CN106582848B - 一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。采用“一锅式”原位合成法，碱性条件下，将血红素与氯金酸混合，进而以血红素作为还原剂和稳定剂，实现金的原位生物矿化，制得具有Hemin过氧化物酶催化和金催化活性的Hemin‑AuNCs复合物；发挥其纳米导线功能，促进了Hemin催化反应的电子传输能力，同时增强了对底物的吸附能力，其催化活性显著高于常见Hemin（4倍以上）；制备方法不涉及复杂光电仪器使用，具有催化活性高、操作简单、响应快速、成本低廉等优点。以癌症标志物甲胎蛋白的免疫分析为例，将该Hemin‑AuNCs复合物应用于标记AFP抗体，然后采用酶联免疫吸附法，通过酶催化和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中癌症标志物甲胎蛋白的高灵敏检测。

Description

一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备 方法及应用
技术领域
本发明属于酶催化与传感检测技术领域，涉及一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。
背景技术
酶联免疫吸附法(ELISA) 和金催化银沉积染色法是两种常见的高灵敏检测技术，在疾病标志物（如蛋白质和生物小分子）检测中得到了广泛的应用。这两类检测技术分别涉及抗体的酶标记和金标记，例如，辣根过氧化物酶（HRP）常用于标记抗体，但存在价格昂贵、容易失活、储存条件苛刻等局限性。因此，选用价格低廉又具有高催化活性的类酶催化剂代替HRP成为目前ELISA检测技术领域的研究热点。
此外，氯化血红素和亚铁血红素是HRP等血红素类蛋白质的催化活性中心，能够催化H2O2氧化底物反应产生颜色变化，表现出了类过氧化物酶的活性。然而，将血红素直接应用于各种催化领域仍然面临很大的挑战，例如，血红素本身催化活性低且不溶于水，在水溶液中易聚集成催化活性很低的二聚体，同时，其在氧化性媒介中结构易被破坏而致催化活性减弱。
为了解决这些问题，研究工作者们尝试采用对血红素进行化学修饰或固定化以改良其催化性能。近年来，随着纳米制备技术的高速发展，贵金属纳米材料也被广泛用于改善蛋白酶及其模拟物的催化活性。采用纳米金颗粒修饰过氧化物酶以提高其催化性能的研究已被广泛报道；特别是，经过生物矿化生成的小尺寸（小于5 nm）金纳米颗粒不仅本身具有一定的过氧化物酶活性，而且尚具有优良的催化银沉积活性。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，通过模拟天然酶的催化原理，制备基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，即Hemin-AuNCs复合物。
同时，本发明还提供了上述Hemin-AuNCs复合物的应用，并以癌症标志物甲胎蛋白(AFP)的免疫分析为例，将之应用于标记AFP抗体。进而采用酶联免疫吸附法（ELISA），分别通过酶催化TMB-H2O2比色和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中AFP的高灵敏检测。
本发明的技术方案如下：
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.05～1.25 mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的HAuCl4溶液与Hemin溶液各1.0mL等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入20～200 μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，0～80℃反应1～12 h，离心分离，取上清液去离子水透析处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物）。
步骤（1）中，所述的Hemin溶液，浓度优选0.8 mg/mL。
步骤（2）中，所述的NaOH溶液用量优选120 μL
步骤（2）中，所述的反应，温度优选37℃，时间优选8 h；
步骤（2）中，所述的离心，优选8000 r/s离心20 min；
步骤（2）中，所述透析时间优选12 h；所述的透析采用规格为14 KDa的透析袋。
上述制备方法中，所述室温为20～25℃；所述的溶液均由二次去离子水配制；制得的基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶于4℃保存。
本发明中血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的应用，用于血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）的高灵敏检测,包括酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）和金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）。
所述的酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），通过酶催化TMB-H2O2比色检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin- AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法，步骤为：
1）建立待测样品校准曲线方程：
ⅰ）取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，加PBS缓冲液配制为2mL0.1-0.4mg/mL的Hemin-AuNCs溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）使其浓度分别为100 mM和80 mM，于20～25℃活化培育30min；
步骤ⅰ）中，所述Hemin- AuNCs溶液浓度优选0.35 mg/mL；
ⅱ）将步骤ⅰ）得到体系与AFP抗体溶液混合，使混合后AFP抗体浓度为3.0 μg /mL，4℃孵育10～12h后，用柠檬酸缓冲液或PBS缓冲液洗涤，得到标记Hemin-Au的AFP抗体，备用；
ⅲ）向清洗干净的96孔板中加入10～40 μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液，20～25℃放置0.5～2 h，然后加入20 μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液，20～25℃反应0.5～2 h；
步骤ⅲ）中，所述的96孔板为氨基功能化96孔板；所述壳聚糖的柠檬酸缓冲液优选加入20 μL，20～25℃放置1 h；加入戊二醛的PBS缓冲液后，优选20～25℃反应1 h。
