CN110208347B - 一种制备纳米酶探针的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备纳米酶探针的方法，由该方法制得的纳米酶探针作为信号输出手段，提高了生物传感的灵敏度，同时也极大的提高了生物传感的速度从而使得生物传感的信号顺利输出；基于纳米酶探针构建了一种电化学传感检测方法，该方法具有极低的检测限，能检测低至fg级的微量BNP，体现了高度的特异性和灵敏性，适合临床与科学研究；基于纳米酶探针构建了一种比色化学传感的检测方法，具有极快的传感时间和便捷操作，快速简单的检测BNP，适合家庭使用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米酶探针及基于其的脑利钠肽比色/电化学传感的检测方法。
背景技术
由脑和心室心肌细胞分泌的脑利钠肽(BNP)是含有32个氨基酸的肽。BNP在体液平衡中起关键作用。最近的研究表明，BNP升高对心力衰竭，各种呼吸系统疾病的鉴别诊断和急性心肌梗死的评估具有重要意义。BNP的定量测量和实时跟踪对于疾病的治疗和患者的康复具有重要意义。心力衰竭的发生主要是因为心脏无法通过心肌缺陷将血液泵送到每个身体部位。由于心力衰竭表现出各种症状，医生面临着诊断和预后的挑战。
到目前为止，临床上针对BNP的检测主要是抽血化验，使用大型的分析仪器或者简便的试剂盒。这些方法存在着诸多的限制。譬如大型的分析仪器成本高昂，操作复杂，检测时间慢。而简便的试剂盒检测方法又存在检测精度不足，检测限高，且难以区分较低浓度的BNP，保质期短的问题。同时BNP半衰期短的，这为定量测量和实时跟踪带来困扰。近年来，免疫色谱和实时PCR的方法的兴起，也并没有很好地解决高成本和耗时的缺点。
酶标记的方法通常被用于生物传感器，提供信号放大的效率，常见的有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。然而应用天然酶可在电极表面上产生不导电的不溶性产物，并且不溶沉淀可以阻止氧化还原探针的电子转移过程。此外，这些酶在电极界面上的组装由于其有限的稳定性而成为瓶颈。人工模拟酶被用作催化放大器已成为研究趋势。类似于天然酶，模拟酶具有对特定基质的高催化活性，而它们更多比天然酶稳定，不会阻碍信号传递的诸多优点。
血红素是大部分催化氧化酶的活性中心，因此受到广泛关注。很多研究者利用它和DNA构建HRP的模拟酶，在过氧化氢存在的条件下，催化底物氧化。但是固定的血红素存在着不稳定和高成本的风险。
磁性纳米颗粒(MNPs)由于其近年来巨大的生物技术应用而变得具有吸引力。它们的生物相容性和超顺磁性使它们适用于多种生物应用，磁性纳米粒子作为一种良好的磁性生物载体，具有一些吸引人的特性，如比表面积大，可以增加负载生物分子的数量，通过外部磁铁简单分离，避免非特异性吸附，促进抗原与抗体之间的反应，简单易行小型化。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种灵敏度高、特异性强并且简单的基于纳米酶探针的脑利钠肽比色/电化学传感的检测方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何灵敏度高、特异性强并且简单的基于纳米酶探针的脑利钠肽比色/电化学传感的检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种纳米酶探针，包括Hemin-AuNPs纳米酶和靶标蛋白，靶标蛋白与Hemin-AuNPs纳米酶通过静电吸附偶联，Hemin-AuNPs纳米酶含有Hemin和AuNPs，Hemin和AuNPs通过共价键连接。
进一步的，靶标蛋白为脑利钠肽。
本发明提供了一种制备如权利要求1的纳米酶探针的方法，包括如下步骤：
(1)、将PADS溶液加入到沸腾的HAuCl4水溶液中形成混合溶液，按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为3.0～5.0∶1.0～2.0，HAuCl4水溶液中HAuCl4的质量分数为1％；
(2)、将混合溶液冷却回流5～20分钟后，冷却至室温，获得氨基表面修饰的AuNPs为N-AuNPs；
