CN107860729B

CN107860729B - 一种用于测定谷草转氨酶的稳定试剂

Info

Publication number: CN107860729B
Application number: CN201711088845.0A
Authority: CN
Inventors: 姜敏
Original assignee: Beijing Beijian Xinchuangyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Beijian Xinchuangyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107860729A

Abstract

本发明提供了一种用于测定谷草转氨酶的稳定试剂。本公开的试剂是双试剂，包含TRIS、NADH、LDH、MDH、EDTA、TritonX‑100、BSA、Proclin。本公开的试剂有效改善NADH指示系统体外诊断试剂的热稳定性、机载稳定性、运输稳定性，可有效延长试剂盒的保存时间。

Description

一种用于测定谷草转氨酶的稳定试剂

技术领域

本申请涉及生物化学和临床检验领域。更具体而言，本申请涉及一种用于测定谷草转氨酶的试剂。

背景技术

肝内的谷草转氨酶(AST)有2种同工酶，分别存在于肝细胞的线粒体(mAST)和胞浆内(sAST)。在肝细胞轻度病变时，仅sAST释放入血；而当病变严重时，mAST也会相继释放入血。故血清AST活性随肝细胞损害的程度增高。

在HBV感染的肝炎和肝病时，AST随ALT较小幅度升高，或虽幅度较大而时间短暂，可能主要是sAST，临床意义与ALT相同；AST增高超过ALT，虽幅度并不太大而持续时间很长，可能主要是mAST，提示病变的慢性化和进展性。

目前，体外测定AST的方法主要采用连续监测法，该方法是国际临床化学和实验室医学联盟IFCC的推荐方法。具体测定过程如下：

谷草转氨酶催化L-天冬氨酸的氨基转移与MDH催化的反应偶联，使NADH氧化成NAD+。NADH在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与样本中的AST的活性成正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出AST活性(于洋，中国卫生标准管理，2014年)。

CN106282312A公开了一种用于同时检测谷草转氨酶和谷丙转氨酶的干化学二联试剂条。在试剂条的反应膜上吸附有相应的反应物，当在进样孔加入被检测物后，通过表面扩散膜，使得被检测物均匀分散到两片试纸垫上，最终到达底层反应膜进行反应。该检测方法采用了干化学分析技术。干化学是相对于湿化学技术而言的，是指将液体检测样品直接加到为不同项目特定生产的商业化的干燥试剂条上，以被测样品的水分作为溶剂引起特定的化学反应，从而进行化学分析的方法。干化学以酶法为基础的一类分析方法，又有干试剂化学或固相化学之称。干化学分析技术优点在于：无须贮备任何其它试剂或配制任何溶液；产品是干燥的，因此比湿化学的试剂更易于保存。在目前临床机构中，检测样本量非常巨大。因而，检测都是在大型设备比如生化分析仪上进行的。然而，上述干化学分析试纸条不兼容生化分析仪。因此，本领域中仍然需要一种AST的稳定液体检测试剂。

CN106644976A公开了一种天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒。试剂盒包括试剂1和试剂2：其中试剂1的组分包括：Tris-HCl缓冲液、L-天门冬氨酸、还原型辅酶、苹果酸脱氢酶、酶保护剂、稳定剂、防腐剂；试剂2的组分包括：Tris-HCl缓冲液、α-酮戊二酸、稳定剂、防腐剂。其中，酶保护剂选自牛血清白蛋白、甘油、糖类中的一种或多种，其用量为0.5％-1.5％BSA、10％-15％甘油；糖类可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种，其用量为5g/L-10g/L。

对于诊断试剂的稳定性研究，本领域常采用加速稳定性实验来预测产品的失效期(用于评价货架稳定性，有时也被称作长期稳定性或者有效期)。这样的方法优点在于研究周期短(通常数周即可)，不用真正地将试剂存放1年、2年、甚至更长的时间。但是，加速稳定性的理论基础是阿伦尼乌斯公式(Arrhenius equation)。为了确保预测的准确性，要想适用该公式，则对试剂有着较多的要求。这是一种理想状态下的预测。然而，生化试剂的成分复杂、种类繁多，并不是任何试剂都能完美地适用加速稳定性实验来预测其真正效期。

