CN115025815A - 一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶联免疫分析技术领域，具体涉及一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF‑8及其应用。本发明合成一种基于金属有机框架材料的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF‑8，具有高效的类过氧化物酶催化活性和很好的稳定性。以其作为BPA抗体标记物具有信号放大作用，利用抗原‑抗体的特异性识别，加入目标物，通过目标物和抗原的竞争作用，进而构建一种间接竞争酶联免疫分析法。可用于检测环境样本中的BPA。Hemin@BSA@ZIF‑8可放大检测信号，有效避免如环境温度、pH值、离子强度等极端反应条件对天然酶活性的破坏及影响，提高复杂样品检测过程中的耐受性和稳定性。灵敏度高，检测限可达0.546 ng/mL；具有操作简便、稳定性强、准确性好，成本低等优点。

Description

一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8及其应用
技术领域
本发明属于酶联免疫分析技术领域，具体涉及一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8及其应用。
背景技术
双酚A(BPA)是一种常见的内分泌干扰物，目前已被广泛应用于各种消费品中，尤其是婴儿用品。研究表明，BPA是一种具有生殖毒性的有机污染物，BPA的长期低剂量暴露会影响人体性激素的正常功能，可能导致睾丸萎缩、生殖道畸形甚至不育等。它的广泛使用/滥用，可对人们的健康造成严重的危害。因此，针对BPA建立高灵敏度、快速的分析检测方法，明确该类化合物在环境中的分布状况和污染水平是十分有必要的。
基于抗体的酶联免疫分析法具有快速、简单、高通量的特点，在环境中新型有机污染物的分析检测方面具有广泛的应用前景。由于其高效的催化活性，辣根过氧化物酶(HRP)常被用作传统酶联免疫分析法的抗体标记物，但其制备成本高、稳定性差、易变性等缺点也限制了酶联免疫分析法在复杂样品检测中的分析性能。近年来，具有类酶催化作用的纳米酶的合成与应用成为了各个研究领域的热点，也为HRP替代物的开发提供了一种新策略。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8及其应用。本发明基于金属有机框架材料ZIF-8制备具有类过氧化物酶催化活性的仿生纳米酶，并以此作为BPA抗体标记物，构建一种间接竞争酶联免疫分析法。放大检测信号，提高BPA的检测效率，具有良好的应用前景。
为达到以上目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种Hemin@BSA@ZIF-8的制备方法，包括如下步骤：
（1）BSA 溶于水中得到溶液A，氯化血红素溶于二甲亚砜中得到溶液B；将溶液A，溶液B和水混合后孵育反应；反应产物置于超纯水中透析，得到Hemin@BSA；
（2）将步骤（1）Hemin@BSA加入到Zn(CH3COO)2·2H2O溶液中，持续搅拌加入2-甲基咪唑溶液，搅拌后洗涤产物，离心、真空干燥得到Hemin@BSA@ZIF-8。
进一步，步骤（1）中所述溶液A的浓度为1~2 mg/mL，所述溶液B的浓度为1 mg/mL；所述溶液A、溶液B和水的体积比为4：1：3。
步骤（1）中所述孵育反应的条件为25~37℃，反应30~40 min。
步骤（1）中所述透析的时间为36~48 h。
步骤（2）中所述Zn(CH3COO)2·2H2O的浓度为40 mM，2-甲基咪唑溶液的浓度为160mM；所述Hemin@BSA、Zn(CH3COO)2·2H2O和2-甲基咪唑溶液的体积比为1~3：1：1。
步骤（2）中所述洗涤为用甲醇和SDS溶液洗涤2次以上，洗涤时间为10~15 min/次。
本发明还提供了上述制备方法制备的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8。
本发明还提供了上述的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8在BPA检测领域中的应用。
本发明还提供了一种间接竞争酶联免疫分析法的构建方法，具体包括步骤：
（1）将Hemin@BSA@ZIF-8和PBS溶液在常温下磁力搅拌至完全溶解后加入BPA抗体，恒温搅拌得到BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab；
