CN106520705B - 一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株c1及其应用 - Google Patents

Abstract

一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株C1及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的单克隆细胞株C1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12025。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对巴龙霉素及新霉素的IC₅₀分别为0.61及2.43μg/L。对动物性食品中巴龙霉素及新霉素的回收率范围为64.56%‑105.85%及54.08%–100.55%.为动物性食品中巴龙霉素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株C1及其应用

技术领域

本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株C1及其分泌的能识别巴龙霉素的单克隆抗体，可用于食品中巴龙霉素残留的检测，属于免疫化学技术领域。

背景技术

巴龙霉素是一种由链霉菌分泌的氨基糖苷类广谱抗生素。巴龙霉素在结构上与新霉素十分相似，唯一的区别在于新霉素结构上的6位氨基换成了羟基。巴龙霉素的抗菌谱与卡那霉素相似，对阿米巴原虫有强大的杀灭作用，并且对一些原生生物也具有抗菌活性，包括：利什曼虫，痢疾阿米巴，隐孢子虫。在临床上，巴龙霉素用于治疗阿米巴病，贾第虫病和利什曼病。在畜牧业中，其被用来治疗细菌感染，包括家禽中火鸡的组织滴虫病。

在畜牧养殖业中，巴龙霉素被作为饲料添加剂添加于饲料中，因此会产生一些抗生素耐药性的问题。早年，已有研究证明低剂量的巴龙霉素也能引起肠道细菌的耐药性甚至对其他氨基糖苷类抗生素也会产生耐药性。因此，对养殖业中巴龙霉素的使用的监管以及可食性动物性食品中巴龙霉素的残留监督迫在眉睫。这也就需要高灵敏，高通量的检测技术来实现监管。

在食品安全检测中，色谱方法是应用比较广泛的一种，已经有用液相色谱来检测食品中巴龙霉素的报道。但是，像其他氨基糖苷类抗生素一样，巴龙霉素没有紫外吸收。这是因为其化学结构中没有发色团，在反相液相色谱中的色谱性能很差。而且，色谱方法昂贵，前处理过程复杂，检测过程耗时长。因此，食品中巴龙霉素的检测需要一种更为快捷、高通量的检测方法来替代。酶联免疫吸附方法（ELISA）和胶体金层析试纸条加速了食品安全快速检测技术的发展。它们具有简便、快速、特异性高、灵敏度好、便宜、样本前处理方法简便等优点。大部分氨基糖苷类抗生素都有相应的ELISA方法，但是没有关于巴龙霉素的ELISA方法。

发明内容

本发明的目的就是开发针对巴龙霉素的单克隆抗体，并在此基础上建立ELISA方法。此发明内容包括两个方面：单克隆抗体的制备和其应用

抗巴龙霉素单克隆抗体是通过对小鼠免疫巴龙霉素免疫原获得。免疫原通过戊二醛方法合成，包被原通过碳二亚胺法合成。筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，进行细胞融合。融合检测后筛选阳性高且对巴龙霉素抑制好的细胞株进行三次亚克隆，获得纯的细胞株。将细胞株注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对巴龙霉素结构类似物的识别性，计算交叉反应率。进行样本添加回收实验，计算回收率。

本发明的技术方案：一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株C1，分类命名为单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年1月20日，保藏编号为CGMCC No.12025。

抗巴龙霉素单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株C1分泌产生，其IC₅₀为0.61 μg/L。

所述的抗巴龙霉素单克隆抗体的应用，在于对食品中巴龙霉素残留检测中的应用。

本发明的有益效果：该细胞株C1分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对巴龙霉素及新霉素的IC₅₀分别为0.61及2.43 μg/L。对动物性食品中巴龙霉素及新霉素的回收率范围为64.56 %- 105.85%及54.08% – 100.55%. 为动物性食品中巴龙霉素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

附图说明

图1. 单克隆细胞株C1分泌的单克隆抗体对巴龙霉素及新霉素的标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：免疫原和包被原合成

