CN114990072A - 分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用，属于食品安全免疫检测领域。杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.45108。此细胞株分泌的单克隆抗体，对诺氟沙星(IC50值为0.073ng/mL)、氧氟沙星(IC50值为0.174ng/mL)、洛美沙星(IC50值为0.106ng/mL)、培氟沙星(IC50值为0.101ng/mL)和恩诺沙星(IC50值为0.246ng/mL)均具有较好的特异性和检测灵敏度，对其他喹诺酮类抗生素药物交叉较小(＜1％)，用于免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为保健食品、药品中添加喹诺酮类抗生素药物的检测提供有力的检测手段。

Description

分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及分泌抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
喹诺酮类抗生素(Quinolones，QNs)，是一类含有4-喹诺酮结构的人工合成抗菌药，为人畜共用药物。通常根据发明先后和抗菌性能将其分为四代，目前应用较多的是第三代。其作用机理是通过妨碍细菌的脱氧核糖核酸(DNA)回旋酶，造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果，主要作用于革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌的作用较弱。由于具有抗菌谱广、抗菌活性强、药物成本低、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，喹诺酮类抗生素被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中动物疾病的防治。大量喹诺酮类抗生素药物的使用很大程度上降低了动物病死率，提高了经济效益，为养殖业的快速发展提供了强大支撑。但药物滥用带来的环境污染问题和药物残留问题近年来越发突出，人类通过食物链长时间暴露于这些药物，会对身体健康会造成伤害，容易引发耐药性。考虑到可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险，我国农业部第2292号公告规定在食品动物中停止使用洛美沙星(Lom)，氧氟沙星(Off)，诺氟沙星(Nor)，培氟沙星(Pef)四类喹诺酮类药物，这意味这这四种药物在动物性食品中不得检出。同时，GB31650-2019对食品中恩诺沙星(Enr)最大残留限量也做出了规定，在不同动物组织中的限量值为100-300ng/g。
由于喹诺酮类抗生素药物众多，各个国家和组织对每种药物的限量要求也不尽相同，有些药物甚至没有限量要求。所以相比于监测所有喹诺酮类抗生素而言，针对性地加强对重点禁用药物的日常风险监测具有现实意义。目前，喹诺酮类抗生素多以仪器方法分析为主，虽然该方法具有较高的准确性和灵敏度，但成本高、对检测环境和技术人员的要求高等特点限制了其发展。近年来免疫分析技术的快速发展，建立一种针对Nor，Off，Lom，Pef和Enr的高效、快速的免疫检测方法成为可能，包括酶联免疫法(ELISA)、胶体金免疫层析试纸条技术和免疫磁珠技术等。而这些方法建立的一个重要前提即需筛选出针对这些喹诺酮抗生素药物的高特异性单克隆单体。通过杂交瘤细胞制备抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体，但在制备能分泌抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
发明内容
为解决相关技术中存在的问题，本发明提供一种分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对喹诺酮类抗生素具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立喹诺酮类抗生素酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。本发明中的喹诺酮类抗生素是指诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星或恩诺沙星五种抗生素药物。
一方面，本发明提供一株分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株CPDM，保藏编号CGMCC No.45108，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在一种或多种实施案例中，所述喹诺酮类抗生素是诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星或恩诺沙星中的至少任意一种。
本发明还提供一种抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体，其是由保藏编号为CGMCCNo.45108的分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生。
又一方面，提供一种抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的制备方法，包括：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45108的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体低温保存。
又一方面，提供所述分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株在喹诺酮类抗生素检测中的应用、在制备喹诺酮类抗生素免疫检测试剂盒中的应用或在制备喹诺酮类抗生素检测胶体金试纸条中的应用。
又一方面，提供所述的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体在喹诺酮类抗生素检测中的应用、在制备喹诺酮类抗生素免疫检测试剂盒中的应用或在制备喹诺酮类抗生素检测胶体金试纸条中的应用。
优选地，所述的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体在喹诺酮类抗生素检测中的应用，应用于食品中喹诺酮类抗生素残留的检测。
又一方面，提供一种试剂盒，含有所述的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体。
又一方面，提供所述的试剂盒应用于食品中喹诺酮类抗生素残留的检测。
又一方面，提供一种胶体金试纸条，含有所述的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体。