(3)、将250～350μL的Hemin溶液(pH＝10～13)、50～150μL吐温溶液(1％)、10～25mg EDC和0.2～1mg SH-PEG加入到10～15mL N-AuNPs溶液中，在黑暗中孵育1～5小时后，将反应溶液离心10～30分钟，并将所得沉淀物洗涤以除去上清液中未结合的Hemin，然后将Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，得到Hemin-AuNPs溶液；
(4)、将Hemin-AuNPs溶液和靶标蛋白溶液按照体积比9∶1混合，置于30～45℃下孵育5～8小时，使靶标蛋白与Hemin-AuNPs通过静电吸附作用偶联，反应完成后离心10～30分钟，并将所得沉淀物洗涤以除去上清液中未结合的靶标蛋白，然后将靶标蛋白-Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，以获得靶标蛋白-Hemin-AuNPs的纳米酶探针。
进一步的，步骤(1)中按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为5.0∶1.0，PADS溶液的浓度为14mg·mL-1，步骤(3)中Hemin溶液浓度为1mM，pH＝11，步骤(4)中靶标蛋白为脑利钠肽。
本发明还提供了一种基于纳米酶探针的脑利钠肽比色传感的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)制备脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液
在超声波处理下将0.22M EDC溶液、0.22M NHS溶液与10mg/mL MNPs溶液混合15～30分钟，磁分离后，去除第一上清液，使用2～3mL超纯水洗涤后重悬MNPs为MNPs溶液，将100～300uL的0.4mM脑利钠肽抗体溶液加入到MNPs溶液中，连续搅拌60～150分钟，磁分离后，去除第二上清液，使用超纯水洗涤沉淀后重悬MNPs为溶液，获得BNP抗体功能化修饰的MNPs溶液；
(b)在待测溶液中，加入如权利要求1的的纳米酶探针溶液和步骤(a)中制备的脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液形成混合物，将混合物在37℃反应20～40分钟，经过磁分离，取出混合物的上清液待测；
(c)向上清液中加入过氧化氢溶液和ABTS溶液，在30～42℃下充分反应，待反应完全后使用UV-vis检测。
进一步的，步骤(a)中0.22M EDC溶液、0.22M NHS溶液与10mg/mL MNPs溶液是按照体积比1∶1∶1进行混合。
进一步的，步骤(b)中按照体积比，待测溶液∶纳米酶探针溶液∶脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液为10∶1∶1，步骤(c)中按照体积比，上清液∶过氧化氢溶液∶ABTS溶液为8∶1∶1。
本发明还提供了一种基于纳米酶探针的脑利钠肽电化学传感的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(i)制备脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液
在超声波处理下将0.22M EDC溶液、0.22M NHS溶液与10mg/mL MNPs溶液混合15～30分钟，磁分离后，去除第一上清液，使用超纯水洗涤后重悬MNPs为MNPs溶液，将0.4mM脑利钠肽抗体溶液加入到MNPs溶液中，连续搅拌60～150分钟，磁分离后，去除第二上清液，使用超纯水洗涤沉淀后重悬MNPs为溶液，获得脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液；
(ii)制备裸磁性金电极
首先使用0.3μm和0.05μm直径的氧化铝颗粒分别在白色尼龙布和咖啡色绒布在上打磨电极以产生类似镜面的光洁度，然后通过在超纯水和乙醇中分别超声处理电极各五分钟，除去剩余的氧化铝粉末，接下来使用piranha溶液(98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1(v/v))浸泡金电极2～10分钟，彻底除去原先的电极表面修饰材料，再用超纯水冲洗电极，最后，在0.5M的H2SO4溶液中进行循环伏安法扫描0V到1.6V电位区间，清洁并活化电极以除去其它残留的杂质，完成后用氮气吹扫电极使其干燥后备用，得到裸磁性金电极；