除此外，试剂的稳定性不应当狭义地理解为货架稳定性(长期稳定性)。这是因为，试剂在实际操作使用中，并不是单纯地静置在环境条件恒定的库房当中(恒定的温湿度、避免光照直射、无震动)，而是可能暴露在变化的环境中。例如，在运输过程中(搬运、颠簸)，会接触到机械力的作用，也会遇到温度上的变化(尽管可以采用冷链运输，也无法避免温湿度时刻恒定)。再比如，在临床机构中，样本的检测都是在大型设备(生化分析仪)上进行。这种操作方式允许多个样本(从数十个至上百个样本)依次或同时检测。那么，试剂将会被从其稳定的储存环境中脱离出来，并且打开包装上机待用。这个过程同样无法避免温湿度的变化，并且样本开盖后接触空气，面临着氧化的因素。因此，这种情况下，加速稳定性实验无法评价其它方面的稳定性(ISO标准23640-2011，In vitro diagnostic medical devices-Evaluation of stability of in vitro diagnostic reagents)。

现在市面上多采用双试剂的酶偶联的连续检测方法检测血清AST，由于试剂中酶和NADH的存在，使得试剂在运输过程中、以及在打开瓶盖上机操作时不稳定，这为检测血清AST带来困难。

鉴于上述需求，本领域仍然需要一种稳定性强的双试剂血液谷草转氨酶检测试剂。

发明内容

根据本申请的一些实施方式，提供了一种用于测定样本中谷草转氨酶的试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，第二试剂包含：

TRIS，pH 6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L。

在一些实施方式中，本申请的试剂盒用于检测样本中谷草转氨酶的含量。在一些实施方式中，样本选自以下的任一项：血清、血浆、尿液、全血。

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，第一试剂包含：

在一些实施方式中，本申请的试剂盒还包含质控品和/或校准品。

在一些具体的实施方式中，质控品可以是自行配制的，也可以是市售产品；例如朗道生化多项质控品。

在一些具体的实施方式中，校准品可以是自行配制的，也可以是市售产品；例如朗道生化多项校准品。

根据本申请的一些实施方式，还提供了一种制备谷草转氨酶检测试剂盒的方法，包括：

步骤1)提供第一试剂，所述第一试剂包含：

步骤2)提供第二试剂，所述第二试剂包含：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L；

步骤3)将所述第一试剂和所述第二试剂组装成试剂盒；

步骤1)和步骤2)顺序可互换。

在一些其它实施方式中，本申请的制备方法还包括并入选自以下任一项的步骤：质控品、校准品、使用说明书、或其组合。

在一些实施方式中，还提供了一种制备谷草转氨酶检测试剂盒的方法，包括以下步骤：

步骤1)提供第一试剂：

-用100ml烧杯称量TritonX-100，加水在电磁炉上加热溶解后，放在室温(18-40摄氏度)下，冷却至室温备用；

-在1L烧杯中加入800ml的水，称取TRIS、EDTA放入水中，搅拌溶解，用4mol/L的HCL调节pH值至8.9±0.05，依次量取Proclin、BSA溶于以上溶液，搅拌溶解，加入TritonX-100溶液搅拌均匀；

-称量LDH、MDH、NADH加入到上述溶液中，缓慢搅拌至溶解，并定容至1L，混匀为第一试剂。

步骤2)提供第二试剂：

-1L烧杯中加入800ml的水，称取TRIS、L-天门冬氨酸、α-酮戊二酸放入水中，搅拌溶解，用4mol/L的HCL调节pH值至6.5±0.05，并定容至1L，混匀为第二试剂。

