CN112147095A - 一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，包括：(1)向交联透明质酸钠凝胶样品中加入无机酸溶液，于90‑110℃下加热处理15‑60min，加入无机碱溶液，得到处理后的样品溶液；(2)将考马斯亮蓝G250溶于醇类中，加入无机酸和表面活性剂，得到显色液；(3)配制系列标准溶液，加入显色液，测定吸光度，绘制标准曲线；(4)向处理后的样品溶液中加入显色液，测定550‑650nm波长下的吸光度，通过标准曲线确定蛋白残留的含量。本发明提供的交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法采用自配的显色液，来提高测定体系的稳定性和灵敏度，测定结果准确度高、成本低、稳定性好。

Description

一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法。
背景技术
蛋白质是生物最重要的基本组成成分之一，它与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、新陈代谢、物质运转、遗传息息相关。生物提取玻璃酸钠时，相应地会有部分蛋白残留。蛋白量若过多，用于人体会引起排斥反应，引发不良反应。因此，药品生产过程中及终产品都会对蛋白质残留进行严格的控制。
目前常用的蛋白质定量测定方法包括：凯式定氮法、考马斯亮蓝法 (Bradford法)、双缩脲法、Folin-酚法(Lowry法)、紫外吸收法等。初期透明质酸钠凝胶蛋白残留常用的测定方法Lowry法。Lowry法的优点是灵敏度高，缺点是测定范围窄、使用试剂多、干扰物质多、耗费时间长及反应时间难以控制。因此，近年来开始有研究者采用Bradford法测定透明质酸钠凝胶中蛋白残留。Bradford法灵敏度较高，其最低检测蛋白含量可至1μg，比Lowry法灵敏4倍。而且Bradford法还具有干扰物质少、测定快速、简便、特异性强等优点，现已在生物化学和临床分析中得到了广泛的应用。
交联透明酸钠凝胶样品粘稠，有可溶性凝胶和不可溶性凝胶。常规的蛋白测定时未对样品进行处理，以致样品不溶颗粒会对蛋白测定结果造成偏差。因此本发明提供了一种改进的样品预处理方法，避免样品存在不溶颗粒。试验中发现Bradford法还存在一些问题，如线性关系差。众多研究者研究显色液组分对线性关系的影响,发现乙醇溶液的浓度直接影响考马斯亮蓝的溶解性，而溶液的极性和显色液 H+浓度直接影响考马斯亮蓝分子在整个溶液中的存在形式，两者构成了影响变色灵敏度的主要因素。
因此，本发明提供了一个新的显色液配方来改善考马斯亮蓝蛋白质测定法的线性关系。
发明内容
为了解决现有技术中考马斯亮蓝法测定蛋白质样品体系的稳定较差的缺陷，本发明在于提供一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法。该方法采用自配的显色液配方，有效地增强样品测定体系的稳定性和提高反应体系的灵敏度，具有测定结果准确度高、成本低、稳定性好的优点。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：向交联透明质酸钠凝胶样品中加入无机酸溶液，于90- 110℃温度下加热处理15-60min，然后加入无机碱溶液，得到处理后的样品溶液；
(2)显色液配制：将考马斯亮蓝G250溶于醇类中，然后加入无机酸和表面活性剂，得到显色液；
(3)标准曲线绘制：配制牛血清白蛋白贮备液，并稀释得到系列标准溶液，然后依次向系列标准溶液中加入步骤(2)中所述显色液，测定吸光度，绘制标准曲线；
(4)蛋白测定：向步骤(1)中所述处理后的样品溶液中加入步骤(2) 中所述显色液，测定550-650nm波长下的吸光度，通过标准曲线确定交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的含量。
优选地，步骤(1)中所述交联透明质酸钠凝胶样品、无机酸溶液和无机碱溶液的用量比为2g:5mL:5mL。
优选地，所述无机酸溶液为浓度为0.2mol/L-2mol/L的盐酸溶液或硫酸溶液。
优选地，所述无机碱溶液为浓度为0.2mol/L～2mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
优选地，步骤(2)中所述显色液中考马斯亮蓝G250的质量浓度为 20mg/L-250mg/L，所述醇类的质量浓度为15wt％，所述无机酸的体积浓度为 40mL/L-120mL/L，所述表面活性剂的体积浓度为0.05mL/L-2mL/L。
更优选地，所述醇类为乙醇、正丁醇、异丙醇或甲醇，所述无机酸为磷酸或盐酸，所述表面活性剂为OP-10、TritonX-100、TritonX-10、Tween-20或 Tween-80。
优选地，步骤(3)中所述牛血清白蛋白贮备液的pH值6-8，具体包括如下组分：牛血清白蛋白1.0g/L、Tween-20 0.01mL/L～0.1mL/L、甘露醇 5mL/L～30mL/L、Proclin3000.2mL/L～2mL/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠) 0.1g/L～1g/L，余量为磷酸盐缓冲液；所述系列标准溶液为采用所述牛血清白蛋白贮备液稀释至浓度依次为10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、 2μg/mL、0μg/mL得到。