(iii)取待测溶液，加入脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液和如权利要求1的纳米酶探针的溶液形成混合物溶液，将裸磁性金电极浸没在混合物溶液中，在37℃反应15～40分钟；
(iv)取出反应后的磁性电极，使用电化学工作站以三电极体系进行测试，工作电极为磁性金电极，对电极为铂电极，参比电极饱选用甘汞电极，采用循环伏安法和电化学阻抗谱表征电极表面修饰，采用差分脉冲伏安法进行电化学检测。
进一步的，步骤(iv)中循环伏安法的扫描电位范围为-0.7V至0.7V，扫描速率为50mV·s-1；电化学阻抗谱的扫描频率为0.1Hz至100kHz，振幅为5mV；差分脉冲伏安法的扫描电位范围为-0.7至0.7V，扫描速率为0.001V·s-1，脉冲振幅50mV，脉冲周期200ms。
进一步的，步骤(iv)中循环伏安法和电化学阻抗谱中所用到的电解液包括5mM K3[Fe(CN)6]3-/4-溶液和0.1M KCl；差分脉冲伏安法所用到的溶液包括10mM H2O2、10mM MB和0.1M PBS缓冲溶液，pH＝8。
技术效果
本发明的纳米酶探针中的Hemin-AuNPs纳米酶与Hemin-G-quadruplex(Hemin-G-四联体)相比，具有更高的催化活性，并且其催化性能在高温下不受限制，而且，催化速率随温度升高而增加；
本发明将BNP蛋白与Hemin-AuNPs纳米酶偶联形成的纳米酶探针，作为信号输出手段，提高了生物传感的灵敏度，同时也极大的提高了生物传感的速度从而使得生物传感的信号顺利输出；
本发明基于纳米酶探针构建了一种电化学传感检测方法，该方法具有极低的检测限，能检测低至fg级的微量BNP，体现了高度的特异性和灵敏性，适合临床与科学研究；
本发明基于纳米酶探针构建了一种比色化学传感的检测方法，具有极快的传感时间和便捷操作，快速简单的检测BNP，适合家庭使用；
本发明的纳米酶探针还直接将血红素固定在金纳米颗粒上，实现了低成本；
本发明利用BNP抗体功能化修饰的磁纳米颗粒，利用磁分离能很容易的从复杂样本中分离目标物BNP，大大简化了预处理步骤，同时避免出现假阳性的结果。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的实施例1的纳米酶的透射电子显微镜的图像；
图2是本发明的实施例1的纳米酶及纳米酶探针的催化性能图；
图3是本发明的实施例2的UV-vis结果图；
图4是本发明的实施例2的FT-IR结果图；
图5是本发明的实施3的比色传感的结果图；
图6是本发明的实施例4的电化学传感的结果图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明中所述的百分比在无特别说明的情况下是指质量百分比。
本发明的技术原理是当待测体系中不存在BNP蛋白时，BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针和BNP抗体功能化修饰的磁纳米颗粒结合，通过磁分离手段除去致使待测体系中不存在BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针，从而不能催化反应。如果检测体系中存在BNP蛋白，则会与BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针竞争结合位点，磁分离之后，溶液中仍然具有BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针，留存的纳米酶探针可以催化过氧化氢氧化底物ABTS，通过紫外比色，可以在421nm波长处获得吸收峰。这个反应可以明显的被肉眼观察到。为了适应更加广泛的检测要求，在对检测时间要求不高的但是需要提高检测精度的情况下，我们改进比色传感器使其适应电化学分析：使用磁性金电极作为工作电极，MB(亚甲基蓝)作为电子转移介质，使其能够对BNP抗体功能化修饰的磁性纳米颗粒探针进行筛选。当检测体系中存在BNP蛋白时，BNP-Hemin-AuNPs就会被竞争出去，以致电极上的模拟酶的量就会减少，从而引起电化学信号的降低。结果显示，电化学方法相比于比色方法具有优越的精度。
