CN104111338B

CN104111338B - 一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN104111338B
Application number: CN201410190785.3A
Authority: CN
Inventors: 甘宜梧; 王进; 谭柏清; 李进
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: CN104111338A

Abstract

本发明提供了一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒，由体积比为240:65的组分1和组分2组成。通过在组分1中加入抗坏血酸氧化酶，有效地增强了试剂盒的抗干扰性，减小了丙酮酸等干扰物质对试剂盒检测的影响，从而增强了试剂检测的准确性，与化学发光检测试剂盒检测结果达到极高的一致性，比常规的同型半胱氨酸检测试剂盒灵敏度和准确度高，增强了市场竞争力，有利于试剂的市场推广。

Description

一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒，属临床体外检测试剂技术领域。

背景技术

同型半胱氨酸(又称高半胱氨酸Homocysteine ，HCY) 是含硫氨基酸，在细胞内由蛋氨酸脱甲基生成。McCully 于1969 年最先将重度同型半胱氨酸血症(tHCY浓度100 - 450μmol/ L) 与动脉粥样硬化疾病相联系，重度同型半胱氨酸血症是由于参与同型半胱氨酸代谢的转甲基或转硫作用的酶缺陷所致，常见的有胱硫酶合成酶及亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷。重度同型半胱氨酸血症病人有早发性动脉粥样硬化，动静脉栓塞及智力障碍。近年来，人们开始注意同型半胱氨酸与心血管疾病的联系。同型半胱氨酸可使小动脉血管易于栓塞及促进血管平滑肌细胞增殖参与粥样硬化形成。同型半胱氨酸活化形式(Homocystein thiolactone) 可促使血小板聚集，并可与载脂蛋白B 形成致密的复合物易于被血管壁巨噬细胞吞噬，引起血管壁脂肪堆积。同型半胱氨酸能增强其它心血管疾病危险因素如胆固醇、高血压及吸烟对心血管的损害。通过上述机制，同型半胱氨酸促进动脉粥样硬化及血栓形成，使心血管疾病发病率及死亡率增加，血中同型半胱氨酸浓度升高(tHCY ≥12μmol/ L) 是冠心病、中风、外周血管粥样硬化及动静脉栓塞的危险因子，血中同型半胱氨酸升高使心血管疾病发病率及死亡率增加。

有报告高同型半胱氨酸血症是周围强直性脊柱炎（As ）疾病如间歇性跛行及深静脉血栓的一个独立危险因素。近来的研究表明，高同型半胱氨酸血症除与血管疾病有关外，还与神经管畸形、先兆子痫、帕金森氏病、老年痴呆、胎儿生长迟缓、慢性肾功能衰竭等多种疾病有关。因此测定血中tHCY浓度在临床上意义十分重要。

对于同型半胱氨酸检测的方法主要有：同位素标记检测、HPLC液相色谱检测、荧光偏振法检测、化学发光检测和酶法检测。由于同位素标记检测和HPLC液相色谱检测方法，灵敏度较差，而且同位素标记检测方法有放射污染，因此这两种方法已经逐渐被淘汰。荧光偏振法和化学发光检测方法灵敏度、准确度都比较好，但是配套仪器和试剂盒成本较高，影响了市场推广。现在医院对于同型半胱氨酸检测的试剂盒多采用酶法检测，该方法操作简单，应用医院常见的全自动生化分析仪进行检测，成本较低。

酶法检测的主要原理为基于小分子捕获技术（SMT）的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。 Hcy被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷在腺苷脱氨酶作用下，立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。

具体的反应流程为：

利用酶法对同型半胱氨酸进行检测的方法操作简单，而且检测同型半胱氨酸对临床心血管疾病诊断有着很好指导意义，因此最近几年得到了很好的推广。但是该检测方法，容易受到血清中丙酮酸等杂质物质的干扰，造成检测的结果不准确，在与化学发光检测试剂盒比对时，结果有偏差，不利于临床检测应用。

发明内容

针对于上述常规同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）存在的技术问题，本发明提供了一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），本试剂盒能够与化学发光检测的结果具有高度的一致性（相关系数r≥0.990），检测临床样本准确度、灵敏度比常规的试剂要好，有利于提高临床检测同型半胱氨酸的准确性。

本发明是通过以下措施实现的：

一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），包括组分1（R1）和组分2（R2）；各组分原料含量如下：

组分1（R1）：

S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1-1mM

NADH 0.3-1mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5-5 mM

α－酮戊二酸 1-10mM

抗坏血酸氧化酶 1-5 KU/L

组分2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase） 1-10KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH) 1-10KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 0.5-5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA） 5-10KU/L；

进一步的，组分2中还包含胱硫醚β-合成酶（CBS） 20-50 KU/L;

所述抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），包括组分1（R1）和组分2（R2），应用时体积比为R1：R2=240：65。

优选的，各组分原料及含量为：

各组分原料含量如下：

组分1（R1）：

S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1mM

NADH 0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5mM

α－酮戊二酸 5mM

抗坏血酸氧化酶 2.5KU/L；

组分2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase） 5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH) 10KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 2.5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA） 5 KU/L