根据本申请的一些实施方式，还提供了一种用于提高谷草转氨酶检测试剂的稳定性的方法，包括步骤：

步骤1)按照以下成分，制备第一试剂：

步骤2)向步骤1)的所述第一试剂中加入0.1g/L至5g/L TritonX-100、0.5g/L至5g/L BSA以及0.5ml/L至1ml/L的Proclin；

任选地，步骤3)按照以下成分，制备第二试剂：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L；

所述步骤3)在步骤1)之前或步骤2)之后。

在一些实施方式中，所述的Proclin是PC300或PC950。

附图说明

图1：加速稳定性实验中，试剂的空白吸光度。

图2：加速稳定性实验中，高值样本测量结果。

图3：长期稳定性实验，试剂的空白吸光度结果。

图4：机载稳定性实验，试剂的空白吸光度结果。

具体实施方式

实施例1：对比试剂盒的配制

第一试剂R1：

第二试剂R2：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L

实施例2：测试试剂盒的配制

第二试剂R2的配制方法同实施例1；第一试剂R1的配制方法参见表1。

表1.不同测试试剂盒的R1试剂组成

测试例

测试例1.加速稳定性(也作热稳定性)

1.东芝-40全自动生化分析仪设置参数：

2.试剂空白吸光度：参见图1、表2。

3.高值样本：参见图2、表3。

4.结果分析：各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的试剂效果最好，空白吸光度较对照试剂盒好很多，变化幅度最小，最稳定。线性也是变化最小的，下降在1％范围内。

表2.空白吸光度

表3.线性高值

测试例2.长期稳定性(也作货架稳定性)

1.测试方法：试剂原包装保存于2-8℃条件下。每隔一个月检测一次，共6个月。

2.试剂空白吸光度：参加图3和表4。

3.结果分析：各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11试剂盒的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

表4.长期稳定性6个月的检测结果

测试例3.运输稳定性

1.运输稳定性的测试方法：试剂在夏季和冬季分别将试剂盒物流快递至最冷和最热的地区，物流返回后与2-8℃条件下保存的试剂进行对照测定。

2.试剂空白吸光度如表5所示。

表5.运输稳定性

各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

测试例4.机载稳定性

1.测试方法：试剂在全自动生化分析以上检测合格后，机器连续运转，试剂敞口放置在仪器中，前一个月每半个月检测一次，后两个月每个月检测一次，检测至90天。

2.结果见图4和表6。各组试剂的空白吸光度差异显著。实例11的效果最好，变化幅度最小，最稳定。

表6.机载稳定性

Claims

1.一种用于测定样本中谷草转氨酶的试剂盒，其包含：

第一试剂、和第二试剂；

第一试剂由以下组成：

第二试剂由以下组成：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L。

2.根据权利要求1所述的用于测定样本中谷草转氨酶的试剂盒，其中所述样本选自以下任一项：血清、血浆、尿液、全血。

3.根据权利要求1所述的用于测定样本中谷草转氨酶的试剂盒，其还包含质控品和/或校准品。

4.一种制备谷草转氨酶检测试剂盒的方法，包括步骤：

1)按照以下组成提供第一试剂，其中所述第一试剂由以下组成：

2)按照以下组成提供第二试剂，所述第二试剂由以下组成：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L；

3)将所述第一试剂和所述第二试剂组装成试剂盒；

4)任选地，还包含提供选自以下的任一项或组合：质控品、校准品、使用说明书。

5.一种用于提高谷草转氨酶检测试剂的稳定性的方法，包括步骤：

步骤1)按照以下成分，制备第一试剂：

步骤2)向步骤1)的所述第一试剂中加入：1g/L TritonX-100、2g/L BSA、0.5ml/L的Proclin950的组合。

6.根据权利要求5所述的方法，还包括：

步骤3)按照以下成分，制备第二试剂：

TRIS，pH6.5 100mmol/L

L-天门冬氨酸 720mmol/L

α-酮戊二酸 36mmol/L；

所述步骤3)在步骤1)之前或步骤2)之后。