实施例1纳米酶探针
BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针包括Hemin-AuNPs的纳米酶和BNP蛋白，其中，Hemin-AuNPs的纳米酶的透射电子显微镜的图像见图1，大小均一，表面圆滑。
为了评估Hemin-AuNPs纳米酶的催化性能，进行了ABTS氧化反应的UV-vis测定。ABTS(10mM)被H2O2(0.5mM)氧化，产生绿色阳离子自由基ABTS*。因此，比色信号可代表这些酶的催化活性。设置空白对照，其他对照组为Hemin-G4组和AuNPs组，实验组为Hemin-AuNPs组和BNP-Hemin-AuNPs组。
结果如图2-A所示，Hemin-AuNPs组与Hemin-G4组、AuNPs组相比，具有更好的催化活性。与Hemin-AuNPs组相比，BNP-Hemin-AuNPs组显示出较慢的催化速率，但产生相同的最终吸收值。因此BNP影响催化速度但不影响反应终点。图2-B验证纳米酶探针在不同pH溶液中的溶解度。结果显示纳米酶探针在中性溶液中在521nm处保持高UV-vis吸光度强度，从而表明当将BNP蛋白修饰到纳米酶探针上时，Hemin的溶解度大大提高。图2-C验证纳米酶在不同温度下的催化性能，结果显示Hemin-AuNPs纳米酶的催化性能在高温下不受限制，而且，催化速率随温度升高而增加。
为了进一步评估纳米酶探针传感器在临床样品中BNP的测定，通过收集心力衰竭患者的真实血液样品获得三个具有不同浓度的BNP的样品。将复杂临床仪器(对照组)的测试结果与我们的传感器(实验组)进行了比较。评估了方法的精密度和准确度，结果见表1。结果显示，纳米酶探针传感器的回收率和RSD分别为112％﹣124％和1.39％﹣4.54％。这些值证实了设计的BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针传感器在真实生物样品中用于BNP检测的优异性能。
表1纳米酶探针与临床仪器检测临床样本中BNP的含量
实施例2 BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针的制备
所有使用的玻璃器皿预先在王水(HCl∶HNO3体积比为3∶1)中除去杂质后，用超纯水冲洗后干燥使用。将预先备好的14mg·mL-1PADS溶液(14mg·mL-1浓度的帕米膦酸二钠盐水溶液)快速加入到沸腾的20mL HAuCl4水溶液(1％)中，PADS∶HAuCl4二者的质量比为5.0∶1.0，可观察溶液颜色从浅黄色变为无色，然后呈深红色。然后将溶液冷却回流10分钟，并冷却至室温，获得氨基表面修饰的AuNPs(N-AuNPs)。用酰胺化化学合成方法以在N-AuNPs上偶联氯化血红素(Hemin)。即，将300μL的1mM Hemin溶液(pH＝11)，100μL吐温溶液(1％)，15mgEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.5mg SH-PEG(巯基-聚乙二醇)加入到10mL N-AuNPs(2.5nM)溶液中。在黑暗中孵育3小时。将反应溶液以10,000rpm，离心10分钟，并将所得沉淀物洗涤两次以除去上清液中未结合的Hemin。然后将Hemin-AuNPs重悬于超纯水中。取9mL Hemin-AuNPs溶液和1mL BNP溶液(10ng/mL)混合，置于37℃下孵育6小时，使BNP蛋白与Hemin-AuNPs通过静电吸附作用偶联。反应完成后溶液以10,000rpm，离心10分钟，并将所得沉淀物洗涤两次以除去上清液中未结合的BNP蛋白。然后将BNP-Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，获得Hemin-BNP-AuNPs的纳米酶探针的溶液。
使用UV-vis光谱(UV-vis)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征制备的Hemin-AuNPs溶液和BNP-Hemin-AuNPs的纳米酶探针溶液。