（2）抗原包被：将BPA包被原用CBS包被缓冲液稀释至工作液浓度1:8000，包被于96孔板上，4℃过夜或37℃两小时孵育；孵育结束后，甩干酶标板，用含有0.05 % Tween-20的PBS溶液洗板3-5次，拍干备用；
（3）封闭：使用封闭缓冲液对步骤（2）中得到的酶标板进行封闭，恒温孵育1-2 h；孵育结束后甩干酶标板，洗板、拍干备用；
（4）BPA抗体标记物/标准品或样品竞争反应：使用抗体稀释液将步骤（1）得到的BPA抗体标记物稀释至工作浓度1:4；根据所设置标准曲线检测范围，稀释BPA标准储备液；然后将BPA抗体标记物溶液和标准品/样品溶液等体积加入酶标板中，空白对照组加BPA抗体标记物溶液和等体积PBS缓冲液，恒温孵育；孵育结束后甩干酶标板，洗板、拍干备用；
（5）显色反应：步骤（4）反应结束加入含有TMB和H2O2的底物缓冲液，继续恒温孵育；显色后，向每孔中加入H2SO4溶液，终止反应，使用多功能酶标仪读取450 nm波长下吸光度值；
（6）原始数据处理：对原始数据进行初步处理，以BPA标准品浓度为横坐标，以不同浓度BPA对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，利用Origin 2021软件拟合标准曲线。
进一步地，步骤（1）中所述Hemin@BSA@ZIF-8、PBS溶液和BPA抗体的用量比例关系为：1.25 mg：1 mL：1~5μL；所述BPA抗体的浓度为1.9 μg/mL。
步骤（3）中所述封闭缓冲液中含有明胶的CBS溶液；明胶的质量分数为1%；所述封闭缓冲液的用量为200 μL/孔。
步骤（4）中所述的抗体稀释液为含有0.01 % tween-20和0.1%明胶的PBS缓冲液。
步骤（5）中所述底物缓冲液为含有TMB和H2O2的水溶液；所述底物缓冲液中TMB、H2O2、H2O的体积比为2μL: 1μL:7μL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明合成了一种基于金属有机框架材料（ZIF-8）的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8。与传统的多孔材料相比， ZIF-8多孔内腔中独特的限域效应有利于提高底物或中间体的扩散效率，在其空腔内形成多重循环反应，从分子层面改善内部催化剂的表观催化性能，具有高效的类过氧化物酶催化活性。 同时，ZIF-8高度的结晶性提供一个刚性结构，保护其免受外部环境的破坏，避免催化剂中毒或失活，具有很好的稳定性。本发明以仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8作为BPA抗体标记物，待测目标物的特异性抗体通过静电吸附作用偶联到Hemin@BSA@ZIF-8上，形成具有信号放大作用的纳米酶-抗体标记物；利用抗原-抗体的特异性识别，加入目标物，通过目标物和抗原的竞争作用，进而构建一种间接竞争酶联免疫分析法。用于检测环境样本中的BPA。与现有检测方法相比，Hemin@BSA@ZIF-8可放大检测信号，有效避免如环境温度、pH值、离子强度等极端反应条件对天然酶活性的破坏及影响，提高复杂样品检测过程中的耐受性和稳定性。灵敏度高，检测限可达0.546 ng/mL；具有操作简便、稳定性强、准确性好，成本低等优点。
附图说明
图1是Hemin@BSA@ZIF-8的透射电镜图；
图2是紫外可见吸收光谱谱图；a为BSA；b为ZIF-8；c为 ZIF-8/BSA；d为Hemin@ZIF-8；e为Hemin@BSA@ZIF-8；
图3是类过氧化物酶活性对比图；
图4是Hemin@BSA@ZIF-8@Ab对不同包被原的识别反应图；其中，(a)是PBS空白组，(b) 是Hemin@BSA@ ZIF-8+PBS组；(c) 是Hemin@BSA@ ZIF-8+抗原组；(d) 是Hemin@BSA@ZIF-8@Ab+抗原组；
图5是间接竞争酶联免疫分析法的构建原理图；
图6是双酚A检测的标准曲线图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种Hemin@BSA@ZIF-8的制备方法，包括如下步骤：
（1）BSA 溶于水中得到浓度为1~2 mg/mL的溶液A，氯化血红素溶于二甲亚砜中得到浓度为1 mg/mL的溶液B；将溶液A，溶液B和水按体积比4：1：3混合后25~37℃孵育反应30~40 min；反应产物置于超纯水中透析36~48 h，得到Hemin@BSA；
