为1:4000；所述阿米卡星包被原溶液的浓度为16μg/mL，所述西索霉素包被原溶液的浓度为20μg/mL，所述阿米卡星包被原溶液和西索霉素包被原溶液的溶剂是含有5％甘油的pH9.16的碳酸盐缓冲液。