CN114686559B - 一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒及其制备与使用方法 - Google Patents

一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒及其制备与使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明采用基因工程技术制备的重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶为主要组份，研制出可用于检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒。该试剂盒可以在适当条件下存储2年，试剂性能稳定；可以方便、快速、准确地检测多种生物样本中同型半胱氨酸的含量；并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样本，实现同型半胱氨酸的高通量、快速化测定，精确度和检测效率相比之前都有显著提高；同时实现了检测过程的全自动化，方便检测人员操作，易于推广使用。

Description

一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒及其制备与 使用方法
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，具体来说涉及一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒及其制备与使用方法。
背景技术
同型半胱氨酸（Homocysteine，HCY），又称高半胱氨酸，是由细胞内的甲硫氨酸去甲基后形成的一种硫醇氨基酸，由S-腺苷同型半胱氨酸水解而来，同时也是胱硫醚β合成酶合成胱硫醚的底物。血液中的总同型半胱氨酸包括同型半胱氨酸、同型半胱氨酸二硫化合物和胱氨酸-同型半胱氨酸三种形式，它们大部分以蛋白结合方式存在，小部分处于游离状态。血浆同型半胱氨酸是蛋氨酸循环的中间产物，受到遗传因素、营养状况、肝肾功能及一些疾病时的代谢状况的影响，维生素B6、叶酸等物质可在一定程度上降低其水平。已开展的众多研究表明，的一种独立危险因素，同型半胱氨酸与心、脑血管疾病以及外周血管疾病密切相关，它是评估心血管疾病发生过程中的一个重要的风险因子，血液中升高的同型半胱氨酸会刺激血管壁引起动脉血管损伤，导致炎症和管壁的斑块形成，最终引起心脏血流受阻。在慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B12 缺乏等疾病的患者中也存在同型半胱氨酸代谢紊乱。同型半胱氨酸检测在临床上已有多年应用史，其安全性及可靠性已得到验证。另有研究表明，同型半胱氨酸可作为神经管畸形、先兆子痫、帕金森氏病、老年痴呆、胎儿生长迟缓、动脉粥样硬化、慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B12缺乏、叶酸缺乏等多种疾病的临床辅助诊断依据，其临床意义极为重要。
目前，临床上测定生物样本中同型半胱氨酸的方法较多，主要为同位素法、色谱法、免疫学法等。但现有方法都较为费时费力，且检测成本较高，不适合大批量临床样本的测定。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的同型半胱氨酸检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的同型半胱氨酸检测试剂盒已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒及其制备与使用方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明第一方面提供了一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：0.01～1.00 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、0.02～2.00mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、0.05～5.00 mmol/L三（2-羧乙基）磷氯化氢、0.5～50.0 mmol/L α-酮戊二酸、5.0～500.0 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.01～0.5%的防腐剂、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：0.5～50.0 KU/L重组同型半胱氨酸甲基转移酶、1.0～100.0 KU/L重组谷氨酸脱氢酶、0.3～30.0 KU/L重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、0.5～50.0 KU/L重组腺苷脱氨酶、5.0～500.0 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.01～0.5%的防腐剂、溶剂为去离子水。
上述检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：0.1 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、0.2 mmol/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、0.5 mmol/L三（2-羧乙基）磷氯化氢、5.0 mmol/Lα- 酮戊二酸、50.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.05%的防腐剂、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：5.0 KU/L重组同型半胱氨酸甲基转移酶、10.0 KU/L重组谷氨酸脱氢酶、3.0 KU/L重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、5.0 KU/L重组腺苷脱氨酶、50.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.05%的防腐剂、溶剂为去离子水。
上述检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，所述防腐剂为Proclin-300、NaN3、G418、叠氮钠、硫柳汞中的一种。
上述检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，所述防腐剂为Proclin-300。
上述检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，所述重组同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，重组谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，重组腺苷脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。
重组同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列（SEQ ID NO：1）具体如下：