（2）将步骤（1）Hemin@BSA加入到浓度为40 mM的 Zn(CH3COO)2·2H2O溶液中，持续搅拌加入浓度为160 mM的2-甲基咪唑溶液，Hemin@BSA、Zn(CH3COO)2·2H2O和2-甲基咪唑溶液的体积比为1~3：1：1；搅拌后用甲醇和SDS溶液洗涤2次以上，洗涤时间为10~15 min/次。产物离心、真空干燥得到Hemin@BSA@ZIF-8。
本发明还提供了上述制备方法制备的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8。
本发明还提供了上述的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8在BPA检测领域中的应用。
实施例1：Hemin@BSA@ZIF-8的制备
（1）取1 mg牛血清蛋白(BSA)溶于1 mL水中制得溶液A，1 mg氯化血红素溶于1 mL二甲亚砜(DMSO)中制得溶液B；取500 μL溶液A，125 μL溶液B和375 μL纯水混合置于1.5 mL离心管中，在37℃下孵育30 min，将产物浸入超纯水中在常温下透析 48小时，得到Hemin@BSA；4℃保存备用。
（2）取1 mL步骤（1）制备的Hemin@BSA，与1 mL浓度为40 mM 的Zn(CH3COO)2·2H2O溶液混合，持续搅拌5 min，加入1 mL 浓度为160 mM的2-甲基咪唑溶液，继续常温搅拌12小时，所得固体产物用甲醇和SDS溶液多次洗涤去除多余反应物和蛋白，10000 r/min离心洗涤产物，洗涤时间为15 min/次，60℃下真空干燥12 h得到 Hemin@BSA@ZIF-8。
图1是Hemin@BSA@ZIF-8的透射电镜图；由图1可见，制备得到的Hemin@BSA@ZIF-8为正十二面体结构，与ZIF-8的形貌一致，证明Hemin@BSA@ZIF-8已成功合成。
实施例2：Hemin@BSA@ZIF-8的催化活性
本实施例中以经典的过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)为显色剂，H2O2作为•OH的主要来源，对实施例1所制备Hemin@BSA@ZIF-8的类过氧化物酶活性进行验证。
底物显色液的配置：分别取10 μL TMB和6 μL H2O2水溶液分别加入到184 μLNa2HPO4/柠檬酸缓冲液中，最终体积为200 μL，其中，TMB浓度为0.4 mM，H2O2浓度为8 mM；
向底物显色液中加入5 μL浓度为 0.05 mg/mL的Hemin@BSA@ZIF-8甲醇溶液，另外，分别以同体积的BSA、ZIF-8、ZIF-8/BSA、Hemin@ZIF-8作为对照，37℃下孵育20 min，使用多功能酶标仪读取650 nm处吸光度值并利用Origin 2021软件进行图表绘制。
图2是紫外可见吸收光谱谱图；a为BSA；b为ZIF-8；c为 ZIF-8/BSA；d为Hemin@ZIF-8；e为Hemin@BSA@ZIF-8。由图2可见，a、b、c未引起吸光度值的增大，为一条直线；曲线d的吸光度值较低，曲线e在波长650nm左右具有较高的吸光度。表明BSA、ZIF-8、ZIF-8/BSA三种物质单独存在不具有类过氧化物酶活性，加入底物显色液中不会引起颜色变化和吸光度值增大；由于hemin本身具有一定催化作用，因此Hemin@ZIF-8加入可引起颜色变化，但溶液颜色较浅，吸光度值较低。而制备的Hemin@BSA@ZIF-8具有优异的类过氧化物酶活性；其催化效果显著强于Hemin@ZIF-8。
实施例3：Hemin@BSA@ZIF-8的稳定性和耐受性
本实施例在模拟的恶劣环境（胰蛋白酶，二甲基甲酰胺，95℃，95℃/二甲基甲酰胺）中对Hemin@BSA及Hemin@BSA@ZIF-8的稳定性和耐受性进行验证，同时设置空白对照组，每组三个平行。以TMB比色反应作为判断依据。图3是类过氧化物酶活性对比图；其中灰色柱状图作为对照组，以A/A0×100%计算，A0为对照组吸光度；如图3所示，与空白对照组相比，模拟的恶劣环境中对TMB/H2O2溶液的吸光度值均显示出不同程度的降低，但Hemin@BSA@ZIF-8的有效催化活性范围为74%-92%，而Hemin@BSA的催化效率损失最高达58.8%；表明相较于Hemin@BSA，制备的Hemin@BSA@ZIF-8具有较好的稳定性和耐受性能；负载的ZIF-8外壳对外界环境表现出更强的防御能力，在提高活性物质的耐受性、稳定性方面具有不可替代的作用。
实施例4：BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab的制备
