CN105158456B

CN105158456B - 一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用

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Publication number: CN105158456B
Application number: CN201510553221.6A
Authority: CN
Inventors: 彭池方; 潘娜; 王丽英
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2035-09-01
Also published as: CN105158456A

Abstract

本发明公开了一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用。所述金纳米花免疫探针包括金纳米花粒子，且金纳米花粒子上修饰有示踪酶标记的抗体，其中所述金纳米花粒子主要是以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得。所述示踪酶标记的抗体包括示踪酶标记单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的金纳米花免疫探针较之传统的酶标记抗体免疫探针信号和检测灵敏度显著提升；本发明采用酶联免疫反应验证了金纳米花免疫探针的活性，该方法简便快速，重复性高；基于本发明金纳米花免疫探针的酶联免疫检测分析方法在较少改变传统检测方法成本的前提下，检测性能显著地提高。

Description

一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用

技术领域

本发明特别涉及一种金纳米花免疫探针、其制备方法与应用，属于免疫分析技术领域。

背景技术

金纳米结构由于具有尺寸可控、形状可调等特点，在光学、电学、生物医药和生物传感中获得了广泛的应用。金纳米花(AuNFs)是一种具有多头或枝化结构的特殊的金纳米粒子，相对球形金纳米粒子，其比表面积显著增加。这一特殊的形貌，使得其在生物传感中获得了许多应用。采用方便、可控、生物相容性好的制备方法获得特定形貌的金纳米花，并将其应用于光学、电学、生物医药和生物传感中是一项具有很高应用价值的工作。

酶联免疫分析(ELISA)技术是一种非常成熟的固相免疫分析模式，在临床诊断、食品安全危害物监测、环境分析等许多领域中已经获得了广泛的应用。但是，酶联免疫分析技术对痕量目标物的检测仍然面临较多的挑战，因此，许多信号放大技术，如银染色增强、酪胺信号放大、免疫-PCR等获得了人们的关注。但是，这些信号放大体系的应用在获得了超高灵敏的检测性能的同时，也使得酶联免疫分析技术的复杂性和成本大大提高，因而限制了它们的实际应用。因而，开发一种制备方法方便、成本低的纳米免疫探针，应用于ELISA，具有较高的应用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种金纳米花(AuNFs)免疫探针、其制备方法与应用。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

在一些实施例中提供了一种金纳米花免疫探针，包括金纳米花粒子以及修饰于金纳米花粒子上的示踪酶标记的抗体；其中所述金纳米花粒子主要是以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得。

其中，所述示踪酶标记的抗体包括示踪酶标记单克隆抗体或多克隆抗体，所述示踪酶包括辣根过氧化物酶。

在一些实施例中，所述金纳米花粒子的制备方法包括：

(1)将粒径为10～15nm的金纳米粒子、氧化剂、壳聚糖于水相体系中充分混合后用频率为25kHz～45kHz的超声波处理5～10min，制得混合溶液，所述混合溶液中氧化剂的浓度为0.005wt％～0.02wt％，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的浓度为1.04～4.16mg/mL，所述氧化剂包括氯金酸；

(2)向步骤(1)制备的混合溶液中加入还原剂，直至还原剂的浓度为3.2mM～12.8mM，之后在无光条件下搅拌反应10～15min，制得所述金纳米花粒子。

其中所述氧化剂包括但不限于氯金酸。所述还原剂包括抗坏血酸或没食子酸，但不限于此。

对于前述步骤(1)，在一些实施方案之中，可以采取将粒径为10～15nm的金纳米溶液、含量为0.1wt％～4wt％的氯金酸溶液、浓度为5～10mg/mL的壳聚糖乙酸溶液和超纯水混合，之后用超声波处理，制得混合溶液。