MKLLDLLSKGIVIGDGAVGTLLHSHGLQSSFEELNVSDPDLIISIHVQYVAAGADVIQTNTYGANEAKLRMYGLENQVTEINRAAVKLAKASVTDKNAILGTIGGMKHIGAVTTTDMEREFMLLEQAGALLEEQKDGLLLETFYDEFELLHAVKVLRKQTNIPIVAQLALHEAGTTQNGNDVNEILKHLIDYGANVVGLNCQLGPLHMTEAFKMISIPQNGYLSPYPNAGLPNYVEGRYVYEGSPAYFEAMTPRFIEQGIRLLGGCCGTTAEHIQSMKHAVANVTPVIEKDTIQRPKVVHTHEKRSKAHVTLAEKAKKQTTVVVELDPPKTLDTQRFFEGARALKRAGADAITLADNSLASPRISNMAMGALLTKHDIPVLTHLTCRDHNVIGLQSHLLGLSALLMEEVLALTGDPARVGDFPGATSVYDLSSIELIKMIKEMNDGRSILGKSLGPATRFSVGGAFNPHVRHLKAAVKRMERKIDAGAEYFLTQPIYDIALIEEVYEATKHLEQPIFIGIMPLVSKRNADFLHFEVPGITLPEEIRERMDGHETKEAAIEEGIRISQELIDAAMKYFNGIYLITPFLKYEIGEHLVKYVREKQEVKEGIN。
重组谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列（SEQ ID NO：2）具体如下：
MSAKQVSKDEEKEALNLFLSTQTIIKEALRKLGYPGDMYELMKEPQRMLTVRIPVKMDNGSVKVFTGYRSQHNDAVGPTKGGVRFHPPVNEEEVKALSIWMTLKCGIANLPYCGGKGGIICDPRTMSFGELERLSRGYVRAISQIVGPTKDIPAPDVYTNSQIMAWMMDEYSRLREFLSPGFITGKPLVLGGSQGRETATAQGVTICIEEAVKKKGIKLQNARIQIQGFGNAGSFLAKFMHDAGAKVIGISDANGGLYNPDGLDIPYLDDKRDSFGMVTNLFTDVITNEELLEKECDILVPAAISNQITAKNAHNIQASIVVEAANGPTTIDATKILNERGVLLVPDILASAGGVTVSYFNWVQNNQGYYWSEEEVAEKLRSVMVSSFETIYQTAATHKVDMRLAAYMTGIRKSAEASRFRGWV。
重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的氨基酸序列（SEQ ID NO：3）具体如下：
GIDPFTMNAKPGFTDYIVKDIALADFGRKEISLAETEMPGLMATKEEYGPKQPLKGARIAGSLHMTIQTAVLIETLAALGADIRWVSCNIYSTQDHAAAAIAAAGIPVFAVKGETLTEYWDYTAKLFDWHGGGTRNMILDDGGDATMLVHAGYRAEQGDTAFLDKPGSEEEEIFYALVKRLLKEKPKGWFAEIAKNIKGVSEETTTGVHRLYEMANKGTLLFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRESLVDGIRRGTDVMLSGKVAMVAEFGDVGKGSAASLRQAGCRVMVSEVDPICALQAAMEGYEVVTMEDAAPRADIFVTATGNKDIITIEHMRAMKDRAIVCNIGHFDNEIQIASLRNLKWTNIKPQVDEIEFPDKHRIIMLSEGRLVNLGNAMGHPSQVMSASFTNQTLAQIELFANNKDSKYAKKVYVLPKTLDEKVARLTLAKIGVKLTELRKDQADYIGVKQEGPYKSDHYRY。
重组腺苷脱氨酶的氨基酸序列（SEQ ID NO：4）具体如下：
MHTHSTPPDVEALIRDLPKVELHVHLEGSMPADTLFDLARRHGKTDVPDTPEALRDWYVFTDFPHFVEVYLASVATLREEQDFALLAGAVAERLAAQNVRYAEMHVSLYTHLMRGVPARVVFDGIEEARRAAESRHGIQLRWIPDFPADFGLESAEATVEAVLRDAPPSVVGFGVGGVETPLEQYAGVFGRARAAGLASLPHAGEHGGPERVREALDALRAERIGHGIDSMRDEALVGRLAEGRIPVDVSPTSNVCTRAVAELGDHPLPRMLEAGLLVTLNTDDPTMFGTDLNGEYRAAHTLGLDAADHVGLAANGVHASYLGAARRHALLAEIGEVAARHGVDPVRVAALR。
本发明第二方面提供了一种如上所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三（2-羧乙基）磷氯化氢、α- 酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、防腐剂，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐0.01～1.00 mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型0.02～2.00 mmol/L、三（2-羧乙基）磷氯化氢0.05～5.00 mmol/L、α- 酮戊二酸0.5～50.0 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷5.0～500.0 mmol/L、防腐剂质量分数为0.01～0.5%，即得；
（2）R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、防腐剂，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶0.5～50.0 KU/L、重组谷氨酸脱氢酶1.0～100.0 KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶0.3～30.0 KU/L、重组腺苷脱氨酶0.5～50.0 KU/L、三羟甲基氨基甲烷5.0～500.0 mmol/L、防腐剂质量分数为0.01～0.5%，即得。
所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三（2-羧乙基）磷氯化氢、α- 酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐0.1 mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型0.2 mmol/L、三（2-羧乙基）磷氯化氢0.5mmol/L、α- 酮戊二酸5.0mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.05%，即得；
（2）R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶5.0 KU/L、重组谷氨酸脱氢酶10.0 KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶3.0 KU/L、重组腺苷脱氨酶5.0KU/L、三羟甲基氨基甲烷50.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.05%，即得。
本发明第三方面提供了一种如上所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
在全自动生化分析仪中加入待检生物样本，R1试剂，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入R2试剂，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样本浓度数值。
所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
