CN116515843A - 一对特异识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体、检测该抑制因子的试剂盒及其应用 - Google Patents
一对特异识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体、检测该抑制因子的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一对特异识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体、检测该抑制因子的试剂盒及其应用，所述特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体包括：核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适配体Aptamer1以及核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸适配体Aptamer2。所述检测大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒包括：一种结合有前述的核酸适配体Aptamer1和pH指示剂分子的纳米颗粒、修饰有前述核酸适配体Aptamer 2的器皿。上述核酸适配体Aptamer1和Aptamer2分别特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的不同部位并与之结合，并形成特有的带有PH指示剂分子的夹心结构，从而实现大豆胰蛋白酶抑制因子的检测，这种试剂盒的操作简单，省去复杂的样品前处理和提纯，检测特异性和灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质或多肽类检测技术领域，尤其涉及一对特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体、检测大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒及其应用。
背景技术
大豆中含有丰富的蛋白质和营养元素，属于植物蛋白中为数不多的优质蛋白质来源。然而大豆中也含有多种抗营养因子，胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、抗原蛋白、异黄酮、单宁和生物碱等。比如大豆凝集素，可凝集动物红细胞，降低食欲，也会导致肠壁损伤，产生一系列免疫反应，增加内源氮排出量和内源蛋白的分泌；大豆抗原会导致动物产生肠绒毛萎缩、腺窝细胞增生，也会导致肠道吸收功能降低，影响肠壁完整性，甚至出现过敏反应或延缓生长发育等症状；作为抗营养因子的皂甙会抑制胰凝乳蛋白酶和胆碱脂酶活性，影响肠道渗透性；还有抗维生素因子会降低维生素的有效性，干扰动物对维生素的利用，引起维生素缺乏症。而众多抗营养因子中，胰蛋白酶抑制因子在大豆的抗营养因子中含量较高，是一类主要的抗营养因子，它对动物的危害主要包括增加胰腺的合成与分泌，降低胰(糜)蛋白酶活性，导致胰腺增生、肿大，甚至抑制动物生长等方面。
由此看来，胰蛋白酶抑制因子会对动物消化、吸收营养物质造成不良影响，严重危害了人类及动物健康，限制了大豆在食品工业及饲料工业中的应用。因此，如何准确检测这类大豆抗营养因子已成为相关学者们的研究热点方向。
但是目前，较为成熟的检测方法有脲酶检测法、酶化学检测法和免疫检测法，其中，脲酶检测法、酶化学检测法检测结果的敏感性、稳定性易受环境影响，导致检测结果误差较大。而免疫检测法是一种经典的检测方法，因其具有简便快速、敏感特异且不需要大型仪器设备等优点在大豆抗营养因子检测中也广泛应用，但该方法也存在众多缺陷，如合成成本高，易受外界环境的干扰，稳定性差等。
因此，有必要建立新型的高效的大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法及产品，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体及其应用，这对核酸适配体特异性的识别大豆胰蛋白酶抑制因子，采用该核酸适配体的试剂盒的操作简便，对大豆胰蛋白酶抑制因子的检测灵敏度和特异性高，以解决现有检测大豆抗营养因子的技术中存在的灵敏度低、检测方法繁琐、仪器设备要求高等问题。
为解决上述问题，本申请提供以下的技术方案：
第一方面，本申请提供一对特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子中的核酸适配体，其包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适配体Aptamer1以及核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸适配体Aptamer2。
