CN107058241A - 一株分泌抗阿米卡星单克隆抗体杂交瘤细胞株ab2及其应用 - Google Patents

一株分泌抗阿米卡星单克隆抗体杂交瘤细胞株ab2及其应用 Download PDF

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Abstract

一株分泌抗阿米卡星单克隆抗体的杂交瘤细胞株AB2及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明抗阿米卡星单克隆抗体的杂交瘤细胞株AB2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13086。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对阿米卡星的IC50为0.65μg/L。对牛奶中阿米卡星的回收率范围为73.55%～ 84.61%，对鸡蛋中阿米卡星的回收率范围为 73.70%～105.75%. 为食品中阿米卡星残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗阿米卡星单克隆抗体杂交瘤细胞株AB2及其应用
技术领域
本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株AB2及其分泌的能识别阿米卡星的单克隆抗体，可用于食品中阿米卡星残留的检测，属于免疫化学技术领域。
背景技术
阿米卡星(Amikacin，AMK)是一种半合成的氨基糖苷类抗生素，由卡那霉素A衍生而来，也称为丁胺卡那霉素。与其他氨基糖苷类抗生素一样，阿米卡星也是通过与细菌的30S核糖体结合来阻断蛋白质的合成。
阿米卡星被用于人类和动物临床治疗，用来治疗革兰氏阴性菌感染。其突出的优点是对许多肠道革兰氏阴性杆菌所产生的氨基糖苷类钝化酶稳定，不会为此类酶钝化失去活性。阿米卡星广泛用于肾脏疾病的治疗，但是由于其潜在的毒性已经被控制使用剂量。在牛乳房炎的治疗中，需要足够长的休药期来避免牛奶中阿米卡星药物的残留。阿米卡星被报道过潜在的肾毒性和耳毒性，除此之外还会导致耐药性。所以，对动物养殖业中阿米卡星使用的监管，以及动物性食品中阿米卡星的残留监督十分重要。
在食品中药物残留的检测中，借助仪器分析的方法比较多。以前报道的食品中阿米卡星残留的检测主要运用的是毛细管电泳法和液相色谱方法。但是这些方法昂贵、耗时、需要专业的人员来操作。另外，阿米卡星和其他氨基糖苷类抗生素一样，其结构中没有发色团，挥发性很差，亲水性很强。这一特性使得直接依赖紫外吸收检测的高效液相色谱法十分复杂，因为要对阿米卡星进行衍生化获得一些有紫外吸收或者荧光吸收的基团。因此，食品中阿米卡星的检测需要一种更为快捷、高通量的检测方法来替代。
酶联免疫分析方法（ELISA）是一种半定量的、简单、灵敏、快捷和高通量的检测方法，对于食品中药物残留的检测有重要意义。之前有报道，在抗阿米卡星的多克隆抗体的基础来建立表面质子共振免疫分析方法和荧光偏振免疫分析方法，用来检测阿米卡星残留。但两个研究都没有提供具体的关于多克隆抗体制备的信息和其交叉反应率。另外也有关于抗阿米卡星多克隆抗体的研究。但目前没有抗阿米卡星单克隆抗体制备的报道。
发明内容
本发明的目的是开发针对阿米卡星的单克隆抗体，并在此基础上建立ELISA方法。此发明内容包括两个方面：单克隆抗体的制备和其应用。
抗阿米卡星单克隆抗体是通过小鼠免疫阿米卡星免疫原获得。免疫原通过戊二醛方法合成，包被通过碳二亚胺法合成。筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，将脾细胞与Sp2/0瘤细胞融合。融合后用间接ELISA方法检测细胞上清，筛选对阳性高且对阿米卡星抑制好的细胞进行亚克隆，进行三次亚克隆，获得纯的细胞株。将细胞株注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对阿米卡星的半数抑制浓度(IC50),以及对其结构类似物的IC50, 计算交叉反应率。将阿米卡星药物分别添加入牛奶和鸡蛋中，进行样本添加回收实验，计算回收率。
本发明的技术方案：一株分泌抗阿米卡星单克隆抗体的杂交瘤细胞株AB2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.13086。
抗阿米卡星单克隆抗体，由所述的保藏编号为CGMCC No.13086的抗阿米卡星单克隆抗体杂交瘤细胞株AB2分泌产生，其IC50为0.65 μg/L。
所述的抗阿米卡星单克隆抗体的应用，在于对食品中阿米卡星残留检测中的应用。
本发明的有益效果：采用间接竞争ELISA测定细胞株AB2分泌的单克隆抗体，对阿米卡星的IC50为0.65 μg/L。对牛奶和鸡蛋中阿米卡星的回收率范围分别为73.55 %～84.61%及73.70%～105.75%。为动物性食品中阿米卡星残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：单克隆细胞株AB2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13086，保藏日期2016年10月31日。
附图说明
