CN106282147A - 胱硫醚β‑裂解修饰酶的制备方法及含胱硫醚β‑裂解修饰酶试剂盒 - Google Patents

胱硫醚β‑裂解修饰酶的制备方法及含胱硫醚β‑裂解修饰酶试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胱硫醚β‑裂解酶的修饰方法和含有该修饰酶的试剂盒。该方法包括如下步骤：S1：去除胱硫醚β‑裂解酶功能性氨基酸链中的Cys的氨基酸侧链的巯基，得到胱硫醚β‑裂解酶非功能性氨基酸链；S2：切除所述胱硫醚β‑裂解酶非功能性氨基酸链中的12个氨基酸，完成修饰。该试剂盒包括试剂R1和试剂R2。本发明可使试剂盒的开封稳定性达到35天，稳定性大大提高。

Description

胱硫醚β-裂解修饰酶的制备方法及含胱硫醚β-裂解修饰酶试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种胱硫醚β-裂解修饰酶的制备方法及含胱硫醚β-裂解修饰酶试剂盒，属于酶技术领域。
背景技术
胱硫醚β-裂解酶可以催化L-胱硫醚生成同型半胱氨酸和丙酮酸，是循环法检测同型半胱氨酸中重要的酶之一。
同型半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，在旁链部份硫醇基(-SH)前包含一个额外的亚甲基(-CH2-)。
1969年Mccμlly从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现，其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化(AS)的病理表现，由此提出高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHCY)可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。此后，各国学者对HCY与心脑血管疾病的相关关系做了大量研究。研究结果表明，Hcy可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。
血清内同型半胱氨酸的高水平是心血管疾病及中风的风险因素，是这种疾病的标记。
同型半胱氨酸循环检测法的原理为：HCY在胱硫醚β-合酶(CBS)催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚(CYS)。L-胱硫醚(CYS)在胱硫醚β-裂解酶(CBL)催化下生成HCY、丙酮酸和NH3。该循环反应生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下，引起β-NADH转化为β-NAD+，340nm处吸光度变化与样品中HCY浓度成正比。此反应中，胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂解酶为的性能最为关键。然而这些年，对于胱硫醚β-合酶的研究已经越来越深入，胱硫醚β-合酶的表达纯化技术也已较为完善，而对于胱硫醚β-裂解酶的研究还相当有限，使得胱硫醚β-裂解酶的稳定性有限，导致同型半胱氨酸检测试剂盒稳定性的不佳。
目前，国内普遍的HCY检测试剂盒的开封稳定性为14～21天，而进口试剂的开封稳定性可达到28～30天。主要差异便在于胱硫醚β-裂解酶在试剂中的稳定性。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种胱硫醚β-裂解酶的修饰方法和含该修饰酶的试剂盒。本发明提供一种胱硫醚β-裂解酶的修饰方法，同时利用该方法修饰的胱硫醚β-裂解酶，发明了一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒。该试剂盒准确度好、稳定性佳，测定结果准确可靠。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种对胱硫醚β-裂解酶进行修饰的方法，其包括如下步骤：
S1：去除胱硫醚β-裂解酶功能性氨基酸链中的Cys的氨基酸侧链的巯基，得到胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链；
S2：切除所述胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链中的12个氨基酸，完成修饰。
作为优选方案，步骤S1中所用的去除试剂为N-(1-芘)马来酰亚胺、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇甲醚马来酰亚胺中的一种或几种的混合。
作为优选方案，步骤S2中所用的切除试剂为弹性蛋白酶。
第二方面，本发明提供了一种可由前述的方法得到的胱硫醚β-裂解修饰酶。
第三方面，本发明还提供了一种含有前述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，所述试剂R2包含有按下列浓度计的各组分：
作为优选方案，所述试剂R1包含有按下列浓度计的各组分：
作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液均为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种；试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH均为6.0～8.0。
作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的表面活性剂均为吐温20、吐温80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。
作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA类中的一种。
作为优选方案，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠或proclin系列防腐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、胱硫醚β-裂解酶因为功能性氨基酸链中含有Cys，侧链含有-SH。在溶液中会自发形成二硫键，导致功能性氨基酸链的空间构象发生变化，酶活力丧失，故稳定性不佳。使用本发明中的修饰剂修饰后，去除了-SH，并且对酶本身活力没有明显的影响，从而提高了胱硫醚β-裂解酶在溶液中的稳定性。
2、胱硫醚β-裂解酶的非功能性氨基酸链很长，受到酶空间构象的影响，功能性氨基酸链与底物结合往往不够充分，导致酶活力受到影响，正常反应条件下酶与L-胱硫醚结合的Km值为2mmol/L。经过弹性蛋白酶的水解，我们可以去除非功能性氨基酸链末端的12个氨基酸。使得酶空间构象发生改变。大大提高了反应条件下酶的活力。修饰后的酶在正常反应条件下酶与L-胱硫醚结合的Km值可达到6mmol/L，活力提高了很多。
3、通常的胱硫醚β-裂解酶的最适反应PH值为8.0，而胱硫醚β-合酶的最适反应PH值为8.4～9.0。最适反应PH的差异导致在正常的反应条件下，不能使得2个酶都最高效的得到利用。而使用本发明方法修饰后的胱硫醚β-裂解酶，因为酶构象的改变，酶的最适反应PH变化为8.6。这样可以使得在正常的反应条件下，2个酶都达到他们最佳的反应条件。
4、使用本发明修饰后的胱硫醚β-裂解酶因为不会自身之间发生二硫键的反应，所以试剂中不需要加入硫醇类还原剂。试剂中含有多个的酶，硫醇类还原剂可能会和其他酶产生反应，导致试剂盒性能的下降。使用本发明方法修饰的胱硫醚β-裂解酶的同型 半管氨酸试剂盒，可以避免这个问题，使得试剂盒的检测结果更为准确，稳定性更强。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明试剂校准曲线图；