在全自动生化分析仪中加入待测生物样本13μL，R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样本浓度数值。
上述检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的使用方法，所述待检生物样本为血清、血浆、全血、脑脊液、组织液、羊水、淋巴液、尿液、唾液中的一种。
本发明的检测原理是：同型半胱氨酸(Hcy)经还原剂(TCEP)还原后，在重组同型半胱氨酸甲基转移酶(cHMTase)的催化下，与S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM）反应，生成S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和甲硫氨酸(Met)。SAH 在重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(cSAHase)的作用下水解为同型半胱氨酸和腺苷(Ado)。生成的同型半胱氨酸反复循环，不断产生腺苷。腺苷在重组腺苷脱氨酶(cADA)的作用下立即水解成氨和次黄嘌呤(Inosine)，氨与α-酮戊二酸(2-Oxoglutarate)在重组谷氨酸脱氢酶(cGLDH)的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（NADH）转化为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD+），NADH 在340 nm 波长处有吸收峰，通过监测340 nm 处光吸收值下降的速率即可以计算出样本中同型半胱氨酸的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优点：
采用基因工程技术制备的重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶为主要组份，研制出可用于检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒。该试剂盒可以在适当条件下存储2年，试剂性能稳定；可以方便、快速、准确地检测多种生物样本中同型半胱氨酸的含量；并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样本，实现同型半胱氨酸的高通量、快速化测定，精确度和检测效率相比之前都有显著提高；同时实现了检测过程的全自动化，方便检测人员操作，易于推广使用。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明不仅限于这些实施例。
实施例一
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：0.01 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、0.02 mmol/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、0.05 mmol/L三（2-羧乙基）磷氯化氢、0.5 mmol/L α-酮戊二酸、5.0 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.01%的Proclin-300、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：0.5 KU/L 重组同型半胱氨酸甲基转移酶、1.0 KU/L重组谷氨酸脱氢酶、0.3 KU/L 重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、0.5 KU/L重组腺苷脱氨酶、5.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.01%的Proclin-300、溶剂为去离子水。
实施例二
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：1.00 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、2.00 mmol/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、5.00 mmol/L三（2-羧乙基）磷氯化氢、50.0 mmol/L α-酮戊二酸、500.0 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.5%的Proclin-300、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：50.0 KU/L重组同型半胱氨酸甲基转移酶、100.0 KU/L重组谷氨酸脱氢酶、30.0 KU/L重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、50.0 KU/L重组腺苷脱氨酶、500.0 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.5%的Proclin-300、溶剂为去离子水。
实施例三
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：0.1 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、0.2 mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、0.5 mmol/L三（2-羧乙基）磷氯化氢、5.0 mmol/L α-酮戊二酸、50.0 mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.05%的Proclin-300、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：5.0 KU/L重组同型半胱氨酸甲基转移酶、10.0 KU/L重组谷氨酸脱氢酶、3.0 KU/L重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、5.0 KU/L重组腺苷脱氨酶、50.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.05%的Proclin-300、溶剂为去离子水。
实施例四
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三（2-羧乙基）磷氯化氢、α- 酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐0.01 mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型0.02 mmol/L、三（2-羧乙基）磷氯化氢0.05 mmol/L、α-酮戊二酸0.5 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷5.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.01，即得；
（2）R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶0.5 KU/L、重组谷氨酸脱氢酶1.0 KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶0.3 KU/L、重组腺苷脱氨酶0.5KU/L、三羟甲基氨基甲烷5.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.01，即得。
实施例五
