CN106970230B

CN106970230B - 一种同型半胱氨酸测定试剂盒

Info

Publication number: CN106970230B
Application number: CN201710196949.7A
Authority: CN
Inventors: 刘光华
Original assignee: Guangzhou Yichuan Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Yichuan Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN106970230A

Abstract

本申请提供一种同型半胱氨酸测定试剂盒，含有试剂1和试剂2，所述试剂1含有TRIS、HCL、山梨酸钾、serine、NADH、LDH；所述试剂2含有TRIS、HCL、山梨酸钾、CBS、CBL。本申请提供的试剂盒相比于水解酶比色法只需要三步偶联即可完成检测，所需要原材料较少，成本较低。在HCY含量低于100umol/L时，均可采用线性定标，其操作简单，线性范围较宽。

Description

一种同型半胱氨酸测定试剂盒

技术领域

本发明涉同型半胱氨酸测定试剂盒。

背景技术

同型半胱氨酸(HCY)，是一种含巯基的氨基酸，其主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。

在体内，约1/2的HCY和甲基四氢叶酸在蛋氨酸合成酶(Methionine Synthasereductase,MS)的作用下生成蛋氨酸和四氢叶酸。四氢叶酸在N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetralydrofolate,MTHFR)的作用下生成甲基四氢叶酸。其余约1/2的HCY通过转硫基途径，即HCY与丝氨酸在胱硫醚β合成酶(Cystathionineβ-synthase,CBS)的作用下形成胱硫醚，一部分在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸，最后生成丙酮酸、硫酸和水，此过程需维生素B6作为辅酶以及丝氨酸羟甲基转移酶，另一部分则生成同型丝氨酸。

任何原因引起前两条代谢途径障碍时，升高的HCY在氨基酰-tRNA合成酶的作用下，生成同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone,HTL)，HTL是HCY在氨基酰-tRNA合成酶编辑或校正过程中形成的反应产物，属一种环硫酯。HCY可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。

目前常用的检测同型半胱氨酸的方法包括以下几种：

同位素法：由Refsum等1985年建立的方法。该方法通过C¹⁴标记的腺苷与HCY缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测HCY浓度。该方法灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。

色谱法：1987年Stabler首先报道了气相色谱―质谱法测定同型半胱氨酸。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。虽然灵敏度、特异性好，但仪器价格昂贵而不能推广。高效液相色谱法(HPLC)是目前比较成熟且推广使用的方法，不足之处是样品处理、层析条件、样品检测及定量的诸多变异，使其难以标准化。Fiskertrand等首先于1993年用全自动高效液相色谱法对血浆和尿液中的HCY和硫醇物进行测定。HPLC根据衍生方式(柱前或柱后衍生)、检测方法(荧光、电化学)可分为多种方法。应用HPLC准确测定同型半胱氨酸需要优良的设备、高超的技术经验和应用HPLC方法适当的时间。因此，由于该方法操作难度大，对设备的要求苛刻，不适合作为常规的医疗检测。

水解酶比色法：利用S-腺苷甲硫氨酸、还原型辅酶Ⅰ、α-酮戊二酸5.0mmol/L同型半胱氨酸甲基转移酶、谷氨酸脱氢酶、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、腺苷脱氨酶偶联反应测定，根据其反应速率快慢测定样本中HCY水平。此方法所需要的原材料较多且价格比较昂贵，大规模生产时成本较高，测定时为非线性定标，操作比较麻烦，由于存在非线性定标的局限性，用于试剂测定时线性也较窄，最高只可达到50umol/L。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种同型半胱氨酸测定试剂盒包括体积比为4:1的试剂1和试剂2，所述试剂1含有溶质TRIS、HCL、山梨酸钾、serine、NADH、LDH；所述试剂2含有溶质TRIS、HCL、山梨酸钾、CBS、CBL。

在本发明的一些实施方式中，每1L所述试剂1含有溶质：TRIS5-20g；HCL1-15ml；山梨酸钾0.5-2g；serine0.5-2mmol；NADH0.1-1mmol；LDH15-30KU；每1L所述试剂2含有溶质：TRIS5-20g；HCL1-15ml；山梨酸钾0.5-2g；CBS0.5-2g；CBL0.1-1g。

在本发明的一些实施方式中，每1L所述试剂1含有溶质：TRIS12g；HCL8ml；山梨酸钾1g；serine1mmol；NADH0.5mmol；LDH20KU；每1L所述试剂2含有溶质：TRIS12g；HCL8ml；山梨酸钾1g；CBS1g；CBL0.4g。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂1和试剂2中的溶剂均为水。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂2中还含有丙三醇和甘露醇。

