JP2011177158A - タウリンの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検体に、タウリンジオキシゲナーゼを作用させ、生じた生成物を定量することを含む、前記試料に含有されるタウリンの測定方法。タウリンジオキシゲナーゼを用いることを特徴とする酵素センサー。以下の(1)〜(3)の試薬を含むタウリンの測定用キット。
(1)タウリンジオキシゲナーゼ
(2)2価鉄、およびα−ケトグルタル酸
(3)タウリンジオキシゲナーゼの反応により生成する生成物の検出用試薬
【選択図】なし
Description
[1]
被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加すること、およびタウリンジオキシゲナーゼの作用によりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、タウリンの分析方法。
[2]
前記生成物が亜硫酸である[1]に記載の方法。
[3]
亜硫酸をイールマン試薬により検出する[2]に記載の方法。
[4]
亜硫酸を、亜硫酸オキシダーゼを用いたバイオセンサーにより測定する[2]記載の方法。
[5]
タウリンジオキシゲナーゼが大腸菌由来の酵素である[1]〜[4]いずれかに記載の方法。
[6]
前記生成物が2-アミノアセトアルデヒドである[1]に記載の方法。
[7]
2-アミノアセトアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼおよびNADHにより検出する[6]に記載の方法。
[8]
被検体がドリンク剤、魚介類の熱水抽出物、または尿である[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
以下の試薬を含むタウリン定量用キット。
(1)タウリンジオキシゲナーゼ
(2)2価鉄、αケトグルタル酸
(3)タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物検出用試薬
[10]
生成物検出用試薬がイールマン試薬である[9]に記載の定量用キット。
[11]
反応用緩衝液をさらに含む[9]および[10]に記載の定量用キット。
[12]
タウリンジオキシゲナーゼを検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることを特徴とするタウリン定量に用いるための酵素センサー。
[13]
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化したものである[12]に記載の酵素センサー。
[14]
タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素が亜硫酸オキシダーゼである[12]および[13]に記載のセンサー。
本発明のタウリンの分析方法は、被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼを添加して所定時間経過後に、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、被検体中のタウリン含有量を求める方法である。
(1)タウリンジオキシゲナーゼ
(2)2価鉄、およびαケトグルタル酸
(3)タウリンジオキシゲナーゼによる生成物の検出用試薬
本発明の酵素センサーは、酵素センサーを構成する検出用電極にタウリンジオキシゲナーゼを直接または間接的に固定化したものであり、タウリンの定量に用いるためのものである。本発明の酵素センサーは、好ましくは、タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物を直接または間接的に定量的に検出できるものであることが好ましく、例えば、タウリンジオキシゲナーゼに加えて、亜硫酸オキシダーゼなどのタウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を、上記検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることもできる。加えて、本発明の酵素センサーは、上記酵素以外に、電子伝達タンパク質やペルオキシダーゼなど検出に寄与するタンパク質を、上記検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサーで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。
大腸菌K12株よりゲノムDNAを調製し、データベース上にある同株のゲノムシークエンス(AP009048)を元に設計した下記のプライマーを用いてPCRによりタウリンジオキシゲナーゼ遺伝子(TauD)を増幅した。増幅産物をpT7Blue vector を用いてJM109を宿主としてサブクローニングを行った。さらに、サブクローニングされたpT7Blue-TauDよりNdeI 及びBamHIにより当該遺伝子を切り出し、同様の制限酵素で処理したpET15bとライゲーションし、BL21(DE3)に導入した。このプラスミドは、N末端にヒスチジンが導入されるため、Bio-Rad Ni-IMACを用いて、精製したところSDS-PAGE的に単一となり、20U/mLの活性を有する酵素液を調製した。
K12TauD_fNdeI :gaagtcatatgagtgaacgtctgagcattac(配列番号1)
K12TauD_rBamHI:atatatggatccttaccccgcccgataaaacg(配列番号2)
(1)タウリンジオキシゲナーゼ反応液(10回分)
(1)反応停止液
0.5 M EDTA-Na
(2)発色試薬(イールマン試薬)
5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)10 mg
50 mM リン酸カリウム緩衝液 10 mLに溶解
ロシュ社製コハク酸定量キット、「F-kit コハク酸」とタウリンジオキシゲナーゼを組み合わせた方法を検討した。0.05 mLのタウリン溶液に対し、0.05 mLの(1)のタウリンジオキシゲナーゼ反応液を加え、さらに上記キットに含まれる試薬より調製した下記の3Xコハク酸定量酵素溶液0.05 mLを加えたのち、30℃で反応を行いマイクロプレートリーダーによりNADHの消費による492 nmの吸収の減少を測定した。図1に示す通り、NADHの減少は、タウリン非存在下であっても進行した。このため、本反応によるタウリン定量は、困難であることが分かった。