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三（2-羧乙基）磷氯化氢、α- 酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐1.00 mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型2.00 mmol/L、三（2-羧乙基）磷氯化氢5.00 mmol/L、α-酮戊二酸50.0 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷500.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.5%，即得；
（2）R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶50.0 KU/L、重组谷氨酸脱氢酶100.0 KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶30.0 KU/L、重组腺苷脱氨酶50.0 KU/L、三羟甲基氨基甲烷500.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.5%，即得。
实施例六
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
（1）R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三（2-羧乙基）磷氯化氢、α-酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐0.1 mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型0.2 mmol/L、三（2-羧乙基）磷氯化氢0.5mmol/L、α-酮戊二酸5.0 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.05%，即得；
（2）R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶5.0 KU/L、重组谷氨酸脱氢酶10.0 KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶3.0 KU/L、重组腺苷脱氨酶5.0KU/L、三羟甲基氨基甲烷50.0 mmol/L、Proclin-300质量分数为0.05%，即得。
实施例七
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
在全自动生化分析仪中加入6个不同浓度的校准品，每个浓度13μL，实施例四制备的R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入实施例四制备的R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算得到校准曲线。
在全自动生化分析仪中加入待测质控样本13μL，实施例四制备的R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入实施例四制备的R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样本浓度数值。
其中6个校准品中同型半胱氨酸浓度分别为：0.00，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00 µmol/L；质控样本中同型半胱氨酸的浓度为15.00µmol/L，质控样本重复测定10次，检测结果详见表1。
实施例八
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
在全自动生化分析仪中加入6个不同浓度的校准品，每个浓度13μL，实施例五制备的R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入实施例五制备的R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算得到校准曲线。
在全自动生化分析仪中加入待测质控样本13μL，实施例五制备的R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入实施例五制备的R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样本浓度数值。
其中6个校准品中同型半胱氨酸浓度分别为：0.00，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00 µmol/L；质控样本中同型半胱氨酸的浓度为15.00µmol/L，质控样本重复测定10次，检测结果详见表1。
实施例九
本发明检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
在全自动生化分析仪中加入6个不同浓度的校准品，每个浓度13μL，实施例六制备的R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入实施例六制备的R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算得到校准曲线。
在全自动生化分析仪中加入待测质控样本13μL，实施例六制备的R1试剂240μL，混匀，37℃温育5.0分钟；然后加入实施例六制备的R2试剂65μL，混匀，使用340 nm主波长、405nm副波长进行检测，37℃恒温2.5分钟后，读取初始吸光度，连续监测2.5分钟的吸光度变化率，由生化分析仪自动计算待测样本浓度数值。
其中6个校准品中同型半胱氨酸浓度分别为：0.00，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00 µmol/L；质控样本中同型半胱氨酸浓度为15.00µmol/L，质控样本重复测定10次，检测结果详见表1。
实施例十
将实施例六制备的试剂盒在室温（25℃）环境下密封避光储存2年后，重复上述实施例九的实验步骤，检测结果详见表1。
表1：质控样本检测结果及分析
试剂 实施例四制备 实施例五制备 实施例六制备 实施例六制备，储存2年后
质控样本浓度 (µmol/L) 15.00 15.00 15.00 15.00
1 14.12 13.97 15.50 14.88
2 14.34 14.20 15.29 15.11
3 13.83 13.00 14.77 15.07
4 16.94 14.54 15.04 14.90
5 15.10 17.06 15.07 15.32
6 14.63 15.52 14.98 15.65
7 14.20 14.00 15.00 15.18
8 16.61 13.18 14.86 14.87
9 13.97 14.27 14.83 14.95
10 14.38 14.03 15.69 15.22
平均值(µmol/L) 14.81 14.38 15.10 15.12
标准差（SD） 1.10 1.17 0.30 0.24
精密度（CV） 7.40% 8.14% 1.99% 1.61%
回收率 98.73% 95.87% 100.67% 100.80%
由表1可知，本发明实施例四、五、六中制备的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒均能准确测定质控样本中同型半胱氨酸的含量，检测结果的精密度与回收率均在可接受范围以内（CV≤10.00%、95.00%≤回收率≤105.00%），其中实施例六的方案为最佳选择，同时该试剂盒在适当条件下存储2年，试剂性能稳定。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 苏州博源医疗科技有限公司
