CN108732114B - 快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法，该方法通过在甲苯胺蓝和硫酸葡聚糖反应步骤完成后加入酸试剂以稳定吸光值，使得实验结果更可靠，且检测过程中试剂用量小，计算简单、结果重复性好，准确度高。

Description

快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种快速检测血脂吸附剂 中硫酸葡聚糖固定量的方法。

背景技术

众多流行病学、遗传学与临床研究证实，血清中低密度脂蛋白 胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)的发生率 呈正相关，通常以高LDL-C水平作为CHD的首要致病因素。美国 国家胆固醇教育计划(NCEP)成人治疗专业组规定以LDL-C水平作 为高脂血症的分类与治疗基础，以及需要达到的治疗目标。

硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物，由葡聚糖和氯磺酸的 酯化反应形成。由于其结构和所带电荷与LDL-C受体相似，以硫 酸葡聚糖为血脂吸附剂配基时，能够特异性吸附LDL-C，达到降低 血清中LDL-C水平的目的。

以硫酸葡聚糖为配基的LDL-C血脂吸附剂，其吸附效率很大 程度上取决于硫酸葡聚糖的固定量。在血脂吸附剂制备过程中，快 速检测其硫酸葡聚糖固定量，能够及时监控产品质量，加快生产进 度。

目前，对硫酸葡聚糖的检测方法有盐酸水解－硫酸钡重量法、 共振瑞利散射法、液相色谱法和聚甲苯胺蓝分子探针法，这些方法 对仪器或试剂有较高要求，且只能检测水溶液样品，无法对微球上 固定的硫酸葡聚糖含量进行检测。其中，聚甲苯胺蓝作为分子探针 识别硫酸葡聚糖的原理与本方法类似，但需要在玻碳电极上电聚合 一层聚甲苯胺蓝膜，操作复杂且耗时较长，并且该方法也只适用于 水溶液样品。

专利CN1697665A涉及了一种硫酸葡聚糖固定量检测方法，通 过吸附前后甲苯胺蓝含量的变化，计算得出甲苯胺蓝减少的量，再 通过一定的换算关系得出硫酸葡聚糖固定量，该方法计算步骤复杂， 且所用甲苯胺蓝试剂浓度大，检测630nm吸光度时需多倍稀释，测 量时的误差成倍放大，在实际实验操作中，甲苯胺蓝溶液的吸光度 呈下降趋势，造成结果存在较大误差。因此，该方法计算复杂，结 果存在较大误差且试剂用量大。

发明内容

本发明的目的在于建立一种快速准确检测硫酸葡聚糖固定量 的方法，以便于在LDL-C血脂吸附剂制备过程中及时监控产品质 量。

为实现上述目的，本发明提供的快速检测血脂吸附剂中硫酸葡 聚糖固定量的方法，其步骤如下：

1)取制备好的溶液状态的样品和硫酸葡聚糖标准品，分别加 入等量的甲苯胺蓝试剂，得到反应液；所述样品为包含固定有硫酸 葡聚糖的血脂吸附剂的溶液；

2)将反应液振荡反应充分后，加入酸试剂，混匀，H⁺终浓度 为0.001～0.01mol/L，静置至室温；

3)取反应液上清液，于630nm处测其吸光度；

4)绘制标准曲线，根据以下公式计算获得样品中硫酸葡聚糖 浓度c：

FA＝c*V/M

式中：

FA—Fixed Amount，固定量；

c—样品处理后硫酸葡聚糖含量；

V—测量样品的体积；

M—样品中包含的血脂吸附剂重量。

上述方案中，所述酸试剂可选用为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸， 优选为还添加有没食子酸。

上述方案中，所述样品为包含固定有硫酸葡聚糖的琼脂糖凝胶 微球的溶液。

上述方案中，所述甲苯胺蓝试剂的溶液浓度为0.005％。

上述方案中，所述硫酸葡聚糖标准品的浓度范围在0～20μg/ml。

本申请发明人通过研究发现在甲苯胺蓝和硫酸葡聚糖反应完 成后，加入了酸试剂可以有效的稳定吸光值，酸试剂只要不对产物 的颜色状态产生影响的均可以采用，如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

