CN102393373A - 一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检验测定技术领域，特别是一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法及试剂。它通过构建一种基于胱硫醚合成酶-胱硫醚裂解酶-乳酸脱氢酶偶联、可消除内源性胱硫醚干扰的同型半胱氨酸测定新体系，实现对同型半胱氨酸的准确测定和测定结果真实的目的。并依据该法构建的同型半胱氨酸测定试剂置2-8℃保存可稳定14个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，满足大规模测定样本的要求。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域，特别是一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法及试剂。
背景技术
血清/浆同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是一种含硫分子的氨基酸，在身体内经由甲硫氨酸(methionine)代谢后而得到的中间代谢产物。众多临床资料已经证实HCY是心脏冠状动脉硬化、心肌梗塞、脑中风和末梢血管阻塞的重大危险因子。长久以来，医学上都认为心脏疾病与胆固醇增加有关，但是却仍有25％的心脏病患者在体内没有明显的胆固醇或其它危险因子升高的现象。上世纪60年代末期，一些学者注意到患有遗传性高胱氨酸尿症的病人，大多数伴有亚临床心血管病。1976年，Wichen等通过流行病学调查提出同型半胱氨酸是心血管病人一个独立危险因素，但一直未受到人们重视。近年来的研究发现，同型半胱胺酸HCY的代谢与心血管疾病或中风有极大关联。动物试验表明，应用3％蛋氨酸饮食长期喂养家兔，诱发同型半胱氨酸血症，家兔血中甘油三酯、游离脂肪酸、脂质过氧化物含量均明显升高，病理检查表明主动脉脂肪大量沉积，并发生动脉粥样硬化。Glueck等报道，他们对482例高血脂病人进行分析，18例患者同时伴有血浆同型半胱氨酸含量升高。其中13人患有动脉粥样硬化，发病率为72％，远高于血浆同型半胱氨酸含量正常的高血脂患者。在18例高同型半胱氨酸血症患者的直系亲属中动脉粥样硬化的发病率可达78％。目前，HCY对心血管疾病的诊断意义已被临床充分重视。
由于同型半胱氨酸测定对心血管疾病的诊断有较好的特异性和灵敏度，在近20年中，测定方法得到不断开发和改进。主要有高效液相色谱法(HPLC)、荧光偏振免疫测定法(FPIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)等。这些方法需要对HCY进行衍生和复杂的样品前处理，同时需特殊、昂贵仪器，不适合临床常规分析。近几年来，利用酶法测定HCY的方法得到了开发和改进，目前临床上主要应用美国Teco Diagnostics公司的Homocysteine Reagent(下称“Teco法”)进行HCY的测量，该法通过循环酶反应将HCY转化为丙酮酸钠，然后用测定丙酮酸钠的方法对HCY进行定量，此法灵敏度高，可应用于临床广泛使用的全自动生化分析仪，从而实现HCY的自动化分析，但该法无法排除内源性胱硫醚干扰，易使HCY测定结果假性升高。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够消除内源性胱硫醚干扰，测定结果真实、准确的血清同型半胱氨酸测定方法及试剂。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术解决方案：一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、还原性辅酶I(NADH)、乳酸脱氢酶(LDH)、海藻糖的pH8.50-9.00Tris-HCl缓冲液为试剂I，按一定比例加入含内源性干扰物质胱硫醚的待测同型半胱氨酸(HCY)血清样品，监测340nm处吸光度的降低值，与标准液对照后计算出由干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度Chcy，1；
(2)配制含丝氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7.50-7.80Tris-HCl缓冲液为试剂II，将试剂II按一定比例加入到第(1)步试剂I和待测血清样品的混合溶液中，监测340nm处吸光度下降速率，与标准液对照后计算出同型半胱氨酸总浓度Chcy，2；
(3)将第(2)步所测得的同型半胱氨酸总浓度Chcy，2减去第(1)步所测得的同型半胱氨酸浓度Chcy，1得血清同型半胱氨酸(HCY)浓度C血清hcy。
步骤(1)中的反应条件为在37℃环境中反应180-600秒；步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应90-480秒。
步骤(1)中，所述血清样品与所述试剂I的体积比为V血清∶V试剂I＝16.5∶250；
步骤(2)中，所述血清样本与所述试剂I、试剂II的体积比为V血清∶V试剂I∶V试剂II＝16.5∶250∶50。
步骤(1)中，所述试剂I中各物质最适浓度为：pH8.50-9.00Tris-HCl浓度为30-100mmol/L，所述胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为10-50KU/L，所述还原性辅酶I(NADH)浓度为4-6g/L，所述乳酸脱氢酶(LDH)浓度为30-100KU/L，所述海藻糖浓度为20-100g/L；
步骤(2)中，所述试剂II中各物质最适浓度为：pH7.50-7.80Tris-HCl浓度为50-200mmol/L，所述丝氨酸浓度为2.5-10mmol/L，所述胱硫醚合成酶(CBS)浓度为30-80KU/L，所述海藻糖浓度为20-100g/L。