<120> 一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒及其制备与使用方法
<130> 2020.12.31
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Leu Leu Asp Leu Leu Ser Lys Gly Ile Val Ile Gly Asp Gly
1 5 10 15
Ala Val Gly Thr Leu Leu His Ser His Gly Leu Gln Ser Ser Phe Glu
20 25 30
Glu Leu Asn Val Ser Asp Pro Asp Leu Ile Ile Ser Ile His Val Gln
35 40 45
Tyr Val Ala Ala Gly Ala Asp Val Ile Gln Thr Asn Thr Tyr Gly Ala
50 55 60
Asn Glu Ala Lys Leu Arg Met Tyr Gly Leu Glu Asn Gln Val Thr Glu
65 70 75 80
Ile Asn Arg Ala Ala Val Lys Leu Ala Lys Ala Ser Val Thr Asp Lys
85 90 95
Asn Ala Ile Leu Gly Thr Ile Gly Gly Met Lys His Ile Gly Ala Val
100 105 110
Thr Thr Thr Asp Met Glu Arg Glu Phe Met Leu Leu Glu Gln Ala Gly
115 120 125
Ala Leu Leu Glu Glu Gln Lys Asp Gly Leu Leu Leu Glu Thr Phe Tyr
130 135 140
Asp Glu Phe Glu Leu Leu His Ala Val Lys Val Leu Arg Lys Gln Thr
145 150 155 160
Asn Ile Pro Ile Val Ala Gln Leu Ala Leu His Glu Ala Gly Thr Thr
165 170 175
Gln Asn Gly Asn Asp Val Asn Glu Ile Leu Lys His Leu Ile Asp Tyr
180 185 190
Gly Ala Asn Val Val Gly Leu Asn Cys Gln Leu Gly Pro Leu His Met
195 200 205
Thr Glu Ala Phe Lys Met Ile Ser Ile Pro Gln Asn Gly Tyr Leu Ser
210 215 220
Pro Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Pro Asn Tyr Val Glu Gly Arg Tyr Val
225 230 235 240
Tyr Glu Gly Ser Pro Ala Tyr Phe Glu Ala Met Thr Pro Arg Phe Ile
245 250 255
Glu Gln Gly Ile Arg Leu Leu Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Glu
260 265 270
His Ile Gln Ser Met Lys His Ala Val Ala Asn Val Thr Pro Val Ile
275 280 285
Glu Lys Asp Thr Ile Gln Arg Pro Lys Val Val His Thr His Glu Lys
290 295 300
Arg Ser Lys Ala His Val Thr Leu Ala Glu Lys Ala Lys Lys Gln Thr
305 310 315 320
Thr Val Val Val Glu Leu Asp Pro Pro Lys Thr Leu Asp Thr Gln Arg
325 330 335
Phe Phe Glu Gly Ala Arg Ala Leu Lys Arg Ala Gly Ala Asp Ala Ile
340 345 350
Thr Leu Ala Asp Asn Ser Leu Ala Ser Pro Arg Ile Ser Asn Met Ala
355 360 365
Met Gly Ala Leu Leu Thr Lys His Asp Ile Pro Val Leu Thr His Leu
370 375 380
Thr Cys Arg Asp His Asn Val Ile Gly Leu Gln Ser His Leu Leu Gly
385 390 395 400
Leu Ser Ala Leu Leu Met Glu Glu Val Leu Ala Leu Thr Gly Asp Pro
405 410 415
Ala Arg Val Gly Asp Phe Pro Gly Ala Thr Ser Val Tyr Asp Leu Ser
420 425 430
Ser Ile Glu Leu Ile Lys Met Ile Lys Glu Met Asn Asp Gly Arg Ser
435 440 445
Ile Leu Gly Lys Ser Leu Gly Pro Ala Thr Arg Phe Ser Val Gly Gly
450 455 460
Ala Phe Asn Pro His Val Arg His Leu Lys Ala Ala Val Lys Arg Met
465 470 475 480
Glu Arg Lys Ile Asp Ala Gly Ala Glu Tyr Phe Leu Thr Gln Pro Ile
485 490 495
Tyr Asp Ile Ala Leu Ile Glu Glu Val Tyr Glu Ala Thr Lys His Leu
500 505 510
Glu Gln Pro Ile Phe Ile Gly Ile Met Pro Leu Val Ser Lys Arg Asn
515 520 525
Ala Asp Phe Leu His Phe Glu Val Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu Glu
530 535 540
Ile Arg Glu Arg Met Asp Gly His Glu Thr Lys Glu Ala Ala Ile Glu
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Glu Gly Ile Arg Ile Ser Gln Glu Leu Ile Asp Ala Ala Met Lys Tyr
565 570 575
Phe Asn Gly Ile Tyr Leu Ile Thr Pro Phe Leu Lys Tyr Glu Ile Gly
580 585 590
Glu His Leu Val Lys Tyr Val Arg Glu Lys Gln Glu Val Lys Glu Gly
595 600 605
Ile Asn
610
<210> 2
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Ala Lys Gln Val Ser Lys Asp Glu Glu Lys Glu Ala Leu Asn
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Thr Gln Thr Ile Ile Lys Glu Ala Leu Arg Lys Leu
20 25 30