在一些更为具体的实施例之中，所述金纳米花粒子的制备方法可以包括：

(1)将粒径约10nm的金纳米溶液，含量为0.1wt％～4wt％的氯金酸溶液，以及壳聚糖乙酸溶液混合，并用超纯水定容到24mL后混合均匀，使形成的混合溶液中氯金酸浓度为0.005wt％～0.02wt％，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的浓度为1.04～4.16mg/mL，充分混合后用频率为25kHz～45kHz的超声波处理10min，制得混合溶液；

(2)向步骤(1)中的混合溶液中迅速加入抗坏血酸，使形成的混合物中抗坏血酸浓度为3.2mM～12.8mM，暗处搅拌反应10min，获得金纳米花粒子。

在一些更为具体的实施例之中，前述的抗坏血酸可替换为没食子酸。

进一步的，在一些实施例中还提供了由前述任一种方法制备的金纳米花粒子，其具有比表面积大、分散性良好等特性，粒径约30nm～50nm。本发明中由于AuNFs具有极高的比表面积，单个纳米材料可以同时负载多个酶标记抗体分子，进而极大提高免疫探针中酶与抗体的比例，因此，使用包含本发明中AuNFs的免疫探针进行免疫分析，特别是对微量的待分析物进行免疫检测时，可放大免疫检测的信号，提高检测灵敏度。

在一些实施例中还提供了一种制备所述金纳米花免疫探针的方法，包括：以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得金纳米花粒子，并将金纳米花粒子分散于质量浓度为0.02～0.1mg/mL的辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，在温度为0℃～8℃的条件下震荡1h～5h，之后加入牛血清蛋白溶液进行封闭，直至牛血清蛋白的最终浓度为0.2wt％～1wt％，然后在温度为20～27℃、转速为300～600rpm的条件下振荡0.5h～1h，获得所述免疫探针。其中，所述纳米金种子可以采用鞣酸-柠檬酸钠还原法制备。

在一些实施例中还提供了一种试剂盒，其包括所述的金纳米花免疫探针(如下简称“免疫探针”)。

在一些实施例中还提供了一种基于所述试剂盒的检测方法(或者也可以认为是所述试剂盒的使用方法)，其包括：

a、将所述的免疫探针与不同浓度的目标抗原标准样品进行酶联免疫反应，并记录检测信号，由此建立免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系；

b、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤a建立的免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。

或者，在一些实施例中，基于所述试剂盒的检测方法也可包括：

A、将蛋白质与半抗原的偶联物溶于碳酸盐缓冲液中形成包被液，之后加入酶标板中，并在温度为25℃～37℃的条件下孵育1～4h，再以磷酸盐缓冲液洗涤，而后加入封闭液，并在温度为0℃～8℃的条件下封闭过夜，且蛋白质与半抗原的偶联物与碳酸盐缓冲液的体积比为1:9000～1:243000，制得包被抗原溶液，所述蛋白质包括卵清蛋白或牛血清蛋白；

B、向步骤A中连接上包被抗原的酶标板中加入一系列不同浓度小分子标准品的磷酸盐缓冲液，之后加入含小分子抗体的酶标稀释液，再在温度为25℃～37℃的条件下孵育0.5～1h，最后用磷酸盐缓冲液洗涤，所述酶标稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M～0.05M、pH值为7.0～8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1～0.5wt％的明胶和0.05～0.1v/v％的吐温-20，制得多个竞争反应混合体系；

C、向步骤B制得的各个竞争反应混合体系中分别加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，其中，免疫探针和抗体稀释液的体积比为1:2000～1:3000，之后在温度为25℃～37℃下孵育0.5h～2h，再以磷酸盐缓冲液洗涤，所述抗体稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M～0.05M、pH值为7.0～8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1～0.5wt％的明胶和0.05～0.1v/v％的吐温-20，制得多个混合反应体系；

D、向步骤C制得的各个混合反应体系中分别加入显色液，之后在温度为25℃～37℃下显色10min～30min，再加入浓度为2M～4M的硫酸溶液，最后测量各混合反应体系在450nm～650nm波长处的吸光值，建立吸光值与抗原量的标准对应关系；