优选地，步骤(3)中向系列标准溶液中加入显色液时，所述标准溶液与显色液的体积比为1:5。
优选地，步骤(4)中向处理后的样品溶液中加入显色液时，所述处理后的样品溶液与显色液的体积比1:5。
本发明的有益效果：
(1)本发明对交联透明质酸钠凝胶样品进行了处理，通过向样品中加入无机酸溶液并加热处理，然后加入无机碱溶液，以此来提高样品的溶解度，有利于提高蛋白测定的准确度。
(2)本发明向牛血清白蛋白贮备液中加入Tween-20、甘露醇、Proclin300和乙二胺四乙酸二钠助剂，以此来提高蛋白贮备液的稳定性，进而优化标准曲线，避免标准曲线的反复冻融。
(3)本发明自配的考马斯亮蓝显色液，通过加入无机酸和表面活性剂，来提高测定体系的稳定性和灵敏度，进而提高了考马斯亮蓝蛋白质测定法的线性关系，从而提高了一种简便、快速、灵敏的蛋白残留测定方法。
附图说明
图1为实施例1牛血清白蛋白的浓度与吸光度的标准曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
实施例1
一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：准确称取2g交联透明质酸钠凝胶样品于顶空瓶中，然后加入5mL浓度为1mol/L的盐酸溶液，于95℃温度下加热处理30min，然后加入5mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，得到处理后的样品溶液；
(2)显色液配制：将考马斯亮蓝G250溶于无水乙醇中，然后加入磷酸和表面活性剂TritonX-100，得到显色液，其中，显色液中考马斯亮蓝G250的质量浓度为160mg/L，无水乙醇的质量浓度为15wt％，磷酸的体积浓度为 120mL/L，表面活性剂TritonX-100的体积浓度为0.06mL/L。
(3)标准曲线绘制：配制牛血清白蛋白贮备液，pH值为6.5，牛血清白蛋白贮备液中包括：牛血清白蛋白1.0g/L、Tween-20 0.05mL/L、甘露醇 10mL/L、Proclin300 1mL/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠)0.5g/L，余量为磷酸盐缓冲液。然后将牛血清白蛋白贮备液稀释到牛血清白蛋白浓度为 10μg/mL，再依次稀释至浓度为10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、0μg/mL，作为到系列标准溶液，然后依次向1mL系列标准溶液中加入5mL步骤(2)中所述显色液，测定595nm波长下的吸光度，以牛血清白蛋白的浓度对相应的吸光度计算回归方程，绘制标准曲线；
如图1所示，标准曲线的线性回归方程为：y＝0.0151x+0.0017，R2＝ 0.9993，其中：x为牛血清白蛋白的浓度(μg/mL)，y为吸光度值，线性良好。
(4)蛋白测定：取步骤(1)中所述处理后的样品溶液1mL，向其中加入步骤(2)中所述显色液5mL，混匀后，在室温条件下放置5min，得到样品测定体系溶液，测定体系在595nm波长下的吸光度为0.1099，通过标准曲线确定交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的含量为7.166μg/mL。
本实施例还对步骤(4)中的样品测定体系溶液放置不同的时间测定吸光度，来考察其稳定性，并与加入常规的显色液(对本实施例不同之处在于：不加入磷酸和表面活性剂TritonX-100)的测定体系进行了对比，结果如表1所示：
表1
Figure RE-GDA0002752144670000061
从表1可以看出，用自配的显色液，样品测定体系溶液在10min后吸光度值就进入了平台期，并且在10～60min内吸光度值没有发生明显改变；而采用常规的显色液，样品10min后吸光度就逐渐降低。同时，在其他条件相同的情况下，采用自配显色液样品的吸光度值较常规的高。
实施例2
一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：准确称取2g交联透明质酸钠凝胶样品于顶空瓶中，然后加入5mL浓度为0.2mol/L的盐酸溶液，于90℃温度下加热处理60min，然后加入5mL浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液，得到处理后的样品溶液；
(2)显色液配制：将考马斯亮蓝G250溶于无水乙醇中，然后加入磷酸和表面活性剂TritonX-100，得到显色液，其中，显色液中考马斯亮蓝G250的质量浓度为50mg/L，无水乙醇的质量浓度为15wt％，磷酸的体积浓度为40mL/L，表面活性剂TritonX-100的体积浓度为1mL/L。
(3)标准曲线绘制：采用实施例1的标准溶液和标准曲线；
(4)蛋白测定：取步骤(1)中所述处理后的样品溶液1mL，向其中加入步骤(2)中所述显色液 5mL，混匀后，在室温条件下放置5min，得到样品测定体系溶液，测定体系在595nm波长下的吸光度为0.0534，通过标准曲线确定交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的含量为3.424μg/mL。