UV-vis的结果如图3所示，Hemin-AuNPs溶液在521nm处显示出吸收峰，这是AuNPs的特征。在389nm处的尖锐吸收峰是Hemin(氯化血红素)的特征峰。该结果证明氯化血红素与N-AuNPs表面结合。在BNP与H-AuNPs结合后，AuNPs的特征吸光度红移至534nm，BNP的特征吸收峰出现在260nm处。该结果证明BNP已成功结合到Hemin-AuNPs表面。
FT-IR的结果如图4所示，Hemin-AuNPs的曲线上的2959和1645cm-1处的特征振动频率可以证实在N-AuNPs上存在Hemin，3406cm-1处的峰对应为N-AuNPs的-NH2基团的特征峰，此外，N-AuNPs证明-NH2基团与Hemin共价结合，导致酰胺键在1298cm-1处出现的特征吸收峰；BNP-Hemin-AuNPs的曲线上有大量氨基特征峰，在1650和1260cm-1处的峰归因于肽键的特征吸收，并且在500cm-1附近的峰对应于苯环的吸收。
实施例3基于纳米酶探针的脑利钠肽比色传感的检测方法
首先在超声波处理下将1mL的0.22M EDC溶液、0.22M NHS溶液(N-羟基琥珀酰亚胺)与10mg/mL MNPs溶液混合30分钟。磁分离后，去除第一上清液，使用超纯水洗涤沉淀，反复该步骤三次。使用超纯水重悬MNPs为溶液。将200μL BNP抗体溶液(0.4mM)加入到3mL的MNPs溶液中，连续搅拌120分钟。磁分离后，去除第二上清液，使用超纯水洗涤沉淀，反复该步骤三次后重悬BNP抗体功能化修饰的MNPs为溶液，即Anti-BNP-MNPs溶液。取10mL待测溶液，加入实施例1中的Hemin-BNP-AuNPs的纳米酶探针的溶液和Anti-BNP-MNPs溶液各1mL，并将所得混合物在37℃反应30分钟。磁分离后，取出上清液8mL待测。向该上清液中加入1mL过氧化氢溶液(40mM)和1mL ABTS溶液(40mM)，在37℃下充分反应，待反应完全后使用UV-vis检测。
如图5A所示，随着BNP浓度从5ng/mL增加至25ng/mL，上清液的吸光度逐渐增加。该结果表明磁分离后上清液中纳米酶探针浓度的增加。在BNP存在下，它占据抗BNP-MNPs表面上的抗原结合位点。因此，纳米酶探针不能与Anti-BNP-MNPs相互作用并在磁性分离后保留在上清液中。如图5B所示，随着BNP浓度从5ng/mL增加至25ng/mL，吸光度值增加，在相同范围内对酶浓度表现出线性响应。线性相关方程为y＝0.30954x+0.74503，相关系数为0.99584。通过插入平均值加上零标准的标准偏差的三倍，计算出检测限为802.30pg/mL，这低于先前报道的比色检测研究所提供的检测限。计算出BNP浓度范围为5ng/mL至25ng/mL的三个独立实验的三个斜率的计算相对标准偏差(RSD)为3.46％，这证实了该比色生物传感器的可接受的精确度和再现性。
实施例4基于纳米酶探针的脑利钠肽电化学传感的检测方法
Anti-BNP-MNPs溶液的制备
首先在超声波处理下将1mL的0.22M EDC溶液、0.22M NHS溶液与10mg/mL MNPs溶液混合30分钟。磁分离后，去除第一上清液，使用超纯水洗涤沉淀，反复该步骤三次。使用3mL的超纯水重悬MNPs为溶液。将200μL BNP抗体溶液(0.4mM)加入到上述MNPs溶液中，连续搅拌120分钟。磁分离后，去除第二上清液，使用超纯水洗涤沉淀，反复该步骤三次后重悬BNP抗体功能化修饰的MNPs为溶液，即Anti-BNP-MNPs溶液。
裸磁性金电极的制备
首先使用0.3和0.05μm直径的氧化铝颗粒分别在白色尼龙布和咖啡色绒布在上打磨电极以产生类似镜面的光洁度。然后通过在超纯水和乙醇中分别超声处理电极各五分钟，除去剩余的氧化铝粉末。接下来使用piranha溶液(98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1(v/v))浸泡金电极(直径3.0mm)5分钟，彻底除去原先的电极表面修饰材料，再用超纯水冲洗电极。最后，在0.5M的H2SO4溶液中进行循环伏安法扫描0V到1.6V电位区间，清洁并活化电极以除去其它残留的杂质。完成后用氮气吹扫电极使其干燥后备用，得到裸磁性金电极。
