CN106967688A - 一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体杂交瘤细胞wxx‑1及其应用 - Google Patents

一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体杂交瘤细胞wxx‑1及其应用 Download PDF

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Abstract

一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株WXX‑1及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的单克隆细胞株WXX‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13088。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对洛美沙星、诺氟沙星、依诺沙星的IC50分别为0.19μg/L、0.17μg/L、0.23μg/L。对牛奶中洛美沙星、诺氟沙星、依诺沙星的回收率范围分别为98.02%～107.40%、92.17%～105.55%和92.47%～105.52%。为食品中喹诺酮类抗生素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体杂交瘤细胞WXX-1及其应用
技术领域
本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株WXX-1及其分泌的能识别洛美沙星、诺氟沙星、依诺沙星的单克隆抗体，可用于食品中喹诺酮类抗生素残留的检测，属于免疫化学技术领域。
背景技术
洛美沙星（LOM）、诺氟沙星（NOR）和依诺沙星（ENO）都属于喹诺酮类抗生素。洛美沙星属于第三代喹诺酮类抗菌药，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌的抗菌活性与诺氟沙星相同，强于依诺沙星；对革兰氏阴性菌的作用与依诺沙星相同，较诺氟沙星较弱。洛美沙星被广泛用于畜牧养殖业和水产养殖业。然而，由于喹诺酮类抗生素在养殖业中的滥用，导致了动物性食品中喹诺酮类抗生素的残留。动物性食品中的喹诺酮类抗生素残留不仅会导致光毒性，也会导致耐药性的产生，严重威胁人们的健康。中国农业部已经禁止洛美沙星在养殖业中的使用。因此需要高灵敏，高通量的检测技术来实现监管。
对于喹诺酮类抗生素残留的检测，应用最多的是高效液相色谱法或者是液相色谱串联质谱法，也有毛细管电泳法。这些检测方法十分灵敏和准确。但是，这些方法都依赖于昂贵的仪器设备，并且需要专业人员来操作。另外这些方法，需要复杂的样本前处理，很耗时。因此，一种既灵敏又简便的分析方法对食品中喹诺酮类抗生素残留的检测意义非凡。酶联免疫吸附方法（ELISA）的出现加速了食品安全快速检测技术的发展进程。此方法具有简便、灵敏、高通量和便宜等优点，可以作为食品安全检测领域里大批量样本的定点筛选。
发明内容
本发明的目的就是开发针对洛美沙星的单克隆抗体，并在此基础上建立ELISA方法。此发明内容包括两个方面：单克隆抗体的制备和其应用
抗洛美沙星单克隆抗体是通过对小鼠免疫洛美沙星免疫原获得。免疫原通过2, 2′-（亚乙二氧基）二乙胺（2, 2′-Ethylenedioxy-bis-ethylamine，EDEA）方法合成，包被原通过碳二亚胺法合成。
免疫原合成路线为：
筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，进行细胞融合。融合检测后筛选阳性高且对洛美沙星抑制好的细胞株进行三次亚克隆，获得纯的细胞株。将细胞株注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对洛美沙星结构类似物的识别性，计算交叉反应率。进行样本添加回收实验，计算回收率。
本发明的技术方案：一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株WXX-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13088。
抗洛美沙星单克隆抗体，由所述的保藏编号为CGMCC No.13088杂交瘤细胞株WXX-1分泌产生，其IC50为0.19 μg/L。
所述的抗洛美沙星单克隆抗体的应用，在于对食品中洛美沙星残留检测中的应用。
本发明的有益效果：该细胞株WXX-1分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对洛美沙星，诺氟沙星及依诺沙星的IC50分别为0.19μg/L，0.17μg/L及 0.23μg/L。对牛奶中洛美沙星，诺氟沙星和依诺沙星的回收率范围为98.02%～107.40%、92.17%～105.55%和92.47%～105.52%. 为动物性食品中这三种喹诺酮类抗生素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株WXX-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为CGMCC No.13088。
附图说明