胱硫醚β-合成酶（CBS） 25 KU/L。

本发明的有益效果：

本发明提供的抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），通过在组分1中加入抗坏血酸氧化酶，在组分2中加入胱硫醚β-合成酶，有效地增强了试剂盒的抗干扰性，减小了丙酮酸等干扰物质对试剂盒检测的影响，从而增强了试剂检测的准确性，与化学发光检测试剂盒检测结果达到极高的一致性，比常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）灵敏度和准确度高。

附图说明

图1为实施例1与化学发光性检查法的线性相关性曲线图。

图2为实施例2与化学发光性检查法的线性相关性曲线图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例 1 （空白对比例）

组分1（R1）：

S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1mM

NADH 0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5 mM

α－酮戊二酸 1mM

组分2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase） 1KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH) 1KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 0.5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA） 5KU/L

本实施例描述的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如东芝40自动分析仪，操作如表1：

表1 同型半胱氨酸检测试剂检测方法

计算：同型半胱氨酸浓度＝（∆A测定/min÷∆A标准/min）×C标准

实施例 2

组分1（R1）：

S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1mM

NADH 0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5 mM

α－酮戊二酸 5mM

抗坏血酸氧化酶 2.5KU/L

组分2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase） 5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH) 10KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 2.5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA） 5KU/L

胱硫醚β-合成酶（CBS） 25 KU/L

具体测定方法同实施例1。

实施例 3

组分1（R1）：

S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.5mM

NADH 0.5mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 2.5 mM

α－酮戊二酸 5mM

抗坏血酸氧化酶 2.5KU/L

组分2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase） 5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH) 5KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 2.5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA） 5KU/L

胱硫醚β-合成酶（CBS） 30 KU/L

具体测定方法同实施例1。

实施例 4

组分1（R1）：

S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 1mM

NADH 1mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 5 mM

α－酮戊二酸 10mM

抗坏血酸氧化酶 5KU/L

组分2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase） 10KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH) 10KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA） 10KU/L

胱硫醚β-合成酶（CBS） 25 KU/L；

具体测定方法同实施例1。

线性相关性实验

对Sigma-Aldrich超纯物质同型半胱氨酸配制成51.2 µmol/L浓度的高值样本，对该样本等比例稀释成25.6µmol/L、12.8µmol/L、6.4µmol/L、3.2µmol/L、0µmol/L浓度的样本，分别利用实施例1和实施例2的试剂进行检测，测定流程同实施例1。检测结果如表2所示：

表2 线性相关性检测结果

通过检测理论标准品，实施例1检测结果相关性为0.9928，实施例2检测结果的相关性为0.9999，说明在试剂中加入抗坏血酸氧化酶和胱硫醚β-合成酶（CBS），增强了试剂检测的线性相关性，检测结果更精确。

准确度验证实验

应用实施例1和实施例2的试剂盒，对比Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的同型半胱氨酸检测试剂盒（化学发光），对40个样本进行检测，检测的结果如图1和图2所示。

通过检测结果的对比，实施例1的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的化学发光试剂盒检测结果相关性为0.9581，小于要求的0.990，相关性比较差，而实施例2的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的化学发光试剂盒检测结果相关性为0.9989，能达到≥0.990的要求，显示本发明的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的同型半胱氨酸检测试剂盒（化学发光）有高度一致性。

抗干扰性试验

取新鲜混合血清，分成11等份，然后将每等份再分成10等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表3的要求。对照组以市售的北京九强生物技术有限公司销售的同型半胱氨酸检测试剂盒，实验组以本发明中实施例制备的试剂盒为检测试剂，分别测定血清中HCY的含量，对照组与实验组的测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表3。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表3可以看出，本发明对检测结果没有明显的干扰，而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明本发明试剂的抗干扰性能力远远优于对照组市售试剂。

表3 对照组与实验组抗干扰性能比较

本发明提供的抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），包括体积比为R1：R2=240:65的组分1（R1）和组分2（R2）组成。通过在组分1中加入抗坏血酸氧化酶，有效地增强了试剂盒的抗干扰性，减小了丙酮酸等干扰物质对试剂盒检测的影响，从而增强了试剂检测的准确性，与化学发光检测试剂盒检测结果达到极高的一致性，比常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）灵敏度和准确度高，增强了市场竞争力，有利于试剂的市场推广。

Claims

1.一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒，包括体积比为240：65的组分1和组分2；各组分的原料及含量如下：

组分1：

S-腺苷甲硫氨酸 0.1-1mM

NADH 0.3-1mM

三（2羧乙基）膦氯化氢 0.5-5 mM

α－酮戊二酸 1-10mM

抗坏血酸氧化酶 1-5 KU/L ；

组分2：

Hcy甲基转移酶 1-10KU/L

谷氨酸脱氢酶 1-10KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶 0.5-5KU/L

腺苷脱氨酶 5-10KU/L

胱硫醚β-合成酶 20-50 KU/L。

2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，各组分的原料和含量如下：

组分1 ：

S-腺苷甲硫氨酸 0.1mM

NADH 0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢 0.5mM

α－酮戊二酸 5mM

抗坏血酸氧化酶 2.5KU/L ；

组分2：

Hcy甲基转移酶 5KU/L

谷氨酸脱氢酶 10KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶 2.5KU/L

腺苷脱氨酶 5 KU/L

胱硫醚β-合成酶 25 KU/L 。