特别是在酸试剂中增加没食子酸，现有技术中沈阳师范大学学 报2012年第30期第2卷245-247，公开了甲苯胺蓝性质的分光光 度法分析，表明甲苯胺蓝在低浓度状态下有单体和二聚体两种存在 形式，这两者之间的转换与其氧化还原性质密切相关。发明人采用的没食子酸虽然名称中有酸，但是它是一种多酚类试剂，具有抗氧 化性，在酸性条件下，加入一定量的没食子酸能够稳定甲苯胺蓝的 氧化还原状态，抑制单体和二聚体之间的相互转换，对稳定其吸光 度具有更好的效果。

本发明的有益效果：本发明检测方法通过在甲苯胺蓝和硫酸葡 聚糖反应步骤完成后加入酸试剂以稳定吸光值，使得实验结果更可 靠，且检测过程中试剂用量小，计算简单、结果重复性好，准确度 高。

附图说明

图1为预实验中硫酸葡聚糖标准曲线图。

图2为检测范围确定后的硫酸葡聚糖标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，实施 例仅为举例，不用于限制本发明。下述实施例中的实验材料，如无 特殊说明，均可以通过常规的商业途径购得。下述实施例中所采用 的方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实验中，标准品和样品的硫酸葡聚糖含量检测方法均采用 本发明方法，步骤如下：

1)取制备好的溶液状态的样品和标准品，分别加入甲苯胺蓝 试剂，得到反应液；

标准品中加入的甲苯胺蓝试剂量和样品中的一样；

样品为包含固定有硫酸葡聚糖的血脂吸附剂的溶液；

2)将反应液振荡反应充分后，加入酸试剂，混匀，H⁺终浓度 为0.001～0.01mol/L，静置至室温；

3)取反应液上清液加到比色皿中，以纯水为空白对照，于 630nm处测其吸光度；

4)绘制标准曲线，根据以下公式计算获得样品中硫酸葡聚糖 浓度c：

FA＝c*V/M

式中：

FA—Fixed Amount，固定量；

c—样品处理后硫酸葡聚糖含量；

V—测量样品的体积；

M—样品中包含的血脂吸附剂重量。

该方法中，甲苯胺蓝试剂的溶液浓度为0.05g/L(0.005％)， 纯水配制，常温保存。

标准品的配制为：配制硫酸葡聚糖贮备液，按比例稀释成0～20 μg/ml浓度范围内的硫酸葡聚糖标准液。硫酸葡聚糖贮备液浓度为 4mg/ml，纯水配制，置于4℃冰箱保存，保存时间一般不得超过15 天。硫酸葡聚糖标准液以同一贮存液按比例稀释，现配现用。

样品处理方法：称取一定量固定有硫酸葡聚糖的琼脂糖凝胶微 球，加一定体积纯水震荡混匀，此时样品为混合均匀的悬浊液，应 立即取规定量加入到反应容器中。

实施例1标准曲线与检测范围的建立

称取0.2g硫酸葡聚糖粉末，精密称定，溶于50ml纯水中，作 为贮备液(4mg/ml)，置于4℃冰箱保存。

标准曲线的绘制：以4mg/ml浓度的硫酸葡聚糖溶液作为母液， 用纯水进行不同倍数的稀释，预实验初始设置的标准液浓度为0、5、 10、15、20、25、30、35、40μg/ml，采用本发明方法进行硫酸葡 聚糖含量检测(酸试剂采用盐酸，终浓度为0.002mol/L)，当浓度 ≥20μg/ml时，反应趋近于饱和，如图1所示。

在0～20μg/ml的浓度范围内，再设置一组标准液，浓度为0、1、 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/ml，此范围内标准液浓 度与吸光度呈良好的线性关系，标准曲线R²达0.9953，最佳的检 测范围为1～16μg/ml，标准曲线R²达0.999，如图2所示。

