CN110981963B - 一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110981963B CN110981963B CN201910900019.4A CN201910900019A CN110981963B CN 110981963 B CN110981963 B CN 110981963B CN 201910900019 A CN201910900019 A CN 201910900019A CN 110981963 B CN110981963 B CN 110981963B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- preparation
- line
- rabbit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 10
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 10
- 229960001117 clenbuterol Drugs 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- STJMRWALKKWQGH-UHFFFAOYSA-N clenbuterol Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC(Cl)=C(N)C(Cl)=C1 STJMRWALKKWQGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N deoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 5
- LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N vomitoxin hydrate Natural products OCC12C(O)C(=O)C(C)=CC1OC1C(O)CC2(C)C11CO1 LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000003474 anti-emetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002111 antiemetic agent Substances 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150014715 CAP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 101100326803 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fac-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明实施例公开了一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以纯化后的兔血清作为全抗原，经免疫反应、细胞融合筛选得到杂交瘤细胞的过程。本发明实施例提供一种鼠非特异性的单克隆抗体的制备方法，其通过兔血清全抗原作为免疫原，通过免疫原纯化、免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化得到用于替代现有技术中用到的抗鼠兔二抗。本发明实施例制备的单克隆抗体制备方法简单，可批量生产，稳定性好，其能够应用于免疫层析检测，且效价高，反应强，适用于多种模式的免疫层析反应。
Description
技术领域
本发明实施例涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法。
背景技术
鼠或者兔等第一来源的抗体被称为第一抗体，第二抗体是能和第一抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。二抗在间接酶联免疫、免疫层析等实验中发挥了巨大作用。免疫层析(immuno-chromatography assay，ICA)是出现于20世纪80年代初期的一种新型的免疫分析方式，它是在免疫渗滤(immunofiltrationasay，IFA)的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术。免疫层析法原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品，例如尿液或血清后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动从而实现检测，是目前市场上最畅销、最流行的一种快速简便的分析方法。
免疫层析产品大多使用到第二抗体作为质控线，使用量大，一般使用羊抗鼠、羊抗兔，但这些传统的二抗，往往会因为检测线阳性强弱导致质控线显色不稳定，并且批次间差异大，需要大量的羊和兔进行生产第二抗体。亟待研发稳定性好，且可大批量生产可替代二抗的抗体的制备方法。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法，以解决现有技术中第二抗体稳定性差，成本高的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以纯化后的兔血清作为全抗原，经免疫反应、细胞融合筛选得到杂交瘤细胞的过程。
优选地，所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞株7G5；
所述杂交瘤细胞株7G5已于2019年9月10日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019214。
优选地，所述杂交瘤细胞株7G5分泌的单克隆抗体用于与鼠和兔来源的抗体发生非特异性结合。
优选地，所述兔血清全抗原的制备方法为：
将兔血清用结合缓冲液稀释到后，过滤，过SPA琼脂糖凝胶柱，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱峰，并用中和缓冲液调节其pH至中性，得到兔血清全抗原。
优选地，所述免疫反应是将兔血清全抗原免疫小鼠。
优选地，所述细胞融合是将小免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
本发明实施例还提供用所述的方法制备的单克隆抗体。
本发明实施例还提供一种免疫层析检测试剂盒，所述免疫层析检测试剂盒，质控线上包被有上述所述的单克隆抗体。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例提供一种鼠非特异性的单克隆抗体的制备方法，其通过兔血清全抗原作为免疫原，通过免疫原纯化、免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化得到用于替代现有技术中用到的抗鼠兔二抗。本发明实施例制备的单克隆抗体制备方法简单，可批量生产，稳定性好，其能够应用于免疫层析检测，且效价高，反应强，适用于多种模式的免疫层析反应。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备
1.免血清全抗原免疫原的制备