Gly Tyr Pro Gly Asp Met Tyr Glu Leu Met Lys Glu Pro Gln Arg Met
35 40 45
Leu Thr Val Arg Ile Pro Val Lys Met Asp Asn Gly Ser Val Lys Val
50 55 60
Phe Thr Gly Tyr Arg Ser Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys
65 70 75 80
Gly Gly Val Arg Phe His Pro Pro Val Asn Glu Glu Glu Val Lys Ala
85 90 95
Leu Ser Ile Trp Met Thr Leu Lys Cys Gly Ile Ala Asn Leu Pro Tyr
100 105 110
Cys Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Cys Asp Pro Arg Thr Met Ser Phe
115 120 125
Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile Ser Gln
130 135 140
Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Ala Pro Asp Val Tyr Thr Asn
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Ser Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Leu Arg Glu
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Phe Leu Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu Gly Gly
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Ser Gln Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Gln Gly Val Thr Ile Cys Ile
195 200 205
Glu Glu Ala Val Lys Lys Lys Gly Ile Lys Leu Gln Asn Ala Arg Ile
210 215 220
Gln Ile Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Phe Leu Ala Lys Phe Met
225 230 235 240
His Asp Ala Gly Ala Lys Val Ile Gly Ile Ser Asp Ala Asn Gly Gly
245 250 255
Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Leu Asp Ile Pro Tyr Leu Asp Asp Lys Arg
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Asp Ser Phe Gly Met Val Thr Asn Leu Phe Thr Asp Val Ile Thr Asn
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Glu Glu Leu Leu Glu Lys Glu Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala Ala Ile
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Ser Asn Gln Ile Thr Ala Lys Asn Ala His Asn Ile Gln Ala Ser Ile
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Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Ile Asp Ala Thr Lys Ile
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Leu Asn Glu Arg Gly Val Leu Leu Val Pro Asp Ile Leu Ala Ser Ala
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Tyr Tyr Trp Ser Glu Glu Glu Val Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Met
370 375 380
Val Ser Ser Phe Glu Thr Ile Tyr Gln Thr Ala Ala Thr His Lys Val
385 390 395 400
Asp Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Thr Gly Ile Arg Lys Ser Ala Glu
405 410 415
Ala Ser Arg Phe Arg Gly Trp Val
420
<210> 3
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Ile Asp Pro Phe Thr Met Asn Ala Lys Pro Gly Phe Thr Asp Tyr
1 5 10 15
Ile Val Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asp Phe Gly Arg Lys Glu Ile Ser
20 25 30
Leu Ala Glu Thr Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Thr Lys Glu Glu Tyr
35 40 45
Gly Pro Lys Gln Pro Leu Lys Gly Ala Arg Ile Ala Gly Ser Leu His
50 55 60
Met Thr Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Ala Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ala Asp Ile Arg Trp Val Ser Cys Asn Ile Tyr Ser Thr Gln Asp His
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Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gly Ile Pro Val Phe Ala Val Lys
100 105 110
Gly Glu Thr Leu Thr Glu Tyr Trp Asp Tyr Thr Ala Lys Leu Phe Asp
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Trp His Gly Gly Gly Thr Arg Asn Met Ile Leu Asp Asp Gly Gly Asp
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Ala Thr Met Leu Val His Ala Gly Tyr Arg Ala Glu Gln Gly Asp Thr