参照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则9012生物 样品定量分析方法验证指导原则，校样回算浓度应在标示值的20％ (定量下限和定量上限在25％)范围内，根据标准曲线的公式，计 算校正标样回算浓度，结果如表1。

表1校正标样回算浓度测定结果

结果表明：校正标样回算浓度在标示值的10％以内，符合规定 的范围。

实施例2基质干扰试验

反应体系中基质的选择对实验方法的准确性具有较大影响， PBS缓冲液是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，具备生 理盐水的渗透压，且对配制溶液具有稳定PH值的作用，所以实验 中选择PBS缓冲液作为要考察的基质。用PBS缓冲液代替纯水加 入至反应体系时，反应没有明显的颜色变化，且不同浓度的标准品 在630nm处测得的吸光度几乎没有差异，说明此溶液基质对反应 产生了抑制作用。

同时参考甲苯胺蓝光度法的相关文献，多种离子作为反应体系 中的共存物质时，会对检测结果造成不同程度上的影响，为了尽可 能排除溶液基质对反应的影响，反应体系应选择纯水作为空白基质。

实施例3稳定性试验

为了确保数值的准确性，需对样品吸光值的稳定性进行测试， 采用普通方法进行硫酸葡聚糖含量检测(和本发明方法区别在于步 骤(2)中，不加酸试剂，其他步骤相同)，静置10min，30min， 50min时取样进行检测，吸光值呈明显下降趋势，以硫酸葡聚糖浓 度为0μg/ml的标准液为测试样品，测定结果见表2。

表2未处理样品稳定性测定结果

静置时间(min)	10	30	50
				吸光值A<sub>630</sub>	0.783	0.764	0.735

采用本发明方法进行硫酸葡聚糖含量检测(酸试剂采用盐酸、 或者盐酸和没食子酸，步骤(2)中，分别加入浓度为1.0mol/L的 盐酸100μl、或者1.0mol/L的盐酸和没食子酸各50μl，混匀)，再 静置10min，30min，50min时取样进行检测，吸光值变化在0.01 以内，测定结果见表3。

表3酸处理样品稳定性测定结果

试剂	静置时间(min)	10	30	50
					盐酸	吸光值A<sub>630</sub>	0.781	0.772	0.761
盐酸和没食子酸	吸光值A<sub>630</sub>	0.780	0.776	0.773

这说明酸性试剂能够维持吸光值稳定，由于用紫外可见光分光 光度计测量吸光度时，样品需逐个测量，故吸光值的稳定能够减小 该因素造成的实验误差。以上表格还显示，增加有没食子酸在维持 吸光值稳定性方面比不加的更出色。

实施例4样品有效浓度试验

由于检测的硫酸葡聚糖固定在琼脂糖凝胶微球上，故样品中可 能存在背景干扰信号，在此情况下，应考察最低需求稀释度，即分 析方法中为提髙信噪比、减少基质干扰、优化准确度与精密度而必 须对试验样品进行稀释的最小倍数，应使用与试验样品相同的空白 基质来配制稀释样品以确定最低需求稀释度。

取吸附剂样品，暂以1g按照1ml计算，按10、20、50、100、 200、500、1000倍比例稀释样品，采用本发明方法进行硫酸葡聚糖 含量检测(酸试剂采用盐酸和没食子酸，盐酸终浓度为0.005mol/L， 没食子酸为0.001mol/L)，测定结果见表4。

表4样品稀释度测定结果

样品稀释倍数	A<sub>630</sub>	硫酸葡聚糖固定量(μg/g)
			10	0.196	178.61
20	0.258	318.82
			50	0.364	632.97
100	0.431	1058.51
			200	0.552	1367.80
500	0.640	2057.28
			1000	0.703	2164.09