(1)将1ml SPA琼脂糖凝胶预填柱(山东绿都生物科技有限公司，LD-CH-02)用5～10个柱床体积的蒸馏水清洗；
(2)用结合缓冲液结合缓冲液(0.02M磷酸缓冲液，0.01M NaCl，pH 7.4)平衡5～10个柱床体积；
(3)将5ml兔血清用结合缓冲液稀释到50ml，0.45μm滤膜过滤上样；
(4)用结合缓冲液再洗5～10个柱床体积；
(5)用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸缓冲液，pH 4.0)洗脱抗体，收集洗脱峰，并用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)调节其pH至中性，测定蛋白浓度，作为免疫原备用；
(6)每次使用后用3～5个柱床体积的0.1M NaOH溶液再生清洗。
2.非特异性单克隆抗体的制备
(1)免疫程序
将上述所得免疫抗原与自产501佐剂按1:1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，腿部肌肉注射，50μg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上；5免后加强免疫，腹腔，不加佐剂，剂量加倍。
(2)细胞融合
将脾细胞与骨髓瘤细胞按照20:1的比例混合，800rpm离心5min，弃去上清，于30S内加入1ml 50％PEG(W/W)，静置1min，在第一个1min内缓慢加入1ml无血清的培养基，在第二个1min内缓慢加入2ml无血清的培养基，在第三个1min内缓慢加入2ml无血清的培养基，在第四个1min内缓慢加入5ml无血清的培养基，在第五个1min内缓慢加入10ml无血清的培养基，800rpm离心10min，弃上清，用完全培养基重悬细胞，细胞计数为3～6×105铺于含饲养细胞(2～6×104)的细胞培养板，置CO2培养箱中。
3.杂交瘤筛选
3.1酶标板的制备
将6种包被抗原(兔纯化多抗蛋白，小鼠纯化多抗蛋白，牛血清白蛋白,大肠杆菌表达cap2蛋白，大肠杆菌表达N蛋白,卵清白蛋白)用包被缓冲液(0.01M碳酸钠，0.01M碳酸氢钠)按照2μg/ml稀释，每孔取100μL加入酶标板，盖好盖板膜，置4℃静置20h。包被后要进行两次洗涤，用蒸馏水，250μL/孔，洗涤完毕后，应在毛巾上拍干残余液体，并及时进行下一步封闭。封闭时用的封闭液中的蛋白都分别为各自本身蛋白(0.01MPBS，5％本身蛋白)，每孔取180μL加入酶标板，盖好盖板膜，37℃封闭1.5h。
3.2非特异性杂交瘤细胞的筛选
将3.1中制备好的酶标板进行编号，将细胞上清液0.01MPBS，PH7.4稀释5倍，分别每孔加入50μl，再加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置，37℃避光环境中反应20min。洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤3次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干。
加底物液A液50μl/孔，再加B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中避光反应10min，酶标孔显示强阳性的为深蓝色，酶标孔显示弱阳性的为浅蓝色，酶标孔显示阴性的为白色，选择与六种抗原均有强阳性反应的孔为目标杂交瘤细胞株孔，进行下一步克隆。
(4)杂交瘤细胞克隆化
待杂交瘤细胞长至视野的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取高亲和力抗呕吐毒素的单克隆杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株7G5已于2019年9月10日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019214。
(4)单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备：采用动物体内腹水诱生法或者细胞发酵法。
单克隆抗体的纯化：采用辛酸-硫酸铵方法，方法如下：将腹水用0.01MPBS，PH7.4稀释3倍，加入10微升辛酸，快速摇晃1min，4000rpm离心5min，快速加入等体积0.01MPBS，PH7.4复溶，然后加入等体积饱和硫酸铵溶液，冰浴摇晃1min，4000rpm离心5min，快速加入等体积0.01MPBS，PH7.4复溶，即得到粗纯的用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体。
实施例3、用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体在免疫层析检测试剂盒中的应用
1.本发明实施例的单克隆抗体在氯霉素定性检测卡中的应用
1.1氯霉素结合蛋白的标记
用0.l mol/L的K2CO3调节胶体金pH值为9.0，每1mL胶体金溶液加入6μg氯霉素结合蛋白，室温下120rpm摇30min，加入10％牛血清白蛋白20μL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20min，弃上清，用0.01MPBS溶解沉淀，即得到标记好的氯霉素结合蛋白。
2、质控性C线，检测线T线的确定
选择Sartorius Cn140膜，分别将氯霉素全抗原、市售羊抗鼠二抗(JACKSON)和本发明实施例制备的单克隆抗体作为检测线T线和质控线C线划在NC膜上，浓度分别为0.2mg/mL抗原和不同梯度浓度的二抗，按常规方法组装成检测卡。采用0.01M、PH7.4 PBS作为稀释液配制不同梯度的氯霉素标准品溶液，其浓度如下：0μg/Kg、0.1μg/Kg、0.5μg/Kg、5μg/Kg,进行检测卡灵敏度测定，检测结果为如表1所示，在氯霉素定性检测卡的制备上，市售羊抗鼠二抗不与标记好的氯霉素结合蛋白反应，而本发明实施例二抗替代品可以作为C线使用，并起到了很好的质控作用。
表1
+表示阳性强弱，-表示阴性
阴性(-)：质控线C、检测线T线同时清晰显色，表示样品中不含有氯霉素或低于检测限。
阳性(+)：质控线C线清晰显色，检测线T线不显色，则表示样品中氯霉素浓度高于或等于检测限。
无效：质控线C线不出现，表明操作过程不正确或检测卡已失效。
2本发明实施例的单克隆抗体在霉菌毒素定性检测卡中的应用
2.1兔抗呕吐毒素多抗的标记
用0.lmol/L的K2CO3调节胶体金pH值为9.0，每1mL胶体金溶液加入6μg兔抗呕吐毒素多抗，室温下120rpm摇30min，加入10％牛血清白蛋白20μL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20min，弃上清，用0.01MPBS溶解沉淀，即得到标记好的兔抗呕吐毒素多抗。
2.2质控线C，检测线T线的确定
选择Sartorius Cn140膜，分别将呕吐毒素全抗原、市售羊抗兔二抗(JACKSON)和本发明实施例制备的用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体作为检测线T线和质控线C线划在NC膜上，浓度分别为0.2mg/mL的抗原和不同梯度浓度的二抗，按常规方法组装成检测卡。采用0.01M、PH7.4 PBS作为稀释液配制不同梯度的呕吐毒素标准品溶液，其浓度如下：0μg/Kg、5μg/Kg、20μg/Kg、50μg/Kg，如表2所示，在呕吐毒素定性检测卡的制备上，市售羊抗兔二抗与本发明实施制备的单克隆抗体均与标记好的兔抗呕吐毒素多抗反应，本发明实施例的单克隆抗体比市售JACKSON二抗在同等浓度下反应强烈，且价格低廉，可以降低检测卡的生产成本。