步骤(1)中，所述的由干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度Chcy，1的计算公式为：Chcy，1＝[(Au-A0)/(As-A0)]×C标准胱硫醚，其中Au为步骤(1)样品吸光度值，As为步骤(1)同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，A0为步骤(1)同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，C标准胱硫醚为标准液中胱硫醚的浓度。
步骤(2)中，所述的同型半胱氨酸总浓度Chcy，2的计算公式为：Chcy，2＝[(ΔAu/min-ΔA0/min)/(ΔAs/min-ΔA0/min)]×(C标准hcy+C标准胱硫醚)，其中A Au/min为步骤(2)样品每分钟吸光度变化值，ΔAs/min为步骤(2)同体积的标准液代替样品所测得的每分钟吸光度变化值，ΔA0/min为步骤(2)同体积的去离子水代替样品所测得的每分钟吸光度变化值，C标准hcy为标准液中同型半胱氨酸(HCY)的浓度，C标准胱硫醚为标准液中胱硫醚的浓度。
为了达到上述目的，本发明还采用以下技术解决方案：一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定试剂，其特征在于：测定试剂由试剂I和试剂II组成，试剂I中的pH8.50-9.00Tris-HCl浓度为30-100mmol/L，含有的胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为10-50KU/L、还原性辅酶I(NADH)浓度为4-6g/L、乳酸脱氢酶(LDH)浓度为30-100KU/L、海藻糖浓度为20-100g/L；试剂II中的pH7.50-7.80Tris-HCl浓度为50-200mmol/L，含有的丝氨酸浓度为2.5-10mmol/L、胱硫醚合成酶(CBS)浓度为30-80KU/L、海藻糖浓度为20-100g/L。
本发明通过构建一种基于胱硫醚合成酶(CBS)-胱硫醚裂解酶(CBL)-乳酸脱氢酶(LDH)偶联、可消除内源性胱硫醚干扰的同型半胱氨酸测定新体系，实现同型半胱氨酸的准确测定。该法在测定同型半胱氨酸之前，血清内源性干扰物质胱硫醚在步骤(1)经胱硫醚裂解酶(CBL)作用后转化为同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)作用下将还原性辅酶I(NADH)转化为氧化性辅酶I(NAD+)，还原性辅酶I(NADH)在340nm有最大吸收，通过监测340nm处吸光度的降低值，可计算出由内源性干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度；在步骤(2)中通过胱硫醚合成酶(CBS)-胱硫醚裂解酶(CBL)-乳酸脱氢酶(LDH)偶联途径测得总同型半胱氨酸(HCY)浓度后，减去由干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度，即为消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸浓度。依据该法构建的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂置2-8℃保存可稳定14个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
本发明的检测方法与美国Teco Diagnostics公司的Homocysteine Reagent(“Teco法”)相比较结果见下表。
具体实施方式
本发明测定原理：第一步，配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、还原性辅酶I(NADH)、乳酸脱氢酶(LDH)、海藻糖的pH8.50-9.00Tris-HCl缓冲液为试剂I，加入待测血清样品。待测血清样品中的内源性干扰物质胱硫醚经胱硫醚裂解酶(CBL)作用后转化为同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的丙酮酸及血清内源性丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)作用下将还原性辅酶I(NADH)转化为氧化性辅酶I(NAD+)，还原性辅酶I(NADH)在340nm有最大吸收，监测340nm处吸光度的降低值，与标准液对照后计算出由干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度Chcy，1；第二步，配制含丝氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7.50-7.80Tris-HCl缓冲液为试剂II，将试剂II按一定比例加入到第一步试剂I和待测血清样品的混合溶液中。血清中的同型半胱氨酸(HCY)和第一步反应中生成的同型半胱氨酸(HCY)在丝氨酸的存在下经胱硫醚合成酶(CBS)作用后转化为胱硫醚，胱硫醚经胱硫醚裂解酶(CBL)作用后转化为同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的同型半胱氨酸以一定的反应速率重新进入酶法循环途径。反应生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)作用下将还原性辅酶I(NADH)转化为氧化性辅酶I(NAD+)，检测340nm的吸光度下降速率，与标准品对照后计算出同型半胱氨酸总浓度Chcy，2；将第二步所测得的同型半胱氨酸总浓度Chcy，2减去第一步所测得的同型半胱氨酸浓度Chcy，1即得血清同型半胱氨酸(HCY)浓度。
