CN107271691A - 同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法涉及生化检测领域。其目的是为了提供一种稳定性高、准确度和精密度高的同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法。本发明同型半胱氨酸检测试剂盒包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括：capso缓冲液；乳酸脱氢酶(LDH)；L‑丝氨酸；还原性辅酶Thio‑NADH；三(2‑羧乙基)膦；巯基乙醇；烷基酚聚氧乙烯醚系列；EDTA；聚乙二醇300；抗坏血酸氧化酶；复合稳定剂；proclin系列防腐剂；所述试剂2包括：capso缓冲液；胱硫醚‑β‑合成酶、蛋氨酸合成酶；胱硫醚‑β‑裂解酶、蛋氨酸‑γ裂解酶；表面活性剂：十二烷基苯磺酸钠。本发明添加的多种混合酶、蛋氨酸‑γ裂解酶可以提高本发明试剂盒关于同型半胱氨酸检测的准确性。

Description

同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生化检测领域，特别是涉及一种借助于测定材料的化学物理性质来测定材料的试剂盒。

背景技术

同型半胱氨酸(又称高半胱氨酸，homocysteine,Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的中间产物。同型半胱氨酸在体内的分解代谢，受两方面因素影响最大。一是与先天遗传有关的某些生物酶的缺乏，另一个就是体内叶酸、维生素B6、维生素B12等营养元素的缺乏。这两种缺乏都会影响同型半胱氨酸转化为其他物质，导致高同型半胱氨酸血症。Hcy的测定，对心血管疾病、尿毒症、动脉粥样硬化、糖尿病、老年痴呆症等疾病的判定中，有重要的临床意义。

血浆中的同型半胱氨酸约70％与白蛋白结合，为结合型。其余的游离型则主要以二硫同型半胱氨酸和以二硫键结合的同型半胱氨酸-半胱氨酸化合物形式存在，只有少量以还原型同型半胱氨酸存在于血浆中。我们通常所指的是总的同型半胱氨酸浓度。

影响同型半胱氨酸水平最主要的因素莫过于遗传于食物营养缺乏。遗传因素主要包括N5甲基四氢叶酸转甲基酶及胱硫醚-β-合成酶的基因发生突变，引起酶的活性降低，从而导致高同型半胱氨酸血症。现在已经证明N5甲基四氢叶酸转甲基酶的缺陷，在体内叶酸缺乏的情况下，可以引起同型半胱氨酸浓度的明显升高。而根据Mudd等的研究，由遗传缺陷引起的胱硫醚-β-合成酶的活性降低，可导致血浆中同型半胱氨酸的浓度超过正常值的十倍左右。

对近1200名老人的研究表明，体内同型半胱氨酸的水平与饮食有着密切的关系，血浆中维生素B6、B12和叶酸的浓度越低，其同型半胱氨酸的浓度越高。由于动物蛋白中蛋氨酸的含量比植物蛋白约高三倍左右，可以产生较多的同型半胱氨酸，因此可对人体的动脉组织造成损伤。

其它因素包括性别、年龄、肾功能的损害、以及服用影响叶酸和B族维生素的药物，都可影响同型半胱氨酸的水平。尤其是肾功的损害，会严重影响那些含硫氨基酸的排出，因为肾小管内皮细胞的胱硫醚-β-合成酶对同型半胱氨酸的转化作用，被认为血液中的非蛋白结合型同型半胱氨酸很重要的代谢途径。

通常认为成人空腹血浆总Hcy水平正常值为4～12μmol/L，理想值为<10μmol/L，高于15μmol/L则被认为是高同型半胱氨酸败血症；老年人(≥60岁)空腹血浆总Hcy水平正常值为15～20μmol/L，高于20μmol/L被认为是高同型半胱氨酸败血症。

目前，实验室常用的Hcy测定方法有色谱法、酶联免疫法及荧光偏振免疫法。色谱法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆Hcy浓度的首选方法，但因色谱法(HPLC及GC-MS)需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用，而酶联免疫测定法可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛欢迎。

酶联免疫法检测同型半胱氨酸的原理是基于小分子捕获技术(SMT)的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。Hcy被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。