图1 单克隆抗体AB2对阿米卡星的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1： 免疫原和包被原合成
免疫原通过戊二醛方法偶联：35 mg 阿米卡星溶解于 4 mL 0.01M PBS中，边搅拌边逐滴加入200μL 1% 戊二醛水溶液，活化15 min。20 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 2 mL0.01M PBS 中，将活化好的液体缓慢加入蛋白溶液中，4℃反应一小时。加入适量的硼氢化钠终止反应。 反应物用0.01M PBS 溶液透析三天。得到的免疫原储存在-20℃。包被原通过碳二亚胺法合成：10 mg 卵清白蛋白（OVA）溶解于 1 mL 0.1 M MES中，pH 4.7, 2 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 和 1.2 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 溶解于1 mL 0.05 M KH2PO4 中, pH 8.6。将EDC和NHS 的混合物加入蛋白溶液中，室温下活化反应2小时。20.85 mg 阿米卡星溶解于1 mL 0.05 M KH2PO4溶液中，将活化好的蛋白溶液缓慢加入阿米卡星溶液中，室温下反应3小时。反应液用0.01M PBSA 透析三天，得到的包被原储存于-20℃。
实施例 2：小鼠免疫
免疫原用生理盐水稀释到合适的浓度，再与等量的弗氏佐剂乳化，在6-8周龄的BALB/c小鼠的背上进行多点注射。首次免疫用的是弗氏完全佐剂，剂量为100μg。后面的四次加强免疫用的是弗氏不完全佐剂，免疫剂量为50μg，免疫间隔为21天。第三次免疫后，通过小鼠的尾静脉采血，并通过间接ELISA来检测血清。第五次免疫后筛选效价高抑制好的小鼠进行腹腔冲刺免疫，三天以后取出小鼠脾脏进行细胞融合。
实施例3：细胞融合与筛选
小鼠脾细胞和瘤细胞在PEG 1500的作用下融合形成杂交瘤细胞。融合后第七天进行检测，筛选效价高且对阿米卡星识别性好的细胞株进行亚克隆，以此类推，进行3次亚克隆获得纯的细胞株。
实施例4：单克隆抗体的纯化
筛选出的细胞株扩大培养后，注射进已经打过石蜡油的小鼠腹腔内，7到14天后可以从小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化，储存在-20℃。
实施例5：单克隆抗体的性质
抗体的灵敏度和特异性通过间接ELISA来测定。
1、单克隆抗体的交叉
将包被原AMK-EDC-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释，100 μL/孔，37℃反应2h。包被原浓度为（0.3μg/mL）和单克隆抗体浓度（0.5 μg/mL）通过棋盘法确定。将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液PBST洗涤3次，每次3min。拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。酶标板的每孔里加入50μL标准物溶液和50μL抗体，在37℃下培养30 min后洗涤三次后拍干，每孔加入1︰3000稀释二抗100μL，在37℃下培养30 min后洗涤4次后拍干，加入已配制好的TMB显色液100μL，37℃培养15min, 最后每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定在450nm处的吸光值。
单克隆抗体的交叉实验测定了其他的氨基糖苷类抗生素：卡那霉素(Kanamycin)、妥布霉素（Tobramycin）、庆大霉素(Gentamycin)、安普霉素(Apramycin)、巴龙霉素（Paromomycin）、林可霉素(Lincomycin) 新霉素(Neomycin)，大观霉素(Spectinomycin)和链霉素(Streptomycin)。交叉反应率为类似物的IC50与阿米卡星IC50的比值。其交叉实验如表1所示。
表1. 单克隆抗体AB2的交叉
2、添加回收实验
向阴性牛奶（Bovine Milk），鸡蛋(Whole Egg)中添加阿米卡星，用单克隆抗体进行检测，计算回收率。添加回收实验见表2。
表2. 添加回收实验
溶液配制：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12 H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株分泌抗阿米卡星单克隆抗体的杂交瘤细胞株AB2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13086。
2.抗阿米卡星单克隆抗体，其特征在于由所述保藏编号为CGMCC No.13086的抗阿米卡星单克隆抗体杂交瘤细胞株AB2分泌产生，其IC50为0.65μg/L。
3.权利要求2所述的抗阿米卡星单克隆抗体的应用，其特征在于对食品中阿米卡星残留检测中的应用。
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