样品液：临床血清标本。
标准液：精密称取优级纯胱硫醚、同型半胱氨酸，用去离子水稀释至胱硫醚浓度为15μmol/L、同型半胱氨酸(HCY)浓度为25μmol/L。
样品液中同型半胱氨酸(HCY)的计算公式：待测样品同型半胱氨酸(HCY)含量(μmol/L)＝[(ΔAu/min-ΔA0/min)/(ΔAs/min-ΔA0/min)]×(Chcy+C胱硫醚)-[(Au-A0)/(As-A0)]×C胱硫醚，其中ΔAu/min为反应第二步样品管每分钟吸光度变化值，ΔAs/min为反应第二步同体积的标准液代替样品所测得的每分钟吸光度变化值，ΔA0/min为反应第二步同体积的去离子水代替样品所测得的每分钟吸光度变化值。Au为反应第一步样品管吸光度值，As为反应第一步同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，A0为反应第一步同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，Chcy为标准中同型半胱氨酸(HCY)的浓度，C胱硫醚为标准中胱硫醚的浓度。
实施例1：
配制含胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为50KU/L、还原性辅酶I(NADH)浓度为6g/L、乳酸脱氢酶(LDH)浓度为100KU/L、海藻糖浓度为10％的30mmol/LpH9.00Tris-HCl缓冲液为试剂I；配制含丝氨酸浓度为10mmol/L、胱硫醚合成酶(CBS)浓度为80KU/L、海藻糖浓度为10％的50mmol/L pH7.50Tris-HCl缓冲液为试剂II。将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为奥林巴斯5400全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为16.5μl，试剂I体积为250μl，试剂II体积为25μl，测定主/副波长为340/450nm，试剂I和样本混合后在测定温度反应180秒后分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度A0、As、Au，加入试剂II混匀后在测定温度孵育30秒后分别读取60秒内空白管、标准管、血清管的吸光度的变化速率ΔA0/min、ΔAs/min、ΔAu/min。用本法和HPLC法同时测定了30例血清样品液中同型半胱氨酸(HCY)浓度。下表为本实施例所述方法测定的血清样品中同型半胱氨酸(HCY)浓度的测定值与HPLC法测定的同型半胱氨酸(HCY)浓度的值对照表，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9999，两者显示了极好的相关性。
| HPLC法测定值(μmol/L) | 实施例1测定值(μmol/L) |
| 4.50 | 4.52 |
| 6.05 | 6.11 |
| 7.41 | 7.35 |
| 8.83 | 8.75 |
| 10.01 | 10.14 |
| 11.23 | 11.17 |
| 12.88 | 12.74 |
| 13.49 | 13.56 |
| 14.91 | 14.83 |
| 16.45 | 16.61 |
| 18.12 | 18.19 |
| 21.24 | 21.36 |
| 23.08 | 22.94 |
| 24.57 | 24.51 |
| 26.33 | 26.41 |
| 28.01 | 28.14 |
| 29.31 | 29.42 |
| 30.45 | 30.52 |
| 31.74 | 31.68 |
| 32.67 | 32.74 |
| 35.32 | 35.29 |
| 38.19 | 38.16 |
| 39.47 | 39.58 |
| 41.33 | 41.37 |
| 42.80 | 42.78 |
| 44.15 | 44.23 |
| 46.72 | 46.74 |
| 47.61 | 47.63 |
| 48.02 | 48.13 |
| 49.55 | 49.61 |
实施例2：
配制含胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为30KU/L、还原性辅酶I(NADH)浓度为5g/L、乳酸脱氢酶(LDH)浓度为65KU/L、海藻糖浓度为7％的65mmol/L pH8.75Tris-HCl缓冲液为试剂I；配制含丝氨酸浓度为6.25mmol/L、胱硫醚合成酶(CBS)浓度为55KU/L、海藻糖浓度为6％的125mmol/L pH7.65Tris-HCl缓冲液为试剂II。将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为16.5μl，试剂I体积为250μl，试剂II体积为25μl，测定主/副波长为340/450nm，试剂I和样本混合后在测定温度反应300秒后分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度A0、As、Au，加入试剂II混匀后在测定温度孵育60秒后分别读取180秒内空白管、标准管、血清管的吸光度的变化速率ΔA0/min、ΔAs/min、ΔAu/min。
实施例3：