酶免疫检测法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法，由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的同型半胱氨酸检测试剂中由于存在多种酶，会使该试剂的稳定性受到影响，不利于试剂的长期保存，从而造成浪费的不良后果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种稳定性高、准确度和精密度高的同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法。

本发明涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法，所述同型半胱氨酸检测试剂盒包括试剂1和试剂2；

所述试剂1包括：

所述试剂2包括：

所述胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

优选地，所述复合稳定剂包括吐温80 10～13g/L，谷氨酸20～30g/L，谷胱甘肽1～3g/L，海藻糖50～60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2～6g/L，卵磷脂3～6g/L，缓冲液100～120mmol/L；其为申请号为201610166107.2的多种抗体的复合稳定剂及其使用方法中的复合稳定剂。

优选地，所述试剂1包括：

所述试剂2包括：

所述胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

本发明试剂盒采用胱硫醚循环酶法检测血清样本中同型半胱氨酸的含量。样本中原先存在的氧化型HCY被还原成游离型HCY，其与丝氨酸(Serine)被胱硫醚β-合成酶(CBS)催化形成L-胱硫醚，其在胱硫醚β-分解酶(CBL)作用下生成游离型HCY、丙酮酸、氨，新生成的HCY不断加入该循环反应，产生的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下，将NADH转化为NAD⁺，样本中的HCY浓度与NADH的变化呈正比。反应方程式如图1所示。

本发明还涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒的使用方法，

该试剂盒的测定方法为速率法；

(1)将240份试剂1和10份待测样品，37℃孵育后得到反应液1；

(2)然后加入60份试剂2混合均匀，37℃孵育后得到反应液2；

(3)延迟时间为150s，测定反应液2的吸光度A1，5min后再次测反应液2的吸光度A2，测定主波长为340nm、副波长为405nm；

(4)用步骤(1)-(3)的操作对同型半胱氨酸标准液的吸光度进行测定，分别得到吸光度A3和A4；

(5)用吸光度差值进行计算，根据式1计算血清总同型半胱氨酸浓度；

式1：

同型半胱氨酸浓度＝△A样品/ΔA标准液×标准液浓度；

△A样品＝|A2-A1|；

ΔA标准液＝|A4-A3|；

上述份数均为体积份数。

本发明同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法与现有技术不同之处在于：

1、本发明试剂盒采用的缓冲液capso为Good's系列，是一种两性离子缓冲液，其主要优点是不参与和不干扰生物化学反映过程，且对酶化反应等无抑制作用。试剂1中加入的还原剂TCEP(三(2-羧乙基)膦)和巯基乙醇共同作用于氧化型HCY，将其充分还原；加入的抗坏血酸氧化酶可以减少样本中的维生素C的干扰，加入的还原性辅酶Thio-NADH，作为反应物，对于本试剂中的关键酶具有较好的亲和性，促进该反应体系，优于NADH，提高检测的准确性。

2、本发明试剂盒的试剂2中添加的多种混合酶(CBS、蛋氨酸合成酶、胱硫醚-β-裂解酶(CBL)和蛋氨酸-γ裂解酶可以提高本发明试剂盒关于同型半胱氨酸检测的准确性，同时加入的稳定剂和复合稳定剂能够发挥协同作用，提高酶试剂的稳定性。