称取1.25 mg实施例1制备的Hemin@BSA@ZIF-8于西林瓶中，加入1 mL PBS溶液，常温下磁力搅拌至完全溶解后加入1 μL 1.9 μg/mL BPA抗体，恒温搅拌12 h得到BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab。将制得的产物离心、洗涤，复溶在PBS溶液中，置于4°C保存备用。
参照上述BPA抗体标记物的制备方法，将加入的BPA抗体替换为不同的合成探针，制备具有不同探针的标记物，分别为Hemin@BSA@ZIF-8+PBS和Hemin@BSA@ZIF-8@Ab+包被原。同时，以PBS空白组作为对照验证BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab的是否成功制备。图4是Hemin@BSA@ZIF-8@Ab对不同包被原的识别反应图；其中，(a)是PBS空白组，(b) 是Hemin@BSA@ ZIF-8+PBS组；(c) 是Hemin@BSA@ ZIF-8+抗原组；(d) 是Hemin@BSA@ZIF-8@Ab+抗原组；如图4可见，当Hemin@BSA@ZIF-8@Ab加入板孔内后，溶液的吸光度与其他组相比明显的增加，通过BPA包被原和Hemin@BSA@ZIF-8@Ab之间的特异性识别作用Hemin@BSA@ZIF-8附着在板孔上，表明BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab已成功制备。
实施例5：间接竞争酶联免疫分析法的构建
（1）抗原包被：用包被缓冲液(CBS)将BPA包被原稀释至工作液浓度1:8000，取100μL/孔包被液加入96孔板中，4℃过夜或37℃两小时孵育；孵育结束后，使用含0.05 %Tween-20的PBS溶液洗板，洗板时间为60秒/次，洗板次数3-5次，拍干备用；
（2）封闭：使用含有1%明胶的CBS溶液作为封闭缓冲液，对洗涤后的酶标板进行封闭，封闭液的体积为200 μL/孔，在37℃下孵育1-2 h；孵育结束后，使用含0.05 % Tween-20的PBS溶液洗板，洗板时间为60秒/次，洗板次数3-5次，拍干备用；
（3）BPA抗体标记物/标准品或样品竞争反应：使用抗体稀释液将BPA抗体标记物溶液稀释至工作浓度1:4，抗体稀释液为含有0.01 % tween-20和0.1%明胶的PBS缓冲液；设置BPA标准曲线检测范围为0、1、3、9、27、81、243、729 ng/mL，使用PBS缓冲液稀释BPA标准储备液；分别取BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab溶液和标准品/样品溶液各50 μL/孔加入酶标板中，空白对照组加入同体积的BPA抗体标记物和PBS缓冲液，37℃下孵育30 min；使用含0.05 % Tween-20的PBS溶液洗板，洗板时间为60秒/次，洗板次数3-5次，拍干备用；
（4）显色反应：向步骤（3）得到的酶标板中加入含有1 mM TMB和30 mM H2O2的底物缓冲液（TMB: H2O2: H2O=2μL: 1μL:7μL）；在37℃下孵育30 min；显色结束后，向孔内加入50μL/孔2 mM H2SO4溶液终止反应，使用多功能酶标仪读取450 nm波长下每孔吸光度值；
（5）原始数据处理：使用Excel软件对原始数据进行处理，以BPA抗体标记物/标准品或样品浓度为横坐标，以不同浓度BPA对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，利用Origin 2021软件拟合S型标准曲线。
图5是间接竞争酶联免疫分析法的构建原理图；图6是双酚A（BPA）检测的标准曲线图；如图6所示，BPA浓度和对应的吸光度值呈良好的线性关系。根据拟合结果计算，构建的间接竞争酶联免疫分析法检测范围为1~729 ng/mL，检测限为0.546 ng/mL。与传统ELISA法相比（检测限为2.61 ng/mL），灵敏度提高了4.78倍。
分别用本发明的间接竞争酶联免疫分析法和传统ELISA法对市售的瓶装水、罐装食品和奶瓶中的BPA进行检测。表1 是双酚A分析检测结果。
表1. 环境和食品样本中双酚A的分析检测
样品种类 传统ELISA （ng/mL） 间接竞争酶联免疫分析法（ng/mL） 变异系数（%）
瓶装水1 未检出 未检出 —
瓶装水2 3.102 2.714 3.259
罐装食品1 3.773 3.245 5.645
罐装食品2 未检出 1.627 6.332
奶瓶1 未检出 未检出 —
奶瓶2 未检出 1.123 5.218