核酸适配体是对靶点具有高度亲和力和特异性的寡核苷酸，能够选择性和严格地与目标化合物结合。与抗体相比，核酸适配体具有生产成本低、易于化学修饰、化学稳定性高、重复性好、免疫原性和毒性低、结合效率高、货架期长、易于体外合成、靶点广等众多优势，目前，核酸适配体已开始被用作传感器的生物识别元件。但是，目前核酸适配体还未应用在抗营养因子的检测方面，还未出现可特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体。
而本申请发明人首次研发获得上述特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子中的核酸适配体Aptamer1和Aptamer2，两者的核酸序列如下：
所述核酸适配体Aptamer 1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5′-GGGAGTCGGGAATAACCGTCCGCGACATCACTAGGAAAAC-3′(SEQ ID NO.1)；
所述核酸适配体Aptamer 2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-Biotin-CCAACCTGTGGCATTTGGTAACTTGATCTTACGGTGTTCG-3′(Biotin-SEQ IDNO.2)。
Aptamer 2的5’端进行了Biotin(生物素)修饰。
可选地，所述特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子中的核酸适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子。所述功能基团或分子为同位素、电化学标记物、酶标记物、荧光基团、生物素、亲和配基或巯基。
第二方面，本申请还提供一种检测大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒，其包括：一种结合有前述核酸适配体Aptamer1和pH指示剂分子的纳米颗粒以及修饰有前述核酸适配体Aptamer 2的器皿。
结合有pH指示剂分子的纳米颗粒上的Aptamer 1和器皿(如96孔板)上修饰的Aptamer 2通过夹心法分别特异性识别和捕获样品中的大豆胰蛋白酶抑制因子，形成夹心结构，而pH指示剂分子在中性条件下无色或呈现较浅颜色，在碱性条件下呈现明显的颜色变化，因此可根据碱性条件下溶液的变色反应或吸光度检测结果测定样品中的大豆胰蛋白酶抑制因子。
pH指示剂对溶液pH值的变化具有快速的响应能力，应用成本低，本申请巧妙地利用pH指示剂的疏水性和固有的变色效应，将其与适配体结合组装成纳米粒子，建立一种新的大豆抗营养因子的比色检测方法，操作简单快速。所述pH指示剂分子为酚酞、百里酚酞、姜黄素中的任意一种。
可选地，所述试剂盒中，所述器皿为96孔板或48孔板或离心管。
可选地，所述试剂盒中，所述纳米颗粒是由pH指示剂分子、核酸适配体Aptamer 1及封闭剂通过π-π堆积和氢键相互作用自组装而成。
所述封闭剂为BSA、脱脂奶粉或明胶。所述封闭剂用于对核酸适配体Aptamer 1的非特异性位点进行封闭，抑制非特异性吸附。最佳封闭剂为BSA，即牛血清蛋白，这是因为BSA表面含有大量的氨基和羧基残基，并且BSA的空间结构能够随着温度、pH、盐浓度发生变化，BSA能够与亲水表面、疏水表面，以及活化的共价结合表面，如活化羧基、氨基、环氧基、甲苯磺酰基等结合，抑制非特异性吸附，是一种理想的固相封闭剂。
优选地，所述试剂盒中，纳米颗粒的制备方法为：
(1)将pH指示剂溶解于有机溶剂中，并滴入Aptamer1，进行充分搅拌；
(2)将BSA溶液逐滴加入到步骤(1)的混合溶液中进行封闭，搅拌，离心，并对离心获得的沉淀进行洗涤后得到所述纳米颗粒。
优选地，纳米颗粒的制备方法具体如下：
(1)称取酚酞溶于乙醇溶液，得到浓度为10～20mg/mL的酚酞乙醇溶液，超声20-50min后，将Aptamer1溶液(10μM，5μL-10μL)滴加到酚酞溶液中，在室温下搅拌3-4h。
(2)随后将配制的0.5～5mg/mL BSA溶液加入上述混合液中，继续在室温下搅拌3-4h，然后以8000～12000rpm的转速离心10-15min，超纯水洗涤重复三次，将所得产物重悬于超纯水中待用。
优选地，16mg/mL pH指示剂分子与10μM，10μL Aptamer 1为最佳结合比例，稀释得到浓度为1-2mg/mL的纳米粒子，应用时纳米粒子加入96孔板的用量为200μL。
优选地，所述试剂盒中，所述修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿的制备方法为：通过将核酸适配体Aptamer2的5’端修饰的生物素和96孔板内壁修饰的链霉亲和素连接而成。
优选地，所述修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿的制备方法包括以下步骤：将链霉亲和素溶液加入器皿中过夜孵育，使链霉亲和素结合在器皿内表面；然后将5’端修饰生物素的Aptamer 2滴在修饰有链霉亲和素的器皿中，在室温(23～37℃)下孵育1-3h，用PBS洗涤，得到修饰有核酸适配体Aptamer2的器皿。
具体地，修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿的制备方法具体如下：