試料溶液 100μLを96ウェルマイクロプレートに添加し、上記タウリンジオキシゲナーゼ反応試薬、100μLを加えた後、30℃で15分間静置した。反応停止液 20μLを加え反応停止後、発色試薬20μLを加え、10分間30℃で静置したのち、TECAN Infinite M200を用いて、415 nmの吸光度を測定した。
前述のタウリン定量法2に則り0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 mMのタウリン水溶液を標準試料として用いて検量線を作成した。作成した検量線を図2に示す。図2で明らかなように本定量法では、0〜0.5 mMの範囲で、直線的な吸光度の増加がみられた。得られた直線の関係は、y = 2.5022x +0.1099(R2 = 0.9961)[ここでのyは415 nmの吸光度、xは、タウリン濃度、Rは、相関係数を示す]であって正確なタウリン定量が可能であることが分かった。
実試料の前処理及び定量
実試料として、大正製薬製の栄養ドリンク(3製品)、アマエビ及びアオリイカの熱水抽出液、ヒト尿を用いた。
アマエビ及びアオリイカは、5gの細切れにした刺身を試験管にとり、30mLの脱イオン水を加えたのち、20分間煮沸した。煮沸後の試料溶液を4枚重ねのガーゼでろ過し、ろ液を回収後、残渣を元の試験管に戻し再度30mLの脱イオン水を加え煮沸を繰り返した。合計3度抽出操作により得られた抽出液を合わせて、100mLのメスフラスコに定量的に移し、脱イオン水を加えて定容した。これを熱水抽出液とし-20℃で保存した。
ヒト尿は、発明者のものを使用し,採取後は-80℃にて保管した。
これらは、解凍後測定前にmicrocon YM-10により除タンパク処理を行った。
実試料の定量は、上記と同様の方法で検量線を逐次作製し行った。栄養ドリンクは2000倍、アオリイカ及びエビの抽出液とヒト尿では、10倍に脱イオン水で希釈してから測定を行った。
タウリン定量の比較対象として、超高速アミノ酸分析システム(UPLC)を用いたプレカラム誘導体化法による定量を行った。前述の前処理済み試料0.01 mLをWaters AccQ-Tag Ultra derivatization kitを用いて誘導化し、超高速アミノ酸分析システム[Waters Acquity ultra performance LC (UPLC)]を用いて分析を行った。誘導体化条件を以下に示す。
トータルリカバリーバイアルに試料10μLに対し70μLのホウ酸塩緩衝液を加え混和後20μLのAccQ-Tag Ultra試薬を加え攪拌後室温で1分静置したのち、55℃で10分間加温し誘導体化試料とした。
注入量 : 1μL
検出 : 蛍光検出器
移動相 A : 10% AccQ-Tag Ultra 溶離濃縮液A
B : AccQ-Tag Ultra 溶離濃縮液B(原液)
分析温度 : 60℃
メソッド : FLR_Cell_Cult_Seq07
栄養ドリンク剤の製品表示値およびアマエビ、アオリイカ及びヒト尿のUPLCによる各測定値と酵素法による測定値を表1示す。表1が示すとおり、いずれの試料においても本酵素法により得られる値は、製品記載値及びUPLCによる測定値と10%以下の誤差であった。また、これらの試料に関する限り、チオール化合物に由来するような大幅な測定値の上昇は見られなかった。本測定においては、除タンパク質以外の前処理を必要とせず、タウリンジオキシゲナーゼ反応開始から測定まで40〜60分程度の短時間で1〜96サンプルの測定が可能であることから、本法は、簡便なタウリン定量法として実用的であることが確認された。
アオリイカ熱水抽出液の希釈液(タウリン濃度0.18 mM)に対し、添加濃度0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mMとなるようにタウリン溶液を添加した試料に対し、上述と同様にタウリンジオキシゲナーゼを用いてタウリンの定量を行った結果を図3に示す。測定値は、タウリンの添加に伴い、直線的な増加(R2=0.9984)を示し、添加量1 mM毎の測定値の増加は、1.06 mMと良好な値を示した。希釈熱水抽出液の測定値と各添加濃度の和に対するそれぞれの測定値の回収率は、99〜103%であり、正確な測定が可能であることが確認された。
Claims (15)
- 被検体を含有する試料溶液に、タウリンジオキシゲナーゼ、二価鉄およびαケトグルタル酸を添加すること、およびタウリンジオキシゲナーゼの作用によりタウリンから生じる生成物を定量することを含む、タウリンの分析方法。
- 前記生成物が亜硫酸である請求項1に記載の方法。
- 亜硫酸をイールマン試薬により検出する請求項2に記載の方法。
- 亜硫酸を、亜硫酸オキシダーゼを用いたバイオセンサーにより測定する請求項2記載の方法。
- タウリンジオキシゲナーゼが大腸菌由来の酵素である請求項1〜4いずれかに記載の方法。
- 前記生成物が2-アミノアセトアルデヒドである請求項1に記載の方法。
- 2-アミノアセトアルデヒドをアルコールデヒドロゲナーゼおよびNADHにより検出する請求項6に記載の方法。
- 被検体がドリンク剤、魚介類の熱水抽出物、または尿である請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 以下の(1)〜(3)の試薬を含むタウリン定量用キット。
(1)タウリンジオキシゲナーゼ
(2)2価鉄、およびαケトグルタル酸
(3)タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成する生成物検出用試薬 - 生成物検出用試薬がイールマン試薬である請求項9に記載の定量用キット。
- 生成物検出用試薬がアルコールデヒドロゲナーゼおよびNADHである請求項9に記載の定量用キット。
- 反応用緩衝液をさらに含む請求項9〜11のいずれかに記載の定量用キット。
- タウリンジオキシゲナーゼを検出用電極に直接または間接的に固定化したものであることを特徴とするタウリン定量に用いるための酵素センサー。
- タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素を検出用電極に直接または間接的に固定化したものである請求項13に記載の酵素センサー。
- タウリンジオキシゲナーゼによりタウリンから生成される生成物を検出用電極で検出可能な物質に変換する酵素が亜硫酸オキシダーゼである請求項13および14に記載のセンサー。
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