ⅳ）取AFP抗体溶液，采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25 mg /m L的AFP抗体稀释液，将步骤ⅲ）得到体系用PBS缓冲液清洗两次后，加入20 μL AFP抗体稀释液，20～25℃培养5～10 h；
步骤ⅳ）中，优选培养8 h。
ⅴ）将步骤ⅳ）得到体系用PBS缓冲液清洗后，加入质量浓度为0.05～0.2%的牛血清白蛋白（BSA），然后于20～25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点；
步骤ⅴ）中，牛血清白蛋白加入量优选0.10%；
ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.01～0.30 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
步骤ⅵ）中，所述浓度梯度优选12个梯度。
ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）分别向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200 μL TMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20 min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线，得AFP校准曲线方程；
步骤ⅷ）中，所述TMB-H2O2底物显色液配制方法：a）称取TMB溶解于二甲亚砜中配制成1 mg/mL的TMB溶液，避光4℃保存；b）将1.02g柠檬酸和3.68 g NaH2PO4·12H2O加入100mL水中，震荡摇匀，得底物缓冲液，备用；c）将TMB溶液、底物缓冲液和30wt% H2O2按体积比1：9：0.01混合即得。
2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白(AFP）含量：
ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；
ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200 μL TMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20 min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程，确定人体血清样品甲胎蛋白(AFP）的含量。
上述方法中，步骤1）、2）所述柠檬酸缓冲液和PBS缓冲液均为0.1 mol L-1、 pH7.4。
上述方法中，步骤1）、2）所述AFP抗体溶液，规格均为2.0 mg /mL、pH 7.4 PBS、0.05wt% NaN3、40wt%甘油。
所述的酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），检测范围是0.10～45 ng /mL，检测限为0.025 ng /mL。
所述的金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），即采用Hemin- AuNCs复合物作为抗体标记物的金催化银沉积检测方法，步骤包括：
1）建立待测样品校准曲线方程：
步骤ⅰ）-ⅴ）同上述采用Hemin- AuNCs作为抗体标记物的ELISA比色检测方法；
ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.005～25 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）向步骤ⅵ）得到体系中加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100 μL 浓度为50～120μg mL-1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0～5.0 mg mL-1的AgNO3水溶液，20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线及其关系方程，即待测样品校准曲线方程；
步骤ⅵ）中，所述浓度梯度优选12个梯度；
步骤ⅷ）中，加入的抗坏血酸优选100 μg/mL，具体配制步骤为：称取0.01g分析纯抗坏血酸，用10 mL 2wt%的柠檬酸水溶液溶解，得浓度为1 mg/mL的抗坏血酸溶液备用，使用前再用2wt%的柠檬酸水溶液稀释到50～120μg /mL；加入的AgNO3水溶液优选4.5 mg/mL。
2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白(AFP）含量：
ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；
ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，37℃培养1 h后，用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）向步骤ⅵ）得到体系中加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100 μL 浓度为50～120μg mL-1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0～5.0 mg mL-1的AgNO3水溶液，20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程，确定人体血清样品甲胎蛋白(AFP）的含量。
所述的金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），检测范围是0.50 - 35 ng mL−1，检测限为0.1 ng mL−1。
本发明采用“一锅式”原位合成法，在碱性条件下，将血红素（Hemin）与氯金酸（HAuCl4）混合，进而以血红素作为还原剂和稳定剂，实现金的原位生物矿化，制得具有Hemin过氧化物酶催化和金催化活性的Hemin- AuNCs复合物，分别对其形貌和组成进行透射电镜（TEM，图1）和紫外吸收光谱（图2）表征，然后，一方面利用光度分析法研究了该复合物的类过氧化物酶催化活性；另一方面，利用银染法研究了其金催化银沉积功能。最后，以癌症标志物甲胎蛋白(AFP）的免疫分析为例，将该Hemin- AuNCs复合物应用于标记AFP抗体，然后分别通过酶联免疫吸附法（ELISA）和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP）的高灵敏检测。
本发明与现有免疫技术采用的催化材料相比，其主要优势包括：