配制含胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为10KU/L、还原性辅酶I(NADH)浓度为4g/L、乳酸脱氢酶(LDH)浓度为30KU/L、海藻糖浓度为2％的100mmol/LpH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂I；配制含丝氨酸浓度为2.5mmol/L、胱硫醚合成酶(CBS)浓度为30KU/L、海藻糖浓度为2％的200mmol/L pH7.80Tris-HCl缓冲液为试剂II。将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV2201紫外可见分光光度计，反应温度为37℃，样本体积为132μl，试剂I体积为2000μl，试剂II体积为200μl，测定主波长为340nm，试剂I和样本混合后在测定温度反应600秒后分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度A0、As、Au，加入试剂II混匀后在测定温度孵育180秒后分别读取300秒内空白管、标准管、血清管的吸光度的变化速率ΔA0/min、ΔAs/min、ΔAu/min。
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理和其应用，但本发明绝不局限于上述例举的应用范围。
Claims (6)
1.一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、还原性辅酶I(NADH)、乳酸脱氢酶(LDH)、海藻糖的pH8.50-9.00Tris-HCl缓冲液为试剂I，按一定比例加入待测血清样品，监测340nm处吸光度的降低值，与标准液对照后计算出由干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度Chcy，1；
(2)配制含丝氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7.50-7.80Tris-HCl缓冲液为试剂II，将试剂II按一定比例加入到第(1)步试剂I和待测血清样品的混合溶液中，监测340nm处的吸光度下降速率，与标准液对照后计算出同型半胱氨酸总浓度Chcy，2；
(3)将第(2)步所测得的同型半胱氨酸总浓度Chcy，2减去第(1)步所测得的同型半胱氨酸浓度Chcy，1得血清同型半胱氨酸(HCY)浓度C血清hcy。
2.根据权利要求1所述的一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法，其特征在于：步骤(1)中的反应条件为在37℃环境中反应180-600秒；步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应90-480秒。
3.根据权利要求2所述的一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述待测血清样品与所述试剂I的体积比为V血清∶V试剂I＝16.5∶250；
步骤(2)中，所述待测血清样品与所述试剂I、试剂II的体积比为V血清∶V试剂I∶V 试剂II＝16.5∶250∶50。
4.根据权利要求3所述的一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述试剂I中各物质最适浓度为：pH8.50-9.00Tris-HCl浓度为30-100mmol/L，所述胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为10-50KU/L，所述还原性辅酶I(NADH)浓度为4-6g/L，所述乳酸脱氢酶(LDH)浓度为30-100KU/L，所述海藻糖浓度为20-100g/L
步骤(2)中，所述试剂II中各物质最适浓度为：pH7.50-7.80Tris-HCl浓度为50-200mmol/L，所述丝氨酸浓度为2.5-10mmol/L，所述胱硫醚合成酶(CBS)浓度为30-80KU/L，所述海藻糖浓度为20-100g/L。
5.根据权利要求4所述的一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的由干扰物质胱硫醚转化生成的同型半胱氨酸浓度Chcy，1的计算公式为：Chcy，1＝[(Au-A0)/(As-A0)]×C标准胱硫醚，其中Au为步骤(1)样品吸光度值，As为步骤(1)同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，A0为步骤(1)同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，C标准胱硫醚为标准液中胱硫醚的浓度；
步骤(2)中，所述的同型半胱氨酸总浓度Chcy，2的计算公式为：Chcy，2＝[(ΔAu/min-ΔA0/min)/(ΔAs/min-ΔA0/min)]×(C标准hcy+C标准胱硫醚)。其中ΔAu/min为步骤(2)样品每分钟吸光度变化值，ΔAs/min为步骤(2)同体积的标准液代替样品所测得的每分钟吸光度变化值，ΔA0/min为步骤(2)同体积的去离子水代替样品所测得的每分钟吸光度变化值，C标准hcy为标准液中同型半胱氨酸(HCY)的浓度，C标准胱硫醚为标准液中胱硫醚的浓度。
6.一种消除内源性胱硫醚干扰的血清同型半胱氨酸测定试剂，其特征在于：测定试剂由试剂I和试剂II组成，试剂I中的pH8.50-9.00Tris-HCl浓度为30-100mmol/L，含有的胱硫醚裂解酶(CBL)浓度为10-50KU/L、还原性辅酶I(NADH)浓度为4-6g/L、乳酸脱氢酶(LDH)浓度为30-100KU/L、海藻糖浓度为20-100g/L；试剂II中的pH7.50-7.80Tris-HCl浓度为50-200mmol/L，含有的丝氨酸浓度为2.5-10mmol/L、胱硫醚合成酶(CBS)浓度为30-80KU/L、海藻糖浓度为20-100g/L。
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