再一方面，提供所述的胶体金试纸条应用于食品中喹诺酮类抗生素残留的检测。
本发明提供的分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备基本步骤为：
(1)免疫原的制备与鉴定：以诺氟沙星与6-溴己酸乙酯缩合形成人工半抗原，再通过与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定，得到免疫原；
(2)小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与弗氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠(冲刺免疫除外)，首次免疫采用弗氏完全佐剂，多次加强免疫使用弗氏不完全佐剂，剂量减半；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，冲刺免疫时免疫剂量为多次加强免疫剂量的一半。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过尾部采血，用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)对小鼠免疫效果进行测试；
(3)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过选择性培养基(HAT培养基)培养，融合一周后，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有较好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得能针对Nor，Off，Lom，Pef和Enr五类喹诺酮类抗生素药物分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
与相关技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，针对食品中禁用的Nor，Ofl，Lom，Pef和限用的Enr五类喹诺酮类抗生素药物有较好的检测灵敏度和亲和力；可实现所述五类喹诺酮类抗生素药物残留量的检测，尤其是对畜禽和水产品中涉及所述五类喹诺酮类抗生素药物残留量的检测。检测Nor的IC50值为0.073ng/mL，检测Off的IC50值为0.174ng/mL，检测Lom的IC50值为0.106ng/mL，检测Pef的IC50值为0.101ng/mL，和检测Enr的IC50值为0.246ng/mL。为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的喹诺酮类抗生素药物检测方法提供了新手段，具有实际应用价值。
生物材料保藏
一株分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株CPDM，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.45108，保藏日期为：2022年03月03日。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是免疫原Nor-2-BSA紫外表征图谱；
图2是包被原Pef-OVA紫外表征图谱；
图3是单克隆抗体对诺氟沙星(Nor)的抑制标准曲线；
图4是单克隆抗体对氧氟沙星(Off)的抑制标准曲线；
图5是单克隆抗体对洛美沙星(Lom)的抑制标准曲线；
图6是单克隆抗体对培氟沙星(Pef)的抑制标准曲线；
图7是单克隆抗体对恩诺沙星(Enr)的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的培养基如下：
RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。
下述实施例中涉及的试剂如下：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5∶1混合即为TMB显色液，现用现混。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
Nor，Off，Lom，Pef和Enr五类喹诺酮类抗生素的抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL。选择最佳工作点后，将五类喹诺酮类抗生素的标准品分别梯度稀释，为Nor(0，0.0041，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3ng/mL)，Off(0，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3，10ng/mL)，Lom(0，0.0041，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3ng/mL)，Pef(0，0.0041，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3ng/mL)和Enr(0，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3，10ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图(结果如图3～7所示)，获得的标准抑制曲线，计算IC50。
本发明通过用诺氟沙星完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了具有分泌针对Nor，Off，Lom，Pef和Enr高特异性抗体的杂交瘤细胞株。
实施例1人工抗原的制备与鉴定：
1.1人工半抗原Nor-2的衍生：先将诺氟沙星与6-溴己酸乙酯缩合，然后碱水解、分离纯化制备得到诺氟沙星人工半抗原，合成路线如下式(I)：
Figure BDA0003626690680000061
称取诺氟沙星(1mM，319.3mg)溶于30mL丙酮中，超声完全溶解后加入K2CO3(400mg)和6-溴己酸乙酯(1.2mM，0.172mL)，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中60℃恒温水浴反应24h，最后对溶液进行减压蒸馏，得淡黄色固体中间产物Nor-1；
将产物Nor-1用15mL的NaOH(0.1M)和Na2CO3(0.05M)溶液溶解，保持磁力搅拌，在冷凝回流装置中120℃油浴恒温回流24h，然后降温至10℃左右，加1M HCl调至pH至6.5～7.0，抽滤收集澄清溶液，将溶液加入阳离子交换树脂，过滤后用7％(v/v)的氨水洗脱，洗脱液浓缩后用甲醇溶解，再上硅胶柱，用氯仿-甲醇-氨水(40∶20∶7)洗脱分离，洗脱液减压蒸馏，冷冻干燥后得到目标产物即诺氟沙星人工半抗原Nor-2；