1）通过“一锅式”原位合成法，在碱性条件下，将血红素（Hemin）与氯金酸（HAuCl4）混合，以血红素作为还原剂和稳定剂，实现金的原位生物矿化，形成具有酶催化和金催化双催化功能的Hemin- AuNCs复合物，不涉及复杂光电仪器使用，具有催化活性高、操作简单、响应快速、成本低廉等优点；
2）通过生物矿化途径形成的金纳米簇，一方面，发挥其纳米导线功能，促进了Hemin催化反应的电子传输能力；另一方面，增强了Hemin-AuNCs中Hemin对底物的吸附能力；由此制得的Hemin-AuNCs复合物，其催化活性显著高于常见Hemin（4倍以上）；
3）制得的Hemin-AuNCs复合物，既具有过氧化物酶的催化活性，同时包含的金簇又具有金催化银沉积的功能，可分别构建ELISA方法和金催化银沉积的信号放大途径，实现对血液中目标物（如AFP）的高灵敏检测。
附图说明
图1 (A) Hemin-AuNCs复合物的透射电镜图； (B) Hemin-AuNCs复合物催化银沉积产物的透射电镜图；
图2（A）不同材料的紫外吸收光谱表征图：(a) Hemin-AuNCs，(b) Hemin，(c)AuNCs，以及相应的实物照片；（B）催化TMB- H2O2反应产物的吸光度曲线图：(a) TMB- H2O2,(b) Hemin, (c) Hemin-AuNCs和(d) Hemin-AuNCs 催化银沉积产物吸光度，及相应的产物照片；
图3（A）Hemin-AuNCs和Hemin催化TMB- H2O2反应随时间的变化;（B）Hemin-AuNCs和Hemin催化环境稳定性研究；
图4 Hemin-AuNCs复合物的合成条件探究（A）Hemin的浓度；（B）NaOH浓度；（C）反应时间；（D）反应温度；
图5 Hemin-AuNCs复合物的催化性能条件探究（A）不同Hemin的浓度；（B）不同NaCl浓度；（C）不同反应温度；（D）不同反应pH值；
图6（A）H2O2浓度对酶催化反应的影响；（B）TMB浓度对酶催化反应的影响；（C）固定TMB浓度，改变H2O2浓度和（D）固定H2O2浓度，改变TMB浓度，Hemin-AuNCs和Hemin 活性的双倒数曲线;（E）和（F）固定一个底物的浓度，连续改变另一个底物的浓度，Hemin-AuNCs和Hemin 活性的双倒数曲线；
图7（A）基于Hemin-AuNCs 酶催化TMB-H2O2比色法测定AFP的校正曲线；（B）基于Hemin-AuNCs 金催化银沉积银染法测定AFP校正曲线；
图8（A）基于Hemin-AuNCs 酶催化TMB-H2O2比色法测定待测人体血清样品AFP的标准曲线；（B）基于Hemin-AuNCs 金催化银沉积银染法测定待测人体血清样品AFP标准曲线。
具体实施方式
下面将通过实施例进一步的描述本发明涉及的双催化功能的Hemin-AuNCs复合物的制备技术。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。凡对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
下述实施例中：氯化血红素，纯度为98%；氯金酸，含金量≥ 47.8%；NaOH为分析纯；柠檬酸缓冲液和PBS缓冲液均为0.1 mol L-1、 pH 7.4；AFP抗体溶液，规格均为2.0 mg /mL、pH 7.4 PBS、0.05wt% NaN3、40wt%甘油。
若无特别说明，室温为20～25℃；溶液均由二次去离子水配制。
实施例1
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.1 mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的1.0 mL HAuCl4溶液与1.0 mL Hemin溶液等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入20μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，37℃反应8h，8000 r/s离心20min，取上清液采用14 KDa的透析袋去离子水透析处理12 h，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物），于4℃保存。
实施例2
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.4mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的1.0 mL HAuCl4溶液与1.0 mL Hemin溶液等体积混合，5min后，剧烈搅拌下加入30 μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，80℃反应2h，8000 r/s离心20 min，取上清液采用14 KDa的透析袋去离子水透析处理12 h，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物），于4℃保存。
实施例3
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.6mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的1.0 mL HAuCl4溶液与1.0 mL Hemin溶液等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入50μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，0℃反应13h，8000 r/s离心20min，取上清液采用14 KDa的透析袋去离子水透析处理12 h，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物），于4℃保存。
实施例4
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.8mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的1.0 mL HAuCl4溶液与1.0 mL Hemin溶液等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入80μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，37℃反应8h，8000 r/s离心20min，取上清液采用14 KDa的透析袋去离子水透析处理12 h，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物），于4℃保存。
实施例5