图1.单克隆细胞株WXX-1分泌的单克隆抗体对洛美沙星，诺氟沙星和依诺沙星的标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1： 免疫原和包被原合成
免疫原的合成：首先，将牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）用EDEA进行阳离子化。将200mg BSA和14mg EDEA 溶解于10 mL PBS 中，将其pH值调至6.5；将18.2mg碳二亚胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC）溶解于200 μL PBS中，将其缓慢滴加进BSA溶液中，pH调至 7.5，室温下搅拌2h。透析除去未与BSA相连的EDEA，得到BSA-EDEA。
BSA-EDEA也是通过碳二亚胺法与洛美沙星小分子进行偶联。将10mg 洛美沙星，15mg EDC, 9mg N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)溶解于5mL 0.05M MES中，pH 4.7，室温下搅拌反应6h。然后将活化好的溶液缓慢滴加至EDEA-BSA溶液中（0.3μmolEDEA-BSA溶解于10mL、0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液中），室温下反应3h。反应结束的反应液透析三天获得纯的免疫原。
包被原的合成过程与免疫原的合成过程类似，将载体蛋白换成卵清白蛋白（Ovalbumin, OVA）。
实施例2： 小鼠免疫
免疫原用生理盐水稀释到合适的浓度，再与等体积的弗氏佐剂乳化，在6-8周龄的BALB/c小鼠的背上进行多点注射。首次免疫用的是弗氏完全佐剂，剂量为100μg。后面的四次加强免疫用的是弗氏不完全佐剂，免疫剂量为50μg，免疫间隔为21天。第三次免疫后，通过小鼠的尾静脉采血，并通过间接ELISA来检测血清。第五次免疫后筛选效价高抑制好的小鼠进行腹腔冲刺免疫，三天以后取出小鼠脾脏进行细胞融合。
实施例3：细胞融合与筛选
小鼠脾细胞和瘤细胞在PEG 1500的作用下融合形成杂交瘤细胞。融合后第七天进行检测，筛选效价高且对洛美沙星识别性好的细胞株进行亚克隆，以此类推，进行5次亚克隆获得纯的细胞株。
实施例4：单克隆抗体的纯化
筛选出的细胞株扩大培养后，注射进已经打过石蜡油的小鼠腹腔内，7到14天后可以从小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化，储存在-20℃。
实施例5：单克隆抗体的性质
抗体的灵敏度和特异性通过间接ELISA来测定。
1、单克隆抗体的交叉
将包被原用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释，100 μL/孔，37℃反应2h。包被原浓度为0.3（μg/mL）和单克隆抗体浓度（0.5 μg/mL）通过棋盘法确定。将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液PBST洗涤3次，每次3min。拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。酶标板的每孔里加入50μL标准物溶液和50μL抗体，在37℃下培养30 min后洗涤三次后拍干，每孔加入1︰3000稀释二抗100μL，在37℃下培养30 min后洗涤4次后拍干，加入已配制好的TMB显色液100μL，37℃培养15min, 最后每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定在450nm处的吸光值。
单克隆抗体的交叉实验测定了其他的喹诺酮类抗生素：诺氟沙星（Norfloxaxin），依诺沙星（Enoxaxin），环丙沙星(Ciprofloxaxin)，氧氟沙星(Ofloxaxine)，氟罗沙星(Fleroxaxine)，培氟沙星(Pefloxaxine)以及剩下的喹诺酮类抗生素（西诺沙星，沙拉沙星，加替沙星，贝西沙星，加雷沙星，吉米沙星，萘啶酸，那地沙星，恶喹酸，帕珠沙星，吡哌酸和曲伐沙星）。交叉反应率为类似物的IC50与洛美沙星IC50的比值。其交叉实验如表1所示。
表1. 单克隆细胞株3B8分泌的单克隆抗体的交叉反应率
2、添加回收实验
向阴性牛奶（Bovine Milk），中分别添加洛美沙星，诺氟沙星和依诺沙星，用单克隆抗体进行检测，计算回收率。添加回收实验见表2。
表2. 单克隆细胞株3B8分泌的单克隆抗体的添加回收试验
溶液配制：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12 H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株WXX-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13088。
2.抗洛美沙星单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.13088杂交瘤细胞株WXX-1分泌产生，其IC50为0.19μg/L。
3.权利要求2所述的抗洛美沙星单克隆抗体的应用，其特征在于对食品中洛美沙星抗生素残留检测的应用。
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