E、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤D建立的吸光值与抗原量的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。

在一些实施例中，步骤A所述封闭液包括浓度为0.001wt％、分子量为2000～10000的聚乙二醇溶液；

Ⅰ、将抗体溶于碳酸盐包被缓冲液中，形成蛋白质含量为1μg/mL～20μg/mL的溶液，之后将溶液转入酶标板中，并在温度为25℃～37℃的条件下孵育1h～4h，再用磷酸盐缓冲液洗涤，最后加入含量为0.1wt％～5wt％的牛血清蛋白溶液，并在温度为0℃～8℃下封闭过夜；

Ⅱ、向步骤Ⅰ得到的酶标板中加入一系列不同浓度小分子标准品的磷酸盐缓冲液，在温度为25℃～37℃的条件下孵育0.5h～2h，并用磷酸盐缓冲液洗涤，制得多个结合反应混合体系；

Ⅲ、向步骤Ⅱ制得的各个结合反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，之后在温度为25℃～37℃下孵育0.5h～3h，再用磷酸盐缓冲液洗涤，制得多个混合反应体系；

Ⅳ、向步骤Ⅲ制得的各个混合反应体系中分别加入显色液，之后在温度为25℃～37℃下显色10min～30min，再加入浓度为2M～4M的硫酸溶液，最后测量各混合反应体系在450nm～650nm波长处的吸光值，建立吸光值与抗原量的标准对应关系；

Ⅴ、将所述的免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品进行酶联免疫反应，并依据步骤Ⅳ建立的吸光值与抗原量的标准对应关系，确定待测样品中的目标抗原浓度。

在一些更为具体的实施例中，步骤Ⅲ所述抗体稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M～0.05M、pH值为7.0～8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1～0.5wt％的明胶和0.05～0.1v/v％的吐温-20。

前述显色液可以选用业界已知的合适类型。

在一些实施例中，所述显色液可以包括：

A液：0.933g柠檬酸，3.68g十二水合磷酸氢二钠，18μL质量分数30％过氧化氢用超纯水定容至100mL；

B液：60mg 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；

使用前将A液与B液以5:1体积比混合。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1、本发明的金纳米花(AuNFs)免疫探针较之传统的酶标记抗体免疫探针信号和检测灵敏度显著提升；

2、本发明采用酶联免疫反应验证了金纳米花(AuNFs)免疫探针的活性，该方法简便快速，重复性高；

3、基于本发明金纳米花(AuNFs)免疫探针的酶联免疫检测分析方法在较少改变传统检测方法成本的前提下，检测性能显著地提高。

附图说明

图1是本发明实施例1中金纳米种子的透射电子显微(TEM)图；

图2是本发明实施例1中所获AuNFs的透射电子显微(TEM)图；

图3是双酚A(BPA)的传统酶联免疫反应标准曲线图；

图4是本发明实施例2中双酚A(BPA)的酶联免疫反应标准曲线图；

图5是前列腺特异抗原(PSA)的传统酶联免疫反应标准曲线图，

图6是本发明实施例3中前列腺特异抗原(PSA)的酶联免疫反应标准曲线图。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步地描述，但本发明的实施方式并不仅限于此。

又及，下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂例如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、显色液等也均可以是业界习知的适用类型，以及，如下出现的％若非特别说明则均指wt％。