在本发明的一些实施方式中，每1L所述试剂2含有丙三醇100～500ml，含有甘露醇5～25g。

在本发明的一些实施方式中，每1L所述试剂2含有丙三醇400ml，含有甘露醇20g。

此外，本发明还提供了一种同型半胱氨酸测定试剂盒的使用方法：

在使用时，使用时间和配置时间每相差1年，向所述试剂2中补入初始CBS含量的25％。

本发明以胱硫酶比色法为基础，即丝氨酸在CBS作用下生成L－胱硫醚，L－胱硫醚在CBL作用下生成同型半胱氨酸、丙酮酸和NH3，丙酮酸与辅酶NADH在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸和NAD。在340nm波长下检测NADH吸光度下降速率，其下降速率与样本中HCY的含量成正比。

本发明提供的试剂盒相比于水解酶比色法只需要三步偶联即可完成检测，所需要原材料较少，成本较低。在HCY含量低于100umol/L时，均可采用线性定标，其操作简单，线性范围较宽。此外，加入稳定剂丙三醇和甘露醇，对CBS起稳定保护使用，从而使CBS在37度加速14天时失活率仅为2％，试剂可储存2年时间。

具体实施方式

为了使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明作进一步详细的说明，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻的理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明提供一种同型半胱氨酸测定试剂盒，该试剂盒包括试剂1和试剂2，并且试剂1和试剂2均为液体制剂，在测定时试剂1和2结合使用。

其中，试剂1和试剂2中的溶剂均为水。试剂1和试剂2的体积比为4:1。

每1L试剂1中含有溶质：

TRIS(三羟甲基氨基甲烷)：5-20g；

HCL：1-15ml；

山梨酸钾：0.5-2g；

serine(丝氨酸)：0.5-2mmol；

NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态，还原型辅酶Ⅰ)：0.1-1mmol；

LDH(乳酸脱氢酶)：15-30KU；

其余为溶剂水。

每1L试剂2中含有溶质：

TRIS(三羟甲基氨基甲烷)：5-20g；

HCL：1-15ml；

山梨酸钾：0.5-2g；

CBS(胱硫醚缩合酶)：0.5-2g；

CBL(胱硫醚β-分解酶)：0.1-1g；

丙三醇：100～500ml；

甘露醇：5～25g；

其余为溶剂水。

在本发明一个优选的实施方式中

每1L试剂1中含有溶质：

TRIS(三羟甲基氨基甲烷)：12g；

HCL：8ml；

山梨酸钾：1g；

serine(丝氨酸)：1mmol；

NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态，还原型辅酶Ⅰ)：0.5mmol；

LDH(乳酸脱氢酶)：20KU；

其余为溶剂水。

每1L试剂2中含有溶质：

TRIS(三羟甲基氨基甲烷)：12g；

HCL：8ml；

山梨酸钾：1g；

CBS(胱硫醚缩合酶)：1g；

CBL(胱硫醚β-分解酶)：0.4g；

丙三醇：400ml；

甘露醇：20g；

其余为溶剂水。

待测样品：人的不溶血的血清。

实验步骤：

1：用上述试剂与北京九强公司生产的水解酶比色法试剂对比测定。

2：用生化分析仪(奥林巴斯AU400)定标测定30例血清样本。

A：水解酶比色法试剂和本发明提供的试剂盒测定样本结果对比(测定HCY浓度50umol/L以下样本)

上表中HCY测定结果的单位为umol/L。

经统计相关系数＝0.9997，说明相关性良好，两种方法的测定结果无明显差异。

B：水解酶比色法试剂和本发明提供的试剂盒测定样本结果对比(测定HCY浓度50umol/L以上样本)

上表中HCY测定结果的单位为umol/L。

经统计，本发明试剂盒(胱硫酰法试剂)测定结果比水解酶比色法试剂测定结果圴高很多。

在HCY浓度高于50umol/L的样本中随机挑选其中的高(23号)、中(26号)、低(30号)三个样本进行梯度稀释测定，以确定两种方法的结果差异，下表中的HCY测定结果的单位为umol/L：

以上3例标本进行梯度稀释时表明，经过梯度稀释，本发明提供的试剂盒测得的HCY浓度和稀释比例具有更强的线性相关性，即当样品中HCY浓度升高一倍时，测定值也升高一倍，且该线性相关性在HCY浓度低于100umol/L时均较强。反观水解酶比色法试剂测定的结果，当HCY浓度超过50umol/L时，其测定结果明显偏低，其线性相关性显著下降。因此，本发明提供的试剂盒的测定方法准确性高于水解酶比色法试剂。

C：本发明提供的试剂盒的稳定性

为了研究本发明提供的试剂盒的稳定性，在采用该试剂盒测定时，试剂2中不添加稳定剂丙三醇和甘露醇，即每1L试剂2中含有溶质：

TRIS(三羟甲基氨基甲烷):12g；

HCL：8ml；

山梨酸钾：1g；

CBS(胱硫醚缩合酶)：1g；

CBL(胱硫醚β-分解酶)：0.4g；

其余为溶剂水。

对10例血清样本进行测定，比较刚配置时、在37度下加速7天和在37度下加速14天的测定结果：

37度下加速7天和37度下加速14天的含义为：将试剂放置在密封瓶子中，再放入37℃水浴箱中，进行加速破坏试验。在37℃下进行破坏性试验1周，相当于一般储存温度(2～8℃)保存1年。