免疫原通过戊二醛方法偶联：31.96mg巴龙霉素溶解于4mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液中，加入200 μL 1%戊二醛水溶液并搅拌15min。20 mg 牛血清白蛋白溶解于2mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液中，在4℃下反应1h，加入适量的硼氢化钠终止反应，在4℃下孵育2h。反应混合物通过透析去除游离的巴龙霉素以获得免疫原。包被原通过碳二亚胺法合成：10 mg 卵清白蛋白溶解于1mL pH 4.7 0.1M MES(吗啉乙磺酸)缓冲溶液中，加入2 mg EDC和1.2mgNHS，室温下反应2h。19.03 mg 巴龙霉素溶解于1mL 0.05M KH₂PO₄中，将活化好的蛋白溶液缓慢滴加进巴龙霉素溶液中，室温下反应3h。反应结束后的混合液用0.01M PBS 透析获得纯的包被原。

实施例 2：小鼠免疫

免疫原用生理盐水稀释到合适的浓度，再与等体积的弗氏佐剂乳化，在6-8周龄的BALB/c小鼠的背上进行多点注射。首次免疫用的是弗氏完全佐剂，剂量为100μg。后面的四次加强免疫用的是弗氏不完全佐剂，免疫剂量为50μg，免疫间隔为21天。第三次免疫后，通过小鼠的尾静脉采血，并通过间接ELISA来检测血清。第五次免疫后筛选效价高抑制好的小鼠进行腹腔冲刺免疫，三天以后取出小鼠脾脏进行细胞融合。

实施例3：细胞融合与筛选

小鼠脾细胞和瘤细胞在PEG 1500的作用下融合形成杂交瘤细胞。融合后第七天进行检测，筛选效价高且对巴龙霉素识别性好的细胞株进行亚克隆，以此类推，进行5次亚克隆获得纯的细胞株。

实施例4：单克隆抗体的纯化

筛选出的细胞株扩大培养后，注射进已经打过石蜡油的小鼠腹腔内，7到14天后可以从小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化，储存在-20℃。

实施例5：单克隆抗体的性质

抗体的灵敏度和特异性通过间接ELISA来测定。

1、单克隆抗体的交叉

将包被原PR-EDC-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释，100 μL/孔，37℃反应2h。包被原浓度为0.8（μg/mL）和单克隆抗体浓度0.6（μg/mL）通过棋盘法确定。将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液PBST洗涤3次，每次3min。拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。酶标板的每孔里加入50μL标准物溶液和50μL抗体，在37℃下培养30min后洗涤三次后拍干，每孔加入1︰3000稀释二抗100μL，在37℃下培养30 min后洗涤4次后拍干，加入已配制好的TMB显色液100μL，37℃培养15min, 最后每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定在450nm处的吸光值。

单克隆抗体的交叉实验测定了其他的氨基糖苷类抗生素：卡那霉素(Kanamycin)，链霉素(Streptomycin)，新霉素(Neomycin)，庆大霉素(Gentamycin)，安普霉素(Apramycin)，阿米卡星（Amikacin），林可霉素(Lincomycin)，大观霉素(Spectinomycin)及妥布霉素(Tobromycin)。交叉反应率为类似物的IC₅₀与巴龙霉素IC₅₀的比值。其交叉实验如表1所示。

表1. C1单克隆抗体的交叉

2、添加回收实验

向阴性牛奶（Bovine Milk），鸡蛋(Whole Egg)，猪肝(Swine Liver) 中分别添加巴龙霉素和新霉素，用单克隆抗体进行检测，计算回收率。添加回收实验见表2。

表2. 添加回收实验

溶液配制：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株C1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12025。

2.抗巴龙霉素单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的杂交瘤细胞株C1分泌产生，其IC₅₀为0.61μg/L。

3.权利要求2所述的抗巴龙霉素单克隆抗体的应用，其特征在于对食品中巴龙霉素残留检测中的应用。