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度1.2mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的1.0 mL HAuCl4溶液与1.0 mL Hemin溶液等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入100μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，37℃反应8h，8000 r/s离心20 min，取上清液采用14 KDa的透析袋去离子水透析处理12 h，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物），于4℃保存。
实施例6
一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度1.25mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的1.0 mL HAuCl4溶液与1.0 mL Hemin溶液等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入160μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，37℃反应8h，8000 r/s离心20 min，取上清液采用14 KDa的透析袋去离子水透析处理12 h，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物），于4℃保存。
实施例7
酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），即采用Hemin-AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法，步骤为：
1）建立待测样品校准曲线方程：
ⅰ）取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，加PBS缓冲液配制为2mL0.35mg/mL的Hemin-AuNCs溶液，置于试管中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）使其浓度分别为100 mM和80 mM，于20～25℃活化培育30 min；
ⅱ）将步骤ⅰ）得到体系与AFP抗体溶液混合，使混合后AFP抗体浓度为3.0 μg /mL，4℃孵育10h后，用PBS缓冲液洗涤，得到标记Hemin-Au的AFP抗体，备用；
ⅲ）向清洗干净的氨基功能化96孔板中加入20 μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液，20～25℃放置1 h，然后加入20 μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液，20～25℃反应1 h；
ⅳ）取AFP抗体溶液，采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25 mg /m L的AFP抗体稀释液，将步骤ⅲ）得到体系用PBS缓冲液清洗两次后，加入20 μL AFP抗体稀释液，20～25℃培养8 h；
ⅴ）将步骤ⅳ）得到体系用PBS缓冲液清洗后，加入质量浓度为0.10%的牛血清白蛋白（BSA），然后于20～25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点；
ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为浓度分别为 0.01 mg/mL、0.025 mg /mL、0.05 mg /mL、0.08 mg /mL、0.10 mg /mL、0.12 mg /mL、0.15mg /mL、0.18 mg /mL、0.20 mg /mL、0.23 mg /mL、0.25 mg /mL、0.30 mg /mL的12个浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到12份体系中，分别加入200 μL TMB-H2O2底物显色液（TMB-H2O2底物显色液配制方法：a）称取TMB溶解于二甲亚砜中配制成1 mg/mL的TMB溶液，避光4℃保存；b）将1.02g柠檬酸和3.68 g NaH2PO4·12H2O加入100 mL水中，震荡摇匀，得底物缓冲液，备用；c）将TMB溶液、底物缓冲液和30wt% H2O2按体积比 1：9：0.01混合即得），25℃反应20min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线，得AFP校准曲线方程（图7A）；
2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白(AFP）含量：
ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；
ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为12份0.05～55ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）分别向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200 μL TMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20 min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程（图8A），确定人体血清样品甲胎蛋白(AFP）的含量。
检测得本实施例血清样品中AFP含量值为18.23 ng /mL。
本实施例柠檬酸缓冲液和PBS缓冲液均为0.1 mol L-1、 pH 7.4；AFP抗体溶液，规格均为2.0 mg /mL、pH 7.4 PBS、0.05wt% NaN3、40wt%甘油。
实施例8
金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白(AFP），即采用Hemin-AuNCs复合物作为抗体标记物的金催化银沉积检测方法，步骤包括：
1）建立待测样品校准曲线方程：
步骤ⅰ）-ⅴ）同实施例7；
ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为浓度0.005～25 mg /mL的12个浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到的体系中，加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到12份体系中，分别加入100 μL 浓度为100μg mL-1的抗坏血酸（Vc）溶液和100 μL 浓度为4.5mg mL-1的AgNO3水溶液（配制方法：称取0.01g分析纯抗坏血酸，用10 mL 2wt%的柠檬酸水溶液溶解，得浓度为1 mg/mL的抗坏血酸溶液备用，使用前再用2wt%的柠檬酸水溶液稀释到50～120μg /mL），20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线及其关系方程，即待测样品校准曲线方程（图7B）；