(1)将链霉亲和素溶解于超纯水中，配制浓度为10μg/mL的链霉亲和素溶液，并调节pH为4.5-5.5。然后向96孔板的每个孔中加入100-120μL上述配制的链霉亲和素溶液，并用封口膜进行封闭，置于气浴23-37℃过夜孵育。
(2)将1)中孵育后的孔板弃去上清液体，用PBS溶液对孔板进行洗涤，并将96孔板在低温下进行干燥处理和保存。
(3)将5’端修饰生物素的核酸适配体Aptamer 2溶液(2μM，80-120μL)滴在涂有链霉亲和素的孔板表面上，在23-37℃下孵育1-3h。
优选地，2μM，100μL Aptamer 2为最佳用量。
(4)将3)中的96孔板用PBS溶液洗涤三次，并将其于2-4℃下干燥保存。
第三方面，本申请提供前述的核酸适配体和/或前述的试剂盒在检测大豆胰蛋白酶抑制因子中的应用。
基于所述核酸适配体Aptamer 1和Aptamer 2对于大豆胰蛋白酶抑制因子的高度特异性，分别结合该抑制因子的不同位点的特点，基于现有技术和公知常识，可将其应用在不同的试剂盒(不同于实施例中提供的试剂盒)中，用于对大豆胰蛋白酶抑制因子的定性和定量检测。
第四方面，本申请提供一种检测大豆胰蛋白酶抑制因子的方法，其包括以下步骤：
将待测样品溶液加入至修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿中，进行孵育，弃去上清并用PBS溶液对器皿进行洗涤，待测样品中的大豆胰蛋白酶抑制因子被Aptamer 2捕获并结合在器皿内壁上；
接着向器皿中加入前述结合有核酸适配体Aptamer1的纳米颗粒，接着进行孵育，使纳米颗粒中的Aptamer 1再次捕获到靶标物质大豆胰蛋白酶抑制因子，从而形成核酸适配体1-大豆胰蛋白酶抑制因子-核酸适配体2的夹心结构，该夹心结构被固定在器皿内壁；
弃上清并对器皿进行洗涤后，向器皿中加入碱液，根据变色反应或者吸光度检测结果检测样品中的靶标物质大豆胰蛋白酶抑制因子。
优选地，所述孵育条件为：室温(23～37℃)孵育1～3h。
上述检测原理为：
将待测样品溶液加入至修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿中孵育过程中，核酸适配体Aptamer 2识别并结合待测样品溶液中的靶标物质大豆胰蛋白酶抑制因子，靶标物质被结合到器皿内壁上；而在器皿中出现结合有核酸适配体Aptamer1的纳米颗粒时，纳米颗粒中的Aptamer 1识别并被结合到器皿内壁上的靶标物质大豆胰蛋白酶抑制因子上，从而形成核酸适配体1-大豆胰蛋白酶抑制因子-核酸适配体2的夹心结构，该夹心结构被固定在器皿内表面；由于纳米颗粒上结合有pH指示剂分子，在向器皿中加入碱性溶液后，可根据溶液的变色情况或吸光度检测靶标物质的含量。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的试剂盒中，核酸适配体Aptamer1和Aptamer2分别特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的不同部位并与之结合，并形成特有的夹心结构；而大豆胰蛋白酶抑制因子与结合有pH指示剂分子的纳米颗粒结合，加入碱液后产生明显颜色变化，且与空白对照组相比，阳性实验组的颜色差异大，而利用96孔板可以实现多个样品的同时检测，极大地提高检测效率。
2、本发明提供的检测方法具有操作简便，不仅免去了大豆的前处理及靶标提纯，简化操作，检测特异性和灵敏度高；检测成本低，对检测仪器的要求低，并且结果肉眼可观察；同时，实现检测信号放大，有利于实现对大豆胰蛋白酶抑制因子的定性和定量分析。
附图说明
图1是本发明方法的检测原理示意图；
图2是吸光度信号与不同浓度Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的对数值之间的线性关系图；
图3是使用Aptamer 1和Aptamer 2的本申请试剂盒对浓度为200ng/mL的不同大豆抗营养因子的特异性检测结果图；
图4为使用Aptamer 3和Aptamer 4制备的试剂盒对浓度为200ng/mL的不同大豆抗营养因子的特异性检测结果图；
图5为使用Aptamer 5和Aptamer 6制备的试剂盒对浓度为200ng/mL的不同大豆抗营养因子的特异性检测结果图；
图6为使用Aptamer 7和Aptamer 8制备的试剂盒对浓度为200ng/mL的不同大豆抗营养因子的特异性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
1、本实施例提供一种用于检测Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒，所述试剂盒包括：
一种结合有核酸适配体Aptamer1和pH指示剂分子的纳米颗粒、修饰有核酸适配体Aptamer 2的96孔板。
2、本实施例提供上述试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
(1)结合有核酸适配体Aptamer1和pH指示剂分子的纳米颗粒的制备
①在0℃搅拌下，将10mg酚酞指示剂溶解于1mL乙醇中。