图2为本发明试剂和日本旭化成公司试剂血清相关性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种胱硫醚β-裂解酶的修饰方法，包括如下步骤：
1、胱硫醚β-裂解酶功能性氨基酸链的修饰：将胱硫醚β-裂解酶与N-(1-芘)马来酰亚胺进行连接，胱硫醚β-裂解酶侧链中的-SH基团被马来酰亚胺基团取代。
2、胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链的修饰：将步骤1中修饰后的胱硫醚β-裂解酶与弹性蛋白酶进行水解，弹性蛋白酶与非功能性氨基酸链中Lys的C端发生反应，水解去除Lys之后的12个氨基酸。
实施例2
本实施例提供一种含使用本发明方法修饰后的胱硫醚β-裂解酶的检测试剂盒，组成如下：
试剂R1各组分及浓度为：
试剂R2各组分及浓度为：
本实施例描述的HCY检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：速率法，即试剂R1；R2的用量分别为250μl和25μl，样本量16.5μl；250μl试剂R1加入16.5μl样本于37℃下5min后加入25μlR2，延迟90秒开始读点，读数时间约120秒；检测波长分别主波长340nm，副波长405nm。
采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的HCY标准品的曲线，如图1所示。
表1
实施例3
检测试剂的相关性试验
本实验目的是检测本发明试剂和现有试剂的相关性。
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂A公司的HCY试剂，对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关性分析。测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(HCY的含量μmol/L)。分别采用本发明试剂和日本旭化成公司的HCY试剂，对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数进行测定，对测定值进行相关分析。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R2＝0.9974，回归方程为y＝0.997x+0.0649。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
此外，以上实验本试剂是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
实施例4
准确度试验
本实验目的是检测试剂在测试样本时的准确度。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、质控品。
操作步骤：测定质控样本10次，计算偏差系数。
表2显示，含使用本发明方法修饰的胱硫醚β-裂解酶的试剂盒，偏差均小于1％。比含未修饰的胱硫醚β-裂解酶的试剂盒的准确度偏差小了很多。同时从表中CV值可以看出试剂的重复性也很好。
表2
实施例5
稳定性试验
本实验目的是检测试剂的稳定性。
采用实验例1试剂、标准品、质控品。
操作步骤：
1.试剂盒在加热(37℃)条件下保存7天后，取出试剂盒测定各质控3次。
2.试剂盒开封后，2～8℃开盖保存，每隔一周测定质控，连续35天。
3.试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，每2个月取出试剂盒测定质控。
表3显示，试剂在加热(37℃)条件下保存7天后，检测的准确度仍然很好。
表4显示，试剂盒开封后，2～8℃开盖保存条件下，一个月内试剂准确度保持良好。
表5显示，试剂盒在冷藏(2～8℃)条件下，保存14个月后，试剂准确度保持良好。
从表3～5中结果可以看出本发明试剂稳定性良好，能长时间保存。适合临床要求。
表3 37℃加热7天的稳定性
低值质控 中值质控 高值质控
1 7.50 11.98 29.12
2 7.50 12.03 29.02
3 7.52 12.18 28.93
平均值 7.507 12.063 29.023
靶值 7.5 12 29
相对偏差 0.09％ 0.53％ 0.08％
表4 开封35天的稳定性
表5 冷藏14个月的稳定性
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特 定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种对胱硫醚β-裂解酶进行修饰的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：去除胱硫醚β-裂解酶功能性氨基酸链中的Cys的氨基酸侧链的巯基，得到胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链；
S2：切除所述胱硫醚β-裂解酶非功能性氨基酸链中的12个氨基酸，完成修饰。
2.如权利要求1所述的对胱硫醚β-裂解酶进行修饰的方法，其特征在于，步骤S1中所用的去除试剂为N-(1-芘)马来酰亚胺、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇甲醚马来酰亚胺中的一种或几种的混合。
3.如权利要求1所述的对胱硫醚β-裂解酶进行修饰的方法，其特征在于，步骤S2中所用的切除试剂为弹性蛋白酶。
4.一种可由权利要求1～3中任意一项所述的方法得到的胱硫醚β-裂解修饰酶。
5.一种含有权利要求4所述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R2包含有按下列浓度计的各组分：
6.如权利要求5所述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包含有按下列浓度计的各组分：
7.如权利要求5或6所述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液均为Good’s缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种或几种；试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH均为6.0～8.0。
8.如权利要求5或6所述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的表面活性剂均为吐温20、吐温80、曲拉通-100、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。
9.如权利要求5或6所述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的稳定剂均为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA类中的一种。
10.如权利要求5或6所述的胱硫醚β-裂解修饰酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠或proclin系列防腐剂。
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