表2
+表示阳性强弱，-表示阴性
阴性(-)：质控线C、检测线T线同时清晰显色，表示样品中不含有呕吐毒素或低于检测限。
阳性(+)：质控线C线清晰显色，检测线T线不显色，则表示样品中呕吐毒素浓度高于或等于检测限。
无效：质控线C线不出现，表明操作过程不正确或检测卡已失效。
3本发明实施例的单克隆抗体在瘦肉精定性检测卡中的应用
3.1鼠抗克伦特罗单克隆抗体的标记
用0.l mol/L的K2CO3调节胶体金pH值为9.0，每1mL胶体金溶液加入6μg鼠抗克伦特罗单克隆抗体，室温下120rpm摇30min，加入10％牛血清白蛋白20μL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20min，弃上清，用0.01MPBS溶解沉淀，即得到标记好的鼠抗克伦特罗单克隆抗体。
3.2质控线C、检测线T线确定
选择Sartorius Cn140膜，分别将克伦特罗全抗原、市售羊抗鼠二抗(JACKSON)和本发明实施例的单克隆抗体作为检测线T线和质控线C线划在NC膜上，浓度分别为0.2mg/mL的抗原和不同梯度浓度的二抗，按常规方法组装成检测卡。采用0.01M、PH7.4 PBS作为稀释液配制不同梯度的克伦特罗标准品溶液，其浓度如下：0μg/Kg、1μg/Kg、3μg/Kg、5μg/Kg,进行检测卡灵敏度测定，在克伦特罗定性检测卡的制备上，市售羊抗兔二鼠与本发明实施例制备的单克隆抗体均与标记好的鼠抗克伦特罗单克隆抗体反应，检测结果如表3所示，但是本发明实施例制备的单克隆抗体比市售JACKSON二抗在同等浓度下反应强烈，且价格低廉，可以降低检测卡的生产成本。
表3
+表示阳性强弱，-表示阴性
阴性(-)：质控线C、检测线T线同时清晰显色，表示样品中不含有克伦特罗或低于检测限。
阳性(+)：质控线C线清晰显色，T线不显色，则表示样品中克伦特罗浓度高于或等于检测限。
无效：质控线C线不出现，表明操作过程不正确或检测卡已失效。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.杂交瘤细胞株7G5，所述杂交瘤细胞株7G5已于2019年9月10日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019214。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，
所述杂交瘤细胞株7G5分泌的单克隆抗体用于与鼠和兔来源的抗体发生非特异性结合。
3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，
所述杂交瘤细胞株7G5分泌的单克隆抗体用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体。
4.一种免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述免疫层析检测试剂盒，质控线上包被有权利要求1至3任一项所述的杂交瘤细胞株7G5分泌的单克隆抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910900019.4A CN110981963B (zh) | 2019-09-23 | 2019-09-23 | 一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910900019.4A CN110981963B (zh) | 2019-09-23 | 2019-09-23 | 一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110981963A CN110981963A (zh) | 2020-04-10 |
| CN110981963B true CN110981963B (zh) | 2021-09-03 |
Family
ID=70081811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910900019.4A Active CN110981963B (zh) | 2019-09-23 | 2019-09-23 | 一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110981963B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112812190B (zh) * | 2020-05-15 | 2022-07-08 | 上海百英生物科技有限公司 | 一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体及应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN87100515A (zh) * | 1987-01-26 | 1988-08-31 | 华西医科大学 | 一种用牛、马血清制备放免及生化质控物的方法 |
| CN101093223A (zh) * | 2007-07-18 | 2007-12-26 | 清华大学 | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 |
| CN101493459A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-07-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种炭疽芽孢杆菌及其芽孢的胶体金检测试纸及其制备方法和应用 |
| CN101845096A (zh) * | 2009-12-30 | 2010-09-29 | 吉林大学 | Cu2+特异性单克隆抗体及其制备方法 |
| CN101915833A (zh) * | 2010-09-10 | 2010-12-15 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 牛初乳及其制品中免疫球蛋白g半定量快速检测试纸条及其制备方法 |
| CN103352028A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-10-16 | 云南省环境监测中心站 | 杂交瘤细胞株ynemc3及其产生的单克隆抗体和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009111729A1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-11 | Ventana Medical Systems, Inc. | Anti-dnp antibodies and methods of use |
| MA40974B1 (fr) * | 2014-11-18 | 2021-02-26 | Pasteur Institut | Anticorps polyclonaux spécifiques pour le sérogroupe x de n. Meningitidis et leurs utilisations dans le diagnostic |