②将100μL，2μM Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子Aptamer 1依次滴入步骤①的指示剂溶液中，使Aptamer 1富集于指示剂分子表面，然后稀释得到1mg/mL的pH响应比色纳米颗粒。
所述Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子Aptamer1的核酸序列为：
5′-GGGAGTCGGGAATAACCGTCCGCGACATCACTAGGAAAAC-3′
(SEQ ID NO.1)
③取10mg BSA加入至10mL水中混合溶解，配制成1mg/mL的BSA溶液。
④将BSA溶液与②中的富集有Aptamer 1的指示剂分子溶液混合搅拌2h，利用BSA进行非特异性位点封闭。然后以10000rpm的转速离心10min，超纯水洗涤重复三次，将所得产物重悬于超纯水中待用。
(2)修饰有核酸适配体Aptamer 2的96孔板的制备
主要分为以下两个过程：一是对96孔板进行链霉亲和素包被，二是对96孔板底部进行核酸适配体Aptamer 2的修饰，具体操作过程如下：
①将链霉亲和素溶解于超纯水中，配制浓度为10μg/mL的链霉亲和素溶液，并调节pH为5.0。然后向96孔板的每个孔中加入100μL上述配制的链霉亲和素溶液，并用封口膜进行封闭，置于气浴37℃过夜孵育。
②将①中孵育后的孔板弃去上清液体，用PBS溶液对孔板进行洗涤，并将96孔板在低温下进行干燥处理和保存。
③将5’端修饰生物素的核酸适配体Aptamer 2溶液(2μM，100μL)滴在涂有链霉亲和素的孔板表面上，在37℃下孵育1h。
④将①中的96孔板用PBS溶液洗涤三次，并将其于4℃下干燥保存。
所述5’端修饰生物素的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体Aptamer 2的核酸序列为：
5’-biotin-CCAACCTGTGGCATTTGGTAACTTGATCTTACGGTGTTCG-3′(SEQ ID NO.2)
实施例2检测大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒的应用方法
在检测样品中大豆胰蛋白酶抑制因子时，上述实施例1制备的试剂盒具体应用方法如下：
(1)样品预处理：
取2g大豆样本用研钵进行研磨处理，然后用10mL的PBS缓冲液稀释，并用滤纸对大豆残渣进行过滤。
(2)对靶标物质大豆抗营养因子进行检测：
①取上一步预处理好的待测样品溶液200μL加入至修饰有Aptamer 2的96孔板中，将其置于室温下孵育1h，弃去上清并用PBS溶液对孔板进行洗涤。
②将200μL，1mg/mL的纳米颗粒(实施例1制备)加入至上一步的96孔板的孔中，于室温下孵育1h，使纳米颗粒中的Aptamer 1再次捕获靶标物质大豆抗营养因子形成夹心检测；弃上清后再用PBS溶液进行洗涤，这时pH响应纳米颗粒会由于靶标物质的作用固定在孔表面。
③向96孔板中加入碱液，根据溶液产生的变色反应可进行定性检测。设置酶标仪测定波长为570nm，将96孔板置于酶标仪中进行吸光度测定(OD值在0-1之间)，然后根据标准曲线计算该OD值对应的大豆抗营养因子的浓度。
实验结果显示，该方法能检测到25ng/mL的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子，且与其他大豆抗营养因子无交叉，具有很好的特异性和灵敏度。
实施例3试剂盒的灵敏度的检测
1、实验方法：
配制浓度为1～1000ng/mL的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子溶液，将其作为样品。
实验组别设置如下：
①实验组：使用实施例1的试剂盒按照实施例2的操作方法对样品进行检测，根据酶标仪测得的吸光度信号制作的线性方程计算本发明的试剂盒的检测限。检测限越低证明本发明的比色夹心法的检测精准度越高，即灵敏度越高。
②对照组1～3：实验方法同实验组，区别在于使用不同的核酸适配体，不同对照组采用的核酸适配体如下表1；
表1对照组1～3采用的核酸适配体
注：Aptamer 4、Aptamer 6和Aptamer 8的5’端进行了生物素修饰。
2、实验结果及分析：
测定结果如图2所示，酶标仪测得的吸光度信号与检测物Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子在其浓度为1～1000ng/mL的范围内呈线性关系得到的线性方程为y＝0.0005x+0.2987，R2＝0.9965。
通过3倍的空白样品的标准偏差/线性方程的斜率计算得，本发明方法对于Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的检测限为25ng/mL，远高于对照组1～3，给结果验证了本发明提供的核酸适配体优于其他，采用该实验组的检测方法具有良好的灵敏性。
表2各组别的检测限结果
| 检测限(ng/mL) | |
| 实验组 | 25 |
| 对照组1 | 257 |
| 对照组2 | 198 |
| 对照组3 | 332 |
实施例4试剂盒的特异性的检测
1、实验方法：