1.2完全抗原Nor-2-BSA的制备与鉴定：称取7.7mg诺氟沙星人工半抗原Nor-2溶解于500μL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入7.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持室温磁力搅拌反应10min，再加入11.9mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，继续保持室温搅拌反应2h，得到活化液A。将20mg BSA溶解于4mL碳酸盐缓冲溶液(CB，2mL，pH＝9.6)中，得到溶液B。在保持磁力搅拌的条件下将活化液A逐滴滴加到溶液B中，并室温搅拌反应过夜。最后，用0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)溶液透析，除去未参与反应的小分子，得到完全抗原Nor-2-BSA，用作免疫原，并通过紫外-可见光吸收扫描进行鉴定，如图1所示。
1.3完全抗原Pef-OVA的制备与鉴定：称取0.89mg培氟沙星溶解于500μL的无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴冷却后加入9.5μL三正丁胺，保持冰浴磁力搅拌反应15min，然后加入6.2μL氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌反应1h，得到活化液A。将20mg鸡卵清蛋白(OVA)溶解于4mL碳酸盐缓冲溶液(CB，2mL，pH＝9.6)的(称为B液)中，得到溶液B。在保持磁力搅拌的条件下将活化液A逐滴递减到溶液B中，并冰浴搅拌反应4h。最后，用0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)溶液透析，除去未参与反应的小分子，得到完全抗原Pef-OVA，用作包被原，并通过紫外-可见光吸收扫描进行鉴定，如图2所示；
实施例2：分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
2.1动物免疫的获得
选择健康的6～8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。将完全抗原Nor-2-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
2.2细胞融合与筛选
在冲击免疫3天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中浸泡消毒5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(800rpm，6min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2.3细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液(HT培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用Pef-OVA作为包被抗原，通过ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用喹诺酮抗生素药物为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。其中，选用的喹诺酮抗生素药物包含：垩喹酸、萘啶酸、米洛沙星、吡哌酸、吡咯酸、罗索沙星、西诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、依诺沙星、氟罗沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、奥比沙星、司氟沙星、吉米沙星、贝西沙星、巴洛沙星、加替沙星、莫西沙星、那氟沙星、氧氟沙星、马波沙星、氟甲喹、帕珠沙星、普卢利沙星、沙拉沙星、二氟沙星、曲伐沙星、三氟沙星。
选择对诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星五种喹诺酮抗生素药物标准品有较好抑制，而对其它喹诺酮抗生素药物基本无抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得分泌抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体细胞株。
实施例3：抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的制备
取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化：在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例4：抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的鉴定
4.1包被：将包被原Pef-OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释到最佳工作浓度0.1μg/mL，并加入到酶标板微孔中，100μL/孔，37℃反应2h，
4.2洗涤：将板内溶液倾去，并用PBST洗涤液洗涤3次，每次每孔200μL，每次3min拍干；
4.3封闭：用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃反应2h。用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；
4.4加样：用磷酸盐缓冲液(PBS)将五类喹诺酮类抗生素的标准品分别梯度稀释，为Nor(0，0.0041，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3ng/mL)，Off(0，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3，10ng/mL)，Lom(0，0.0041，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3ng/mL)，Pef(0，0.0041，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3ng/mL)和Enr(0，0.012，0.037，0.11，0.33，1，3，10ng/mL)，并将他们分别加入到已经封闭好的酶标板微孔中(50μL/孔)，然后将抗体稀释到最佳工作浓度0.03μg/mL，并加入到上述酶标板微孔中(50μL/孔)，每个样品重复3个平行孔，37℃反应30min，洗板拍干；加入1∶3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，100μL/孔，37℃反应30min，洗板拍干；
4.5显色：每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；.