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Ala Phe Leu Asp Lys Pro Gly Ser Glu Glu Glu Glu Ile Phe Tyr Ala
165 170 175
Leu Val Lys Arg Leu Leu Lys Glu Lys Pro Lys Gly Trp Phe Ala Glu
180 185 190
Ile Ala Lys Asn Ile Lys Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly Val
195 200 205
His Arg Leu Tyr Glu Met Ala Asn Lys Gly Thr Leu Leu Phe Pro Ala
210 215 220
Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Cys Arg Glu Ser Leu Val Asp Gly Ile Arg Arg Gly Thr Asp Val
245 250 255
Met Leu Ser Gly Lys Val Ala Met Val Ala Glu Phe Gly Asp Val Gly
260 265 270
Lys Gly Ser Ala Ala Ser Leu Arg Gln Ala Gly Cys Arg Val Met Val
275 280 285
Ser Glu Val Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Ala Met Glu Gly Tyr
290 295 300
Glu Val Val Thr Met Glu Asp Ala Ala Pro Arg Ala Asp Ile Phe Val
305 310 315 320
Thr Ala Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Thr Ile Glu His Met Arg Ala
325 330 335
Met Lys Asp Arg Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp Asn Glu
340 345 350
Ile Gln Ile Ala Ser Leu Arg Asn Leu Lys Trp Thr Asn Ile Lys Pro
355 360 365
Gln Val Asp Glu Ile Glu Phe Pro Asp Lys His Arg Ile Ile Met Leu
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Ser Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Asn Ala Met Gly His Pro Ser
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Gln Val Met Ser Ala Ser Phe Thr Asn Gln Thr Leu Ala Gln Ile Glu
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Leu Pro Lys Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Arg Leu Thr Leu Ala Lys
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Ile Gly Val Lys Leu Thr Glu Leu Arg Lys Asp Gln Ala Asp Tyr Ile
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Gly Val Lys Gln Glu Gly Pro Tyr Lys Ser Asp His Tyr Arg Tyr
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<211> 352
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
Met His Thr His Ser Thr Pro Pro Asp Val Glu Ala Leu Ile Arg Asp
1 5 10 15
Leu Pro Lys Val Glu Leu His Val His Leu Glu Gly Ser Met Pro Ala
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Asp Thr Leu Phe Asp Leu Ala Arg Arg His Gly Lys Thr Asp Val Pro
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Asp Thr Pro Glu Ala Leu Arg Asp Trp Tyr Val Phe Thr Asp Phe Pro
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His Phe Val Glu Val Tyr Leu Ala Ser Val Ala Thr Leu Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Asp Phe Ala Leu Leu Ala Gly Ala Val Ala Glu Arg Leu Ala Ala
85 90 95
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Met Arg Gly Val Pro Ala Arg Val Val Phe Asp Gly Ile Glu Glu Ala
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Arg Arg Ala Ala Glu Ser Arg His Gly Ile Gln Leu Arg Trp Ile Pro
130 135 140
Asp Phe Pro Ala Asp Phe Gly Leu Glu Ser Ala Glu Ala Thr Val Glu
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Ala Val Leu Arg Asp Ala Pro Pro Ser Val Val Gly Phe Gly Val Gly
165 170 175
Gly Val Glu Thr Pro Leu Glu Gln Tyr Ala Gly Val Phe Gly Arg Ala
180 185 190
Arg Ala Ala Gly Leu Ala Ser Leu Pro His Ala Gly Glu His Gly Gly
195 200 205
Pro Glu Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Ala Leu Arg Ala Glu Arg Ile
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Gly His Gly Ile Asp Ser Met Arg Asp Glu Ala Leu Val Gly Arg Leu
225 230 235 240
Ala Glu Gly Arg Ile Pro Val Asp Val Ser Pro Thr Ser Asn Val Cys
245 250 255
Thr Arg Ala Val Ala Glu Leu Gly Asp His Pro Leu Pro Arg Met Leu