根据上述结果，当稀释浓度为1000倍时，样品测定的吸光度 值接近定量下限，选取200～1000倍稀释浓度作为测定范围进一步 实验，并设置加标回收样来评价方法的准确度，测定结果见表5。

表5样品稀释度测定结果

400-800倍稀释浓度下，测得的硫酸葡聚糖固定量数值差异在 20％以内，且加标回收率在85％以上，因此，本发明方法要求的最 低稀释倍数为400倍，以600倍以上为最佳。以该批次血脂吸附剂 的硫酸葡聚糖固定效率而言，1000倍稀释浓度下测得的原始吸光度数值接近定量下限，故以600～700倍稀释浓度为最佳，若固定量提 高，可适当增加稀释倍数。

实施例5样品平行性试验

参照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则9012生物 样品定量分析方法验证指导原则，在可获得真实试验样品的情况下， 应考虑对标准曲线和系列稀释的试验样品之间进行平行性考察，系 列稀释样品间的精密度应不超过30％。

在样品稀释度实验中，选取稀释倍数为200倍的试验样品，用 空白基质将其稀释到400倍、600倍和800倍，每个稀释倍数设置 3个平行样品，采用本发明方法进行硫酸葡聚糖含量检测(酸试剂 采用盐酸，终浓度为0.01mol/L)，测定结果见表6。

表6样品稀释度测定结果

测定结果表明，在400～800倍稀释浓度下，样品总平均精密度 在10％以内，只计算600倍稀释倍数下样品的精密度时，精密度为 2.51％，说明样品平行性良好。

实施例6精密度与准确度试验

参照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则9012生物 样品定量分析方法验证指导原则，选取了5个浓度的质控样品(1、 2.5、7.5、12.5、16μg/ml)进行准确度、精密度以及方法总误差考 察，包括定量下限浓度、低浓度质控(定量下限浓度的3倍以内)、 中浓度质控(标准曲线中段)、高浓度质控(定量上限浓度75％以 上)以及定量上限浓度质控，采用本发明方法进行硫酸葡聚糖含量 检测(酸试剂采用盐酸和没食子酸，盐酸终浓度为0.005mol/L，没 食子酸为0.001mol/L)，测定结果见表7。

表7质控样品回收率测定结果

测定结果表明，本实验方法中不同浓度质控样品的回收率均在 90.0％以上，精密度和准确度在规定范围内。

以上结果表明：

本发明在血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量检测中具有可行性， 且在规定范围内，检测结果的准确度和精密度良好，可广泛应用于 固相硫酸葡聚糖的检测。

Claims (5)

1.一种快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法，其步骤如下：

1)取制备好的溶液状态的样品和硫酸葡聚糖标准品，分别加入等量的甲苯胺蓝试剂，得到反应液；所述样品为包含固定有硫酸葡聚糖的血脂吸附剂的溶液；

2)将反应液振荡反应充分后，加入酸试剂，混匀，H⁺终浓度为0.001～0.01mol/L，静置至室温；其中，所述酸试剂为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸中一种或几种，且所述酸试剂还包括没食子酸；

3)取反应液上清液，于630nm处测其吸光度；

4)绘制标准曲线，根据以下公式计算获得样品中硫酸葡聚糖浓度c：

FA＝c*V/M

式中：

FA—Fixed Amount，固定量；

c—样品处理后硫酸葡聚糖含量；

V—测量样品的体积；

M—样品中包含的血脂吸附剂重量。

2.根据权利要求1所述快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法，其特征在于：所述没食子酸的终浓度为0.001～0.005mol/L。

3.根据权利要求1所述快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法，其特征在于：所述样品为包含固定有硫酸葡聚糖的琼脂糖凝胶微球的溶液。

4.根据权利要求1所述快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法，其特征在于：所述甲苯胺蓝试剂的溶液浓度为0.05g/L。

5.根据权利要求1所述快速检测血脂吸附剂中硫酸葡聚糖固定量的方法，其特征在于：所述硫酸葡聚糖标准品的浓度范围在0～20μg/ml。

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