4.6终止和测定：每孔加入50μL 2M H2SO4终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。用OriginPro 8.5做图(结果如图3～7所示)，获得的标准抑制曲线，计算IC50。
抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体对Nor，Ofl，Lom，Pef和Enr五类喹诺酮类抗生素的标准抑制曲线如图3～7所示。
实施例5：喹诺酮类抗生素免疫检测试剂盒
本实施例提供一种喹诺酮类抗生素免疫检测试剂盒，其包含实施例3制备的喹诺酮类抗生素单克隆抗体、酶标板、喹诺酮类抗生素包被抗原、喹诺酮类抗生素标准液、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗和TMB显色液。
喹诺酮类抗生素免疫检测试剂盒检测喹诺酮类抗生素的原理为：采用间接竞争ELISA法检测待测样本中喹诺酮类抗生素的含量。酶标板微孔内预先包被喹诺酮类抗生素包被抗原，加入喹诺酮类抗生素标准液或待测样品、喹诺酮类抗生素单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗和TMB显色液，制作喹诺酮类抗生素标准抑制曲线，根据喹诺酮类抗生素标准抑制曲线和待检测样品的吸光度值，确定待检测样品中的喹诺酮类抗生素含量。采用本领域常用方法进行操作即可实现喹诺酮类抗生素的检测。
实施例6：喹诺酮类抗生素检测胶体金试纸条
本实施例提供一种胶体金试纸条，其包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述胶体金结合垫上包被实施例5制备的喹诺酮类抗生素单克隆抗体。所述检测线由喹诺酮类抗生素包被抗原印制得到。所述质控线由羊抗鼠IgG二抗印制得到。胶体金试纸条的组装方式采用本领域常用方式即可。
喹诺酮类抗生素检测胶体金试纸条检测喹诺酮类抗生素的原理为：利用间接竞争法原理检测待测样品中是否含有喹诺酮类抗生素。如果待测样品中含有喹诺酮类抗生素，则检测线不显色，质控线显色。如果待测样品中不含有喹诺酮类抗生素，则检测线和质控线均显色。采用本领域常用方法进行操作即可实现喹诺酮类抗生素的检测。
通过以上实施例可以看出，本发明关于喹诺酮类抗生素的人工抗原的合成步骤简洁，有效，可有效用于免疫分析中，为后续的的研究分析提供了方便的途径，提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对喹诺酮类抗生素有较好的特异性和检测灵敏度，对Nor，Off，Lom，Pef和Enr的IC50分别为：0.073ng/mL，0.174ng/mL，0.106ng/mL，0.101ng/mL和0.246ng/mL，对其他喹诺酮类药物的IC50值均大于10ppb，这说明由本发明提供的细胞株分泌的抗体对Nor，Ofl，Lom，Pef和Enr有很好的灵敏度，对其他喹诺酮类药物基本无交叉(＜1％)，可用于食品中，尤其是畜禽和水产品中，针对Nor，Ofl，Lom，Pef和Enr的含量快速免疫分析检测。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (11)

1.一株分泌抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株CPDM，保藏编号为CGMCC No.45108，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的分泌抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述喹诺酮类抗生素药物是诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星或恩诺沙星中的至少任意一种。
3.一种抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1或2所述的保藏编号为CGMCC No.45108杂交瘤细胞株分泌产生。
4.一种如权利要求1或2所述的抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45108的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体低温保存。
5.如权利要求1或2所述的分泌抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株在喹诺酮类抗生素药物检测中的应用、在制备喹诺酮类抗生素药物免疫检测试剂盒中的应用或在制备喹诺酮类抗生素药物检测胶体金试纸条中的应用。
6.如权利要求3所述的抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体在喹诺酮类抗生素药物检测中的应用、在制备喹诺酮类抗生素药物免疫检测试剂盒中的应用或在制备喹诺酮类抗生素药物检测胶体金试纸条中的应用。
7.如权利要求6所述的抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体在喹诺酮类抗生素药物检测中的应用，其特征在于，应用于食品中喹诺酮类抗生素药物残留的检测。
8.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的抗喹诺酮类抗生素药物单克隆抗体。
9.权利要求8所述的试剂盒应用于食品中喹诺酮类抗生素药物残留的检测。
10.一种胶体金试纸条，其特征在于，含有权利要求3所述的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体。
11.权利要求10所述的胶体金试纸条应用于食品中喹诺酮类抗生素残留的检测。
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