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Glu Ala Gly Leu Leu Val Thr Leu Asn Thr Asp Asp Pro Thr Met Phe
275 280 285
Gly Thr Asp Leu Asn Gly Glu Tyr Arg Ala Ala His Thr Leu Gly Leu
290 295 300
Asp Ala Ala Asp His Val Gly Leu Ala Ala Asn Gly Val His Ala Ser
305 310 315 320
Tyr Leu Gly Ala Ala Arg Arg His Ala Leu Leu Ala Glu Ile Gly Glu
325 330 335
Val Ala Ala Arg His Gly Val Asp Pro Val Arg Val Ala Ala Leu Arg
340 345 350

Claims (4)

1.一种检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，其特征在于：包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：0.01～1.00mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、0.02～2.00mmol/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、0.05～5.00mmol/L三(2-羧乙基)磷氯化氢、0.5～50.0mmol/Lα-酮戊二酸、5.0～500.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.01～0.5％的防腐剂、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：0.5～50.0KU/L重组同型半胱氨酸甲基转移酶、1.0～100.0KU/L重组谷氨酸脱氢酶、0.3～30.0KU/L重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、0.5～50.0KU/L重组腺苷脱氨酶、5.0～500.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.01～0.5％的防腐剂、溶剂为去离子水；
所述防腐剂为Proclin-300；
所述重组同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，重组谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，重组腺苷脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：4所示。
2.根据权利要求1所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒，其特征在于：包括R1试剂与R2试剂两种彼此独立的试剂，其中，
所述R1试剂组成成分为：0.1mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐、0.2mmol/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、0.5mmol/L三(2-羧乙基)磷氯化氢、5.0mmol/Lα-酮戊二酸、50.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.05％的Proclin-300、溶剂为去离子水；
所述R2试剂组成成分为：5.0KU/L重组同型半胱氨酸甲基转移酶、10.0KU/L重组谷氨酸脱氢酶、3.0KU/L重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、5.0KU/L重组腺苷脱氨酶、50.0mmol/L三羟甲基氨基甲烷、质量分数为0.05％的Proclin-300、溶剂为去离子水。
3.一种如权利要求1所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三(2-羧乙基)磷氯化氢、α-酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、防腐剂，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐0.01～1.00mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型0.02～2.00mmol/L、三(2-羧乙基)磷氯化氢0.05～5.00mmol/L、α-酮戊二酸0.5～50.0mmol/L、三羟甲基氨基甲烷5.0～500.0mmol/L、防腐剂质量分数为0.01～0.5％，即得；
(2)R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、防腐剂，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶0.5～50.0KU/L、重组谷氨酸脱氢酶1.0～100.0KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶0.3～30.0KU/L、重组腺苷脱氨酶0.5～50.0KU/L、三羟甲基氨基甲烷5.0～500.0mmol/L、防腐剂质量分数为0.01～0.5％，即得；
所述防腐剂为Proclin-300；
所述重组同型半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，重组谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，重组腺苷脱氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：4所示。
4.根据权利要求3所述的检测生物样本中同型半胱氨酸含量的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)R1试剂的制备：称取S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型、三(2-羧乙基)磷氯化氢、α-酮戊二酸、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为S-腺苷甲硫氨酸盐0.1mmol/L、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型0.2mmol/L、三(2-羧乙基)磷氯化氢0.5mmol/L、α-酮戊二酸5.0mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50.0mmol/L、Proclin-300质量分数为0.05％，即得；
(2)R2试剂的制备：称取重组同型半胱氨酸甲基转移酶、重组谷氨酸脱氢酶、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、重组腺苷脱氨酶、三羟甲基氨基甲烷、Proclin-300，依次加入去离子水中，搅拌溶解，定容至终浓度分别为重组同型半胱氨酸甲基转移酶5.0KU/L、重组谷氨酸脱氢酶10.0KU/L、重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶3.0KU/L、重组腺苷脱氨酶5.0KU/L、三羟甲基氨基甲烷50.0mmol/L、Proclin-300质量分数为0.05％，即得。
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