以磷酸缓冲液PBS溶液为空白对照，本实施例用本发明的实施例1制备的试剂盒按照实施例2的方法操作，对相同浓度(200ng/mL)的Kunitz胰蛋白酶抑制因子(KunitzTrypsin Ihhibitor，KTI)、Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk Inhibitor，BBI)和大豆血球凝集素(soybean agglutinin,SBA)分别进行了检测，并用酶标仪进行吸光度信号测定。
为验证本发明选用的Aptamer1和Aptamer 2的特异性，以磷酸缓冲液PBS溶液为空白对照，用本发明的实施例3对照组中制备的Aptamer按照实施例2的方法操作，对相同浓度(200ng/mL)的Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz Trypsin Ihhibitor，KTI)、Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk Inhibitor，BBI)和大豆血球凝集素(soybeanagglutinin,SBA)分别进行了检测，并用酶标仪进行吸光度信号测定。
2、实验结果及分析：
本发明试剂盒(即本发明选用的Aptamer 1和Aptamer 2)特异性检测结果如图3所示，该结果表明该试剂盒仅对KTI显示了强吸光度信号，对其它物质及空白对照具有极低的吸光度信号，相比之下证明本发明的试剂盒对Kunitz胰蛋白酶抑制因子具有高特异性。
对照组1中Aptamer 3和Aptamer 4的特异性检测结果如图4所示，对照组2中Aptamer 5和Aptamer 6的特异性检测结果如图5所示，对照组3中Aptamer 7和Aptamer 8的特异性检测结果如图6所示。
通过对比可知，本发明选用的Aptamer1和Aptamer2对Kunitz胰蛋白酶抑制因子的特异性远高于其他三对核酸适配体，该结果证明本发明选用的Aptamer1和Aptamer2对Kunitz胰蛋白酶抑制因子具有高特异性。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一对特异识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体，其特征在于，包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适配体Aptamer1以及核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸适配体Aptamer2。
2.根据权利要求1所述的特异性识别大豆胰蛋白酶抑制因子的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子。
3.一种检测大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒，其特征在于，包括：一种结合有如权利要求1所述的核酸适配体Aptamer1和pH指示剂分子的纳米颗粒、修饰有如权利要求1所述的核酸适配体Aptamer 2的器皿。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述器皿为96孔板或48孔板或离心管。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米颗粒主要是由pH指示剂分子、核酸适配体Aptamer1以及封闭剂相互作用自组装而成；所述封闭剂为BSA、脱脂奶粉或明胶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米颗粒的制备方法为：
(1)将pH指示剂溶解于有机溶剂中，并滴入Aptamer 1，进行充分搅拌；
(2)将BSA溶液逐滴加入到步骤1)的混合溶液中进行封闭，搅拌，离心，并对离心获得的沉淀进行洗涤后得到所述纳米颗粒。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述pH指示剂分子为酚酞、百里酚酞、姜黄素中的任意一种。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿的制备方法为：通过将核酸适配体Aptamer2的5’端修饰的生物素和96孔板内壁修饰的链霉亲和素连接而成。
9.如权利要求1所述的核酸适配体、如权利要求3～8中任一项所述检测大豆胰蛋白酶抑制因子的试剂盒在检测大豆胰蛋白酶抑制因子中的应用。
10.一种检测大豆胰蛋白酶抑制因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品溶液加入至如权利要求3～8中任一项所述的修饰有核酸适配体Aptamer 2的器皿中，进行孵育，弃去上清并用PBS溶液对器皿进行洗涤；
接着向器皿中加入如权利要求3～8中任一项所述的结合有核酸适配体Aptamer1的纳米颗粒，接着进行孵育，形成核酸适配体1-大豆胰蛋白酶抑制因子-核酸适配体2的夹心结构，该夹心结构被固定在器皿内壁；
对器皿进行洗涤后，向器皿中加入碱液，根据变色反应或者吸光度检测结果检测样品中的靶标物质大豆胰蛋白酶抑制因子。
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