上表中HCY测定结果的单位为umol/L。

从上述数据中统计得到结论，在不添加稳定剂的情况下，加速7天时测值平均下降19.8％，加速14天时测值平均下降51.5％，测定值随着时间推迟，下降速度非常明显。

为验证37度加速14天后试剂的测值下降较多是由于哪个原料失活引起，分别在经过37度加速14天后的试剂2中加入其主要组成成分CBS和CBL，然后分别进行测定，结果如下：

上表中HCY测定结果的单位为umol/L。

其中，补入CBS的量为初始值的50％，即向每1L试剂2中加入1g×50％＝0.5g；

其中，补入CBL的量为初始值的50％，即向每1L试剂2中加入0.4g×50％＝0.2g；

从上述数据中可以看出经补入CBS后测定值与刚配置时无明显差异，但是在补加CBL后测定值无明显改善(测定值仍较低)，因此，说明37度加速14天对试剂2中的CBS破坏较为严重，CBS严重失活。

即，在使用时，使用时间和配置时间每相差1年，向所述试剂2中补入初始CBS含量的25％。

在试剂2加入稳定剂丙三醇和甘露醇后，测定第31～40号样本的测定结果：

上表中HCY测定结果的单位为umol/L。

从上述数据中可以得到在37度下加速7天时测定值平均下降1.0％，在37度下加速14天时测定值平均下2.1％，下降速度比未加稳定剂时有明显好转，上述结果说明加入稳定剂丙三醇和甘露醇后，CBS得到了充分保护，未明显失活。

稳定剂丙三醇、甘露醇在试剂2中的用量考察：

配方一如下：

试剂1：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、serine：1mmol/L、NADH：0.5mmol/L、LDH：20KU/L；

试剂2：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、CBS：1g/L、CBL：0.4g/L；

配方二如下：

试剂2：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、CBS：1g/L、CBL：0.4g/L、丙三醇：100ml/L、甘露醇：5g/L；

配方三如下：

试剂2：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、CBS：1g/L、CBL：0.4g/L、丙三醇：200ml/L、甘露醇：10g/L；

配方四如下：

试剂2：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、CBS：1g/L、CBL：0.4g/L、丙三醇：300ml/L、甘露醇：15g/L；

配方五如下：

试剂2：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、CBS：1g/L、CBL：0.4g/L、丙三醇：400ml/L、甘露醇：20g/L；

配方六如下：

试剂2：TRIS：12g/L、HCL：8ml/L、山梨酸钾：1g/L、CBS：1g/L、CBL：0.4g/L、丙三醇：500ml/L、甘露醇：25g/L；

为考察稳定剂丙三醇、甘露醇在试剂2中的用量，对10例血清样本进行测定，分别检测配方一至配方六在为加速和37度加速14天时HCY的浓度，结果如下表所示。

表配方一至配方六在刚配制时和37度加速14天时HCY的浓度测值(单位：umol/L)

从上表可以看出，配方一均值下降比例达到了49.3％，配方二至配方六分别加入稳定剂丙三醇100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、甘露醇5g、10g、15g、20g、25g后下降值分别为：37.3％，22.9％，10.2％，2.3％，2.5％。说明稳定剂在试剂2中的加样量丙三醇100ml～500ml、甘露醇5g～25g时均能起到一定的保护作用。

此外，从配方一至配方六的反应曲线可以得出，当采用配方一至配方五时反应迅速，而采用配方六时反应较慢，说明稳定剂的加入量超过配方五中的丙三醇400ml、甘露醇20g时，会对配方中成份产生一定的抑制，导致反应不能迅速进行。

因此，配方五中加入的丙三醇400ml、甘露醇20g的综合效果最佳。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制性的。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，但本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种同型半胱氨酸测定试剂盒，由体积比为4:1的试剂1和试剂2组成，其中：

每1L所述试剂1的溶质为：

TRIS：5-20g；

HCL：1-15ml；

山梨酸钾：0.5-2g；

serine：0.5-2mmol；

NADH：0.1-1mmol；

LDH：15-30KU；

每1L所述试剂2的溶质为：

TRIS：5-20g；

HCL：1-15ml；

山梨酸钾：0.5-2g；

CBS：0.5-2g；

CBL：0.1-1g；

丙三醇400ml；

甘露醇20g；

所述试剂1和试剂2中的溶剂均为水。

2.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸测定试剂盒，其中：

每1L所述试剂1的溶质为：

TRIS：12g；

HCL：8ml；

山梨酸钾：1g；

serine：1mmol；

NADH：0.5mmol；

LDH：20KU；

每1L所述试剂2的溶质为：

TRIS：12g；

HCL：8ml；

山梨酸钾：1g；

CBS：1g；

CBL：0.4g；

丙三醇400ml；

甘露醇20g。