2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白(AFP）含量：
ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；
ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为12份浓度梯度0.05～55 ng /mL的人体血清AFP抗原样品溶液，37℃培养1 h后，用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到的体系中，加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100μL浓度为100μgmL-1抗坏血酸溶液和100μL浓度为4.5 mg mL-1 AgNO3水溶液， 25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程（图8B），确定人体血清样品甲胎蛋白(AFP）的含量。
检测得本实施例血清样品中AFP含量值为17.54 ng /mL
本发明实施例双催化功能的Hemin-AuNCs复合物的制备过程及其用于ELISA和金催化银沉积比色法均是在室温下进行的；所用的基底材料为氨基功能化聚苯乙烯96孔板；所用的抗体材料为人体血清AFP。
本发明检测方法与现有的其他方法检测人体血清样品AFP含量对比，结果见表1：
表1 各种方法检测AFP结果对比
本发明Hemin-AuNCs复合物制备条件研究及复合物表征和应用性能的考察，以实施例1产物为例：
首先，采用透射电镜图（TEM，图1）和紫外吸收光谱（图2）对该复合物的形貌与组成，以及催化性能进行了表征和对比；
其次，考察了其催化显色反应时间和环境储存稳定性（图3）；
再次，研究了该复合物的合成条件探究（图4）：Hemin的浓度、NaOH浓度、反应时间、反应温度的影响，复合物的催化反应条件（图5）和催化动力学研究（图6）；
最后，考察了该双催化功能复合物标记抗体应用于免疫检测AFP的性能（图7、8）。
上述实施例结果表明，由此形成的高导电能力的矿化纳米金，可接近或深入Hemin的催化活性中心，极大地发挥其纳米导线功能，促进Hemin-AuNCs中Hemin催化反应的电子传输能力；同时，可增强Hemin对底物的吸附能力；由此制得的Hemin-AuNCs复合物，其催化活性显著高于常见Hemin（4倍以上），同时，矿化的金具有优良的金催化银沉积的功能，并以癌症标志物甲胎蛋白(AFP)的免疫分析为例，将之应用于标记AFP抗体，进而结合经氨基功能化96孔板，分别采用ELISA方法和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中AFP的高灵敏检测。

Claims (5)

1.一种血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶在制备检测血液中癌症标志物甲胎蛋白的试剂中的应用，其特征在于：用于血液中癌症标志物甲胎蛋白的检测，包括酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白和金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白；
所述的通过酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白具体方法为：通过酶催化TMB-H2O2比色检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin- AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法，步骤为：
1）建立待测样品校准曲线方程：
ⅰ）取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，加PBS缓冲液配制为2mL 0.1-0.4mg/mL的Hemin-AuNCs溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺使其浓度分别为100 mM和80 mM，于20～25℃活化培育30 min；
ⅱ）将步骤ⅰ）得到体系与AFP抗体溶液混合，使混合后AFP抗体浓度为3.0μg /mL，4℃孵育10～12h后，用柠檬酸缓冲液或PBS缓冲液洗涤，得到标记Hemin-Au的AFP抗体，备用；
ⅲ）向清洗干净的96孔板中加入10～40 μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液，20～25℃放置0.5～2 h，然后加入20 μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液，20～25℃反应0.5～2 h；
ⅳ）取AFP抗体溶液，采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25 mg /m L的AFP抗体稀释液，将步骤ⅲ）得到体系用PBS缓冲液清洗两次后，加入20 μL AFP抗体稀释液，20～25℃培养5～10 h；
ⅴ）将步骤ⅳ）得到体系用PBS缓冲液清洗后，加入质量浓度为0.05～0.2%的牛血清白蛋白，然后于20～25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点；
ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.01～0.30 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）分别向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200μL TMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20 min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线，得AFP校准曲线方程；
2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量：
ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；
ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200 μL TMB-H2O2底物显色液，20～25℃反应20min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程，确定人体血清样品甲胎蛋白的含量；
所述的金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin-AuNCs复合物作为抗体标记物的金催化银沉积检测方法，步骤包括：