实施例3
一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：准确称取2g交联透明质酸钠凝胶样品于顶空瓶中，然后加入5mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，于110℃温度下加热处理15min，然后加入5mL浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，得到处理后的样品溶液；
(2)显色液配制：将考马斯亮蓝G250溶于无水乙醇中，然后加入磷酸和表面活性剂TritonX-100，得到显色液，其中，显色液中考马斯亮蓝G250的质量浓度为250mg/L，无水乙醇的质量浓度为15wt％，磷酸的体积浓度为 120mL/L，表面活性剂TritonX-100的体积浓度为2mL/L。
(3)标准曲线绘制：采用实施例1的标准溶液和标准曲线；
(4)蛋白测定：取步骤(1)中所述处理后的样品溶液1mL，向其中加入步骤(2)中所述显色液5mL，混匀后，在室温条件下放置5min，得到样品测定体系溶液，测定体系在595nm波长下的吸光度为0.1411，通过标准曲线确定交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的含量为9.232μg/mL。
以上是对本发明创造的较佳实施例进行的具体描述，但本发明的实施方法并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品处理：向交联透明质酸钠凝胶样品中加入无机酸溶液，于90-110℃温度下加热处理15-60min，然后加入无机碱溶液，得到处理后的样品溶液；
(2)显色液配制：将考马斯亮蓝G250溶于醇类中，然后加入无机酸和表面活性剂，得到显色液；
(3)标准曲线绘制：配制牛血清白蛋白贮备液，并稀释得到系列标准溶液，然后依次向系列标准溶液中加入步骤(2)中所述显色液，测定吸光度，绘制标准曲线；
(4)蛋白测定：向步骤(1)中所述处理后的样品溶液中加入步骤(2)中所述显色液，测定550-650nm波长下的吸光度，通过标准曲线确定交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的含量。
2.根据权利要求1所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述交联透明质酸钠凝胶样品、无机酸溶液和无机碱溶液的用量比为2g:5mL:5mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，所述无机酸溶液为浓度0.2mol/L-2mol/L的盐酸溶液或硫酸溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，所述无机碱溶液为浓度0.2mol/L～2mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
5.根据权利要求1所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，步骤(2)中所述显色液中考马斯亮蓝G250的质量浓度为20mg/L-250mg/L，所述醇类的质量浓度为15wt％，所述无机酸的体积浓度为40mL/L-120mL/L，所述表面活性剂的体积浓度为0.05mL/L-2mL/L。
6.根据权利要求5所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，所述醇类为乙醇、正丁醇、异丙醇或甲醇，所述无机酸为磷酸或盐酸，所述表面活性剂为OP-10、TritonX-100、TritonX-10、Tween-20或Tween-80。
7.根据权利要求1所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，步骤(3)中所述牛血清白蛋白贮备液的pH值6-8，具体包括如下组分：牛血清白蛋白1.0g/L、Tween-200.01mL/L～0.1mL/L、甘露醇5mL/L～30mL/L、Proclin300 0.2mL/L～2mL/L、乙二胺四乙酸二钠0.1g/L～1g/L，余量为磷酸盐缓冲液；所述系列标准溶液为采用所述牛血清白蛋白贮备液稀释至浓度依次为10μg/mL、8μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、0μg/mL得到。
8.根据权利要求1所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，步骤(3)中向系列标准溶液中加入显色液时，所述标准溶液与显色液的体积比为1:5。
9.根据权利要求1所述的一种交联透明质酸钠凝胶蛋白残留的快速测定方法，其特征在于，步骤(4)中向处理后的样品溶液中加入显色液时，所述处理后的样品溶液与显色液的体积比1:5。
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