脑利钠肽电化学传感的检测
取10mL待测溶液，加入实施例2中的Hemin-BNP-AuNPs的纳米酶探针溶液和Anti-BNP-MNPs溶液各1mL，得混合物溶液。取裸磁性金电极，浸没在混合物溶液中，并将所得混合物溶液在37℃反应30分钟。取出反应后的磁性金电极，在电化学工作站中进行电化学检测。本实验采用三电极体系进行电化学实验。工作电极为磁性金电极，对电极为铂电极，参比电极饱选用甘汞电极。实验中采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)表征电极表面修饰，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行电化学检测。CV和EIS的电解液为5mM K3[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含有0.1M KCl)，CV的扫描电位范围为-0.7V至0.7V，扫描速率为50mV·s-1，EIS在0.1Hz至100kHz的频率范围内扫描测定，振幅为5mV。差分脉冲伏安法(DPV)在10mM H2O2,10mM MB和0.1M PBS buffer溶液(pH 8)中扫描测定。扫描电位范围为-0.7至0.7V，扫描速率为0.001V·s-1，脉冲振幅50mV，脉冲周期200ms。
图6为使用纳米酶探针检测不同浓度的BNP在PBS缓冲溶液和血液样本中的DPV电化学数据的校准图。
结果显示，随着BNP浓度的增大，获得的电化学峰电流越小。并且纳米酶探针在检测人血浆方面表现良好。缓冲溶液中的线性相关方程为y＝-0.01734x+4.16893，相关系数为0.99089。血液中的线性相关方程为y＝-0.01574x+3.53807，相关系数为0.98901。等离子体的复杂组分对传感器的催化性能有轻微影响，并降低了电化学峰值。通过内插平均值加上零标准的标准偏差的三倍，在缓冲溶液和人血浆中的检测限分别计算为0.0237和0.0663pg/mL。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种制备纳米酶探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将PADS溶液加入到HAuCl4水溶液中形成混合溶液，按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为3.0～5.0∶1.0～2.0，HAuCl4水溶液中HAuCl4的质量分数为1％；
(2)将所述混合溶液冷却回流5～20分钟后，冷却至室温，获得氨基表面修饰的AuNPs为N-AuNPs；
(3)将250～350μL pH＝10～13的Hemin溶液、50～150μL吐温溶液、10～25mg EDC和0.2～1mg SH-PEG加入到10～15mL N-AuNPs溶液中，闭光孵育1～5小时后，将反应溶液离心10～30分钟，然后将颗粒物Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，得到Hemin-AuNPs溶液；
(4)将所述Hemin-AuNPs溶液和靶标蛋白溶液按照体积比9∶1混合，置于30～45℃下孵育5～8小时，反应完成后离心10～30分钟，然后将获得物靶标蛋白-Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，以获得靶标蛋白-Hemin-AuNPs的纳米酶探针的溶液。
2.如权利要求1所述的制备纳米酶探针的方法，其中，步骤(1)中按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为5.0∶1.0，所述PADS溶液的浓度为14mg·mL-1，步骤(3)中Hemin溶液浓度为1mM，pH＝11，步骤(4)中靶标蛋白为脑利钠肽。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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