实施例1：金纳米花粒子(AuNFs)-酶-免疫探针的制备

a.粒径10nm的金纳米种子的制备：A溶液，包括1.5mL、浓度为10mM的HAuCl₄溶液，38.5mL的超纯水；B水溶液体系，包括2mL、浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，0.04mL浓度为1％的单宁酸溶液，0.06mL浓度为25mM碳酸钾溶液，7.9mL的超纯水；分别将A、B液在温度为60℃的条件下水浴30min，之后在高速磁力搅拌下将B液全部倒入A液中，再在温度为60℃的条件下水浴30min，最后加热至沸腾并持续5-6min，备用。

b.将200μL、粒径约10nm的金纳米溶液，1.25mL含量为0.1wt％的氯金酸溶液，以及10mL、浓度为5mg/mL的壳聚糖乙酸溶液混合，并用超纯水定容到24mL，充分混合后超声10min，制得混合溶液；

c.向步骤b制得的混合溶液中迅速加入1mL、浓度为0.08M抗坏血酸，暗处搅拌反应10min，得到AuNFs；

d.将800μLAuNFs溶液在转速为8000rpm的条件下离心5min，之后用含有浓度为0.1mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗体溶液重悬，再在温度为4℃的条件下震荡3h，然后加入50μL、质量百分比浓度为5％的牛血清蛋，最后在温度为25℃下振荡30min进行封闭，即得到AuNFs-酶-免疫探针。

实施例2：双酚A(BPA)的检测

a.BPA包被抗原合成：首先将双酚A分子衍生化，然后用碳二亚胺法将衍生物与牛血清蛋白(BSA)偶联，合成免疫抗原BPAH-BSA。合成的主要步骤如下：先将盐酸、对氨基苯甲酸和亚硝酸钠混合进行重氮化反应生成相应的重氮盐，再加入NaOH溶解的双酚A反应生成双酚A半抗原BPAH，并进行过滤重结晶得到固体BPAH；称取同摩尔量的BPAH、N-羟基琥珀酰亚胺NHS、碳二亚胺盐酸盐EDC(0.3mmol)溶解于3mL无水二甲基亚砜中，磁力搅拌溶解后，避光继续反应10min；5mg的卵清蛋白(OVA)，溶解到1mL pH9.6的碳酸盐缓冲液中，磁力搅拌过夜，得到溶液为A液。将A液逐滴加入到BSA溶液中，完毕后，继续磁力搅拌，避光室温反应4h。反应结束后，将反应溶液在EDC溶液中透析3次，以除去未反应的BPA及其他小分子；最后一次透析液换成PB(磷酸盐缓冲液)。合成的包被抗原分装后，置于温度为-20℃的条件下保存。

b.抗原的包被：以BPA与OVA的偶联物作为包被抗原，以浓度为0.05M、pH为9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原以1:9000～1:243000进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，之后在温度为37℃的条件下孵育2h，再用质量百分比浓度为0.001％、分子量为6000的聚乙二醇PEG作为封闭液，在温度为4℃的条件下封闭过夜；

c.竞争反应：每孔分别加入以BPA标准品稀释液磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL系列浓度之一的小分子标准品或者处理好的样品50μL到各酶标孔中；再将小分子抗体以酶标稀释液(含0.1％明胶、0.05％(v/v)吐温-20，pH为7.4、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液PBST)按1:27000～1:729000的比例稀释，之后加入到酶标板中，每孔50μL，最后在温度为37℃的条件下孵育30min后，再以PBST洗涤液洗涤3～5次，备用；

d.加入吸附了金纳米花的酶标二抗：以抗体稀释液将吸附了金纳米花的酶标二抗以1:20～1:100的比例稀释，在酶标板的每孔中加100μL，再在温度为37℃的条件下孵育1h，之后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

e.显色：向酶标板每孔中加入显色液100μL，之后在温度为37℃调价下显色15min；然后每孔加入浓度为2M硫酸溶液50μL终止显色反应；用酶标仪测量波长450nm处的吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比计算出待测样品中BPA的浓度。参阅图3-图4，本实施例中得到BPA检测的检测灵敏度为0.08ng/mL，而传统的ELISA方法检测的检测灵敏度为0.9ng/mL，因此，检测灵敏度提高了10倍以上。