如表1所示，与传统ELISA法相比，本发明所提供的间接竞争酶联免疫分析法方检测限更低，灵敏度更高，变异系数＜10%，具有良好的准确性和稳定性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.一种仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8的制备方法，包括如下步骤：
（1）BSA 溶于水中得到溶液A，氯化血红素溶于二甲亚砜中得到溶液B；将溶液A、溶液B和水混合后孵育反应；反应产物置于超纯水中透析，得到Hemin@BSA；
（2）将步骤（1）得到的Hemin@BSA加入到Zn(CH3COO)2·2H2O溶液中，持续搅拌加入2-甲基咪唑溶液，搅拌后洗涤产物，离心、真空干燥得到Hemin@BSA@ZIF-8。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述溶液A的浓度为1~2mg/mL，溶液B的浓度为1 mg/mL；所述溶液A、溶液B和水的体积比为4：1：3。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述孵育反应的条件为25~37℃，反应30~40 min；所述透析的时间为36~48 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述Zn(CH3COO)2·2H2O的浓度为40 mM，2-甲基咪唑溶液的浓度为160 mM；所述Hemin@BSA、Zn(CH3COO)2·2H2O和2-甲基咪唑溶液的体积比为1~3：1：1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述洗涤为用甲醇和SDS溶液洗涤2次以上，洗涤时间为10~15 min/次。
6.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法制备的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8。
7.权利要求6所述的仿生纳米酶Hemin@BSA@ZIF-8在BPA检测领域中的应用。
8.一种间接竞争酶联免疫分析法的构建方法，其特征在于，具体包括步骤：
（1）将Hemin@BSA@ZIF-8和PBS溶液在常温下磁力搅拌至完全溶解后加入BPA抗体，恒温搅拌得到BPA抗体标记物Hemin@BSA@ZIF-8@Ab；
（2）抗原包被：将BPA包被原用CBS包被缓冲液稀释至工作液浓度1:8000，包被于96孔板上，4℃过夜或37℃两小时孵育；孵育结束后，甩干酶标板，用含有0.05 % Tween-20的PBS溶液洗板3-5次，拍干备用；
（3）封闭：使用封闭缓冲液对步骤（2）中得到的酶标板进行封闭，恒温孵育1-2 h；孵育结束后甩干酶标板，洗板、拍干备用；
（4）BPA抗体标记物/标准品或样品竞争反应：使用抗体稀释液将步骤（1）得到的BPA抗体标记物稀释至工作浓度1:4；根据所设置标准曲线检测范围，稀释BPA标准储备液；然后将BPA抗体标记物溶液和标准品/样品溶液等体积加入酶标板中，空白对照组加BPA抗体标记物溶液和等体积PBS缓冲液，恒温孵育；孵育结束后甩干酶标板，洗板、拍干备用；
（5）显色反应：步骤（4）反应结束加入含有TMB和H2O2的底物缓冲液，继续恒温孵育；显色后，向每孔中加入H2SO4溶液，终止反应，使用多功能酶标仪读取450 nm波长下吸光度值；
（6）原始数据处理：对原始数据进行初步处理，以BPA标准品浓度为横坐标，以不同浓度BPA对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，利用Origin 2021软件拟合标准曲线。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述Hemin@BSA@ZIF-8、PBS溶液和BPA抗体的用量比例关系为：1.25 mg：1 mL：1~5μL；所述BPA抗体的浓度为1.9 μg/mL。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于， 步骤（3）中所述封闭缓冲液中含有明胶的CBS溶液，明胶的质量分数为1%；步骤（4）中所述的抗体稀释液为含有0.01 % tween-20和0.1%明胶的PBS缓冲液；步骤（5）中所述底物缓冲液为含有TMB和H2O2的水溶液；所述底物缓冲液中TMB、H2O2、H2O的体积比为2μL: 1μL:7μL。
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