-
2019
- 2019-09-23 CN CN201910900019.4A patent/CN110981963B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN87100515A (zh) * | 1987-01-26 | 1988-08-31 | 华西医科大学 | 一种用牛、马血清制备放免及生化质控物的方法 |
| CN101093223A (zh) * | 2007-07-18 | 2007-12-26 | 清华大学 | 提高环境样品免疫检测抗基质效应的方法及其专用缓冲溶液 |
| CN101493459A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-07-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种炭疽芽孢杆菌及其芽孢的胶体金检测试纸及其制备方法和应用 |
| CN101845096A (zh) * | 2009-12-30 | 2010-09-29 | 吉林大学 | Cu2+特异性单克隆抗体及其制备方法 |
| CN101915833A (zh) * | 2010-09-10 | 2010-12-15 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 牛初乳及其制品中免疫球蛋白g半定量快速检测试纸条及其制备方法 |
| CN103352028A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-10-16 | 云南省环境监测中心站 | 杂交瘤细胞株ynemc3及其产生的单克隆抗体和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110981963A (zh) | 2020-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2007257105B8 (en) | Elisa kit for detecting Sudan red and method thereof | |
| CN100567324C (zh) | 一种微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| CN111060698B (zh) | 抗mrjp4的配对单克隆抗体、检测mrjp4的elisa试剂盒和胶体金免疫试纸 | |
| CN102080066B (zh) | 一种检测t-2毒素的方法及其专用试剂盒 | |
| CN112679605B (zh) | 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| WO2018133039A1 (zh) | 制备抗体对的方法、试剂盒及试剂盒的应用和制备抗体对的系统 | |
| CN106405095A (zh) | 采用间接竞争elisa法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白 | |
| CN112625124A (zh) | 一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法及其应用 | |
| CN102876634B (zh) | 孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒 | |
| CN109180519B (zh) | 一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法 | |
| CN110981963B (zh) | 一种用于替代抗鼠兔二抗的单克隆抗体的制备方法 | |
| CN104312978B (zh) | 一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| CN101093224A (zh) | 微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN108103002B (zh) | Mdck细胞宿主残留蛋白的制备及其用途 | |
| CN113325180B (zh) | 一种检测农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用 | |
| CN116121199B (zh) | 布鲁氏菌单克隆抗体6a5及其应用、试剂盒 | |
| CN101093225A (zh) | 一种微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN101413959A (zh) | 组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白的免疫学定量检测方法 | |
| Zhou et al. | Development of a novel antibody probe useful for domoic acid detection | |
| CN101845097B (zh) | 一种海洋贝毒素单抗制备方法 | |
| FI92716B (fi) | Uudet monoklonaaliset vasta-aineet IFN-omegalle, niiden valmistusmenetelmät ja niiden käyttö IFN-omegan puhdistamiseen ja osoittamiseen | |
| CN112904008B (zh) | 检测生物制品中蛋白a等杂质的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN113325182A (zh) | 配对抗体的高效筛选方法 | |
| US4900661A (en) | Method for immunological determination of amines, monoclonal antibodies and kit of reagents for carrying out the method | |
| JPH0677017B2 (ja) | ヒト▲ｉｖ▼型コラーゲンのサンドイツチ酵素免疫学的定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wu Yuxiang Inventor after: Shen Zhiqiang Inventor after: Yu Jinzhi Inventor after: Li Yuzong Inventor before: Wu Yuxiang Inventor before: Shen Zhiqiang Inventor before: Yu Jinzhi Inventor before: Cui Ping |
|
| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20240628 Granted publication date: 20210903 |