实施例3：前列腺特异抗原(PSA)的检测

a.包被：用浓度为0.05M、pH为9.6的碳酸盐包被缓冲液将PSA抗体稀释至蛋白质含量为1～20μg/mL，之后在酶标板的每孔中加入100μL，并在温度为37℃的条件下孵育2h，然后在PBST洗涤液洗涤3次。然后用质量百分比浓度为0.1～5％的牛血清蛋白作为封闭液，每孔加入200μL，最后在温度为4℃的条件下封闭过夜；

b.结合反应：在酶标板的每孔中分别加入以标准品稀释液磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的系列浓度之一的PSA标准品或处理好的样品100μL，之后在温度为37℃的条件下孵育30min，再以PBST洗涤液洗涤3次，备用；(同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔)；

c.AuNFs-酶-免疫探针的结合：以抗体稀释液将AuNFs-酶-免疫探针以1:20～1:100的比例稀释，之后在每孔中加入100μL，并在温度为37℃的条件下孵育1h，再以PBST洗涤液洗涤3～5次，备用；

d.显色：向酶标板的每孔中加入显色液100μL，之后在温度为37℃的条件下显色15min；然后在每孔中加入终止液(浓度为2M的硫酸溶液50μL)；最后用酶标仪测量波长为450nm处的吸光值A₄₅₀，建立A₄₅₀与抗原量的关系。与所作标准曲线对比算出待测样品中PSA的浓度。参阅图5～图6，本实施例中得到PSA检测的灵敏度为0.1ng/mL，比传统的ELISA方法检测的灵敏度1.0ng/mL提高了10倍。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种金纳米花免疫探针，其特征在于包括金纳米花粒子以及修饰于金纳米花粒子上的示踪酶标记的抗体；所述金纳米花粒子主要是以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得，其中的反应包括：

(1)将粒径为10～15nm的金纳米粒子、氧化剂、壳聚糖于水相体系中充分混合后用频率为25kHz～45kHz的超声波处理5～10min，制得混合溶液，所述混合溶液中氧化剂的浓度为0.005w t％～0.02wt％，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的浓度为1.04～4.16mg/mL，所述氧化剂包括氯金酸；

(2)向步骤(1)制备的混合溶液中加入还原剂，直至还原剂的浓度为3.2mM～12.8mM，之后在无光条件下搅拌反应10～15min，制得金纳米花粒子，所述还原剂包括抗坏血酸或没食子酸。

2.根据权利要求1所述的金纳米花免疫探针，其特征在于所述示踪酶标记的抗体包括示踪酶标记单克隆抗体或多克隆抗体，所述示踪酶包括辣根过氧化物酶。

3.如权利要求1-2中任一项所述金纳米花免疫探针的制备方法，其特征在于包括：以表面吸附壳聚糖的纳米金种子为模板与还原剂、氧化剂反应而制得金纳米花粒子，并将金纳米花粒子分散于质量浓度为0.02～0.1mg/mL的辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，在温度为0℃～8℃的条件下震荡1h～5h，之后加入牛血清蛋白溶液进行封闭，直至牛血清蛋白的最终浓度为0.2wt％～1wt％，然后在温度为20～27℃、转速为300～600rpm的条件下振荡0.5h～1h，获得所述金纳米花免疫探针。

4.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1-2中任一项所述的金纳米花免疫探针。

5.基于权利要求4所述试剂盒的检测方法，其特征在于包括：

6.基于权利要求4所述试剂盒的检测方法，其特征在于包括：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤A中所述封闭液包括浓度为0.001wt％、分子量为2000～10000的聚乙二醇溶液。

8.基于权利要求5所述的检测方法，其特征在于包括：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于步骤Ⅲ中所述抗体稀释液包括磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M～0.05M、pH值为7.0～8.0，且磷酸盐缓冲液中含有0.1～0.5w t％的明胶和0.05～0.1v/v％的吐温-20。