1）建立待测样品校准曲线方程：
步骤ⅰ）-ⅴ）同上述方法；
ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.005～25 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）向步骤ⅵ）得到体系中加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100 μL 浓度为50～120μg mL-1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0～5.0 mg mL-1的AgNO3水溶液，20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线及其关系方程，即待测样品校准曲线方程；
2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量：
ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；
ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，37℃培养1 h后，用PBS缓冲液洗涤两次；
ⅶ）向步骤ⅵ）得到体系中加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；
ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100 μL 浓度为50～120μg mL-1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0～5.0 mg mL-1的AgNO3水溶液，20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程，确定人体血清样品甲胎蛋白的含量；
所述的基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法包括以下步骤：
（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.8 mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的 NaOH溶液；
（2）将步骤（1）制备的HAuCl4溶液与Hemin溶液各1.0 mL等体积混合，5 min后，温剧烈搅拌下加入120μL NaOH溶液，然后在37℃水浴中继续搅拌，反应8 h，8000 r/s离心20 min，取上清液采用规格为14 KDa的透析袋，去离子水透析12h处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的1）中，步骤ⅰ），所述Hemin- AuNCs溶液浓度为0.35 mg/mL；步骤ⅲ），所述的96孔板为氨基功能化96孔板；所述壳聚糖的柠檬酸缓冲液加入20 μL，20～25℃放置1 h；加入戊二醛的PBS缓冲液后， 20～25℃反应1 h；步骤ⅳ），培养时间为8 h；步骤ⅴ），牛血清白蛋白加入量为0.10%；步骤ⅵ），所述浓度梯度为12个梯度。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的酶联免疫吸附法中的1）中，步骤ⅷ），所述TMB-H2O2底物显色液配制方法：a）称取TMB溶解于二甲亚砜中配制成1 mg/mL的TMB溶液，避光4℃保存；b）将1.02g柠檬酸和3.68 g NaH2PO4·12H2O加入100 mL水中，震荡摇匀，得底物缓冲液，备用；c）将TMB溶液、底物缓冲液和30wt% H2O2按体积比 1：9：0.01混合即得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤1）、2）所述柠檬酸缓冲液和PBS缓冲液均为0.1 mol L-1、 pH 7.4；所述AFP抗体溶液，规格均为2.0 mg /mL、pH 7.4 PBS、0.05wt%NaN3、40wt%甘油。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的金催化银沉积信号放大法中，加入的抗坏血酸为100 μg/mL，具体配制步骤为：称取0.01g分析纯抗坏血酸，用10 mL 2wt%的柠檬酸水溶液溶解，得浓度为1 mg/mL的抗坏血酸溶液备用，使用前再用2wt%的柠檬酸水溶液稀释到50～120μg /mL；加入的AgNO3水溶液为4.5 mg/mL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107140750A (zh) * 2017-06-28 2017-09-08 曲阜师范大学 一种多功能模拟酶复合球的制备方法及其应用
CN108333345B (zh) * 2018-02-05 2021-05-14 扬州大学 双模拟酶信号放大的多鸡细胞因子化学发光免疫分析方法
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CN112169717B (zh) * 2020-09-30 2022-06-03 深圳大学 一种微胶囊化氯化血红素及其制备方法与应用
CN112557383B (zh) * 2020-12-10 2024-01-26 贵州大学 一种基于MnO2复合酶模拟物的铜离子比色检测方法
CN115025815A (zh) * 2022-05-31 2022-09-09 江苏大学 一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101221178A (zh) * 2006-11-28 2008-07-16 创盛科技股份有限公司 诊断原发性恶性肝肿瘤肝细胞癌的方法
CN101290321A (zh) * 2008-04-11 2008-10-22 中国医学科学院肿瘤研究所 膜联蛋白a2的血清检测方法、检测试剂盒及其应用
CN102095868A (zh) * 2009-12-11 2011-06-15 上海裕隆生物科技有限公司 甲胎蛋白化学发光定量检测试剂盒
CN101776688A (zh) * 2010-02-08 2010-07-14 江南大学 一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法
CN104614429B (zh) * 2015-02-09 2017-07-04 福州大学 镀金铜热电极的制作和在温度可控h2o2传感器上的应用
CN105628931A (zh) * 2016-01-19 2016-06-01 济南大学 一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用

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