附图说明

图1为本发明同型半胱氨酸检测试剂盒检测原理的反应方程式；

图2为本发明同型半胱氨酸检测试剂盒与对照试剂盒的相关性测试结果图；

图3为本发明同型半胱氨酸检测试剂盒校准曲线；

图4为本发明同型半胱氨酸检测试剂盒校准反应曲线图。

具体实施方式

通过以下实施例和验证试验对本发明的同型半胱氨酸检测试剂盒及其使用方法作进一步的说明。

实施例1

本实施例的同型半胱氨酸检测试剂盒原料及配比如下：

试剂1包括：

试剂2包括：

其中，胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

实施例2

本实施例的同型半胱氨酸检测试剂盒原料及配比如下：

试剂1包括：

试剂2包括：

其中，胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

实施例3

本实施例的同型半胱氨酸检测试剂盒原料及配比如下：

试剂1包括：

试剂2包括：

本发明同型半胱氨酸检测试剂盒校准曲线如图3所示；本发明同型半胱氨酸检测试剂盒校准反应曲线如图4所示。

其中，胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

验证试验

以上实施例中制得的产品使用方法如下：

该试剂盒的测定方法为速率法；

(1)将240份试剂1和10份待测样品，37℃孵育后得到反应液1；

(2)然后加入60份试剂2混合均匀，37℃孵育后得到反应液2；

(3)延迟时间为150s，测定反应液2的吸光度A1，5min后再次测反应液2的吸光度A2，测定主波长为340nm、副波长为405nm；

(4)用步骤(1)-(3)的操作对同型半胱氨酸标准液的吸光度进行测定，分别得到吸光度A3和A4；

(5)用吸光度差值进行计算，根据式1计算血清总同型半胱氨酸浓度；

式1：

同型半胱氨酸浓度＝△A样品/ΔA标准液×标准液浓度；

△A样品＝|A2-A1|；

ΔA标准液＝|A4-A3|；

上述份数均为体积份数。

对上述实施例1～3中的产品进行测试，并与其他公司同类型产品进行对比，其中对照试剂盒为一国内市售同型半胱氨酸检测试剂盒，其主要成分为：试剂1：乳酸脱氢酶(LDH)、丝氨酸(SER)、NADH。试剂2：胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚β-分解酶(CBL)、稳定剂。

测试1

重复性测试：用贝克曼AU480全自动生化分析仪测定血清样本，重复测定10次，与对照试剂盒相比较，结果如下表。

表1重复性测试结果(μmol/L)

由结果可以看出：本试剂盒测定的变异系数CV％＝0.98％，小于10％，符合本试剂技术要求，且小于对照试剂盒的1.56％，表明本试剂盒的重复性更好。

测试2

相关性测试：使用贝克曼AU480生化分析仪进行测定，以本试剂盒与对照试剂盒为材料，校准后测定40例临床样本的HCY的含量，结果可以看出线性回归方程为y＝1.0054x+0.077，R²＝0.9941，r＝0.9997，表明本试剂盒测试结果与对照试剂所得结果相关性良好(如图2所示)。

测试3

准确度测试：以本试剂盒为材料，校准后采用高值、中值、低值3个质控水平进行测定，重复3次，结果如表2。

表2准确度测试结果

由结果可以看出：本试剂盒测试结果的相对偏差都小于±10％，且测试结果接近靶值，说明本试剂盒准确度较好。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：所述同型半胱氨酸检测试剂盒包括试剂1和试剂2；

所述试剂1包括：

所述试剂2包括：

所述胱硫醚-β-合成酶和蛋氨酸合成酶的酶的比活力相同，胱硫醚-β-裂解酶和蛋氨酸-γ裂解酶的酶的比活力相同。

2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：所述所述复合稳定剂包括吐温80 10～13g/L，谷氨酸20～30g/L，谷胱甘肽1～3g/L，海藻糖50～60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2～6g/L，卵磷脂3～6g/L，缓冲液100～120mmol/L。

3.根据权利要求2或3所述的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：

所述试剂1包括：

所述试剂2包括：

4.一种同型半胱氨酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)将240份试剂1和10份待测样品，37℃孵育后得到反应液1；

(2)然后加入60份试剂2混合均匀，37℃孵育后得到反应液2；

(3)延迟时间为150s，测定反应液2的吸光度A1，5min后再次测反应液2的吸光度A2，测定主波长为340nm、副波长为405nm；

(4)用步骤(1)-(3)的操作对同型半胱氨酸标准液的吸光度进行测定，分别得到吸光度A3和A4；

(5)用吸光度差值进行计算，根据式1计算血清总同型半胱氨酸浓度；

式1：

同型半胱氨酸浓度＝△A样品/ΔA标准液×标准液浓度；

△A样品＝|A2-A1|；

ΔA标准液＝|